黄芪甲苷抗肝癌作用及调控pSmad3C/L和Nrf2/HO-1信号通路的探究

作     者：李利利 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨雁

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：黄芪甲苷 肝癌 pSmad3C/L Nrf2/HO-1 

摘      要：背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是病死率较高的恶性肿瘤之一。HCC由各种复杂的危害因素引发,多形成于慢性肝病或肝硬化的基础上。目前,针对肝细胞癌的治疗有限,大多数患者总体预后较差。因此,仍需进一步探索更多针对HCC的防治策略。近年来,研究表明一些中药单体对癌细胞增殖、转移及癌组织血管生成具有显著的抑制作用,且具有无副作用及不良反应等优势。黄芪甲苷（Astragaloside IV,AS-IV）是中药黄芪的单体,在一些恶性肿瘤中表现出良好的抗癌作用。目前,仅有研究表明AS-IV对肝癌细胞和荷瘤小鼠具有一定的抑制作用。然而,AS-IV对DEN/CCl4/C2H5OH诱导的C57BL/6J小鼠肝癌发生发展的影响仍不明确。本课题组前期研究表明复方芪参在体内外通过调控p Smad3C/L通路抑制肝细胞癌进展,而AS-IV作为复方芪参的有效成分之一是否也通过调控p Smad3C/L通路发挥肝癌抑制作用仍有待探究。另外,有研究发现,AS-IV通过增加Nrf2的转录激活,并增强HO-1的表达减轻了对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝毒性。那么,AS-IV抗HCC作用是否涉及调控Nrf2/HO-1信号通路?带着这些疑问,本研究使用DEN/CCl4/C2H5OH诱导的C57BL/6J小鼠肝癌模型、TGF-b1刺激的人肝癌Hu H-7细胞,从体内、外角度观察AS-IV对HCC的影响,并对其作用机制进行探究。目的1.明确AS-IV对DEN/CCl4/C2H5OH诱导的C57BL/6J小鼠肝癌的影响,并探究AS-IV作用机制是否与调控p Smad3C/L及Nrf2/HO-1信号通路有关。2.明确AS-IV对TGF-b1刺激的Hu H-7细胞增殖、迁移、侵袭的影响,并探究AS-IV作用机制是否与调控p Smad3C/L及Nrf2/HO-1信号通路有关。方法***-IV对DEN/CCl4/C2H5OH诱导的C57BL/6J小鼠肝癌的影响及机制探究分组如下:对照组、模型组、AS-IV（20 mg/kg）组、AS-IV（40 mg/kg）组、AS-IV（80 mg/kg）组、Colchicine（0.1 mg/kg）组。除对照组外,其余组采用DEN/CCl4/C2H5OH联合诱导小鼠肝癌。AS-IV各剂量组和Colchicine组每天灌胃给予相应剂量的药物,其余组给予相应溶媒。于第20周末进行小鼠取材,收集小鼠血清和肝组织样本。用试剂盒检测ALT、AST、SOD、MDA、TGF-β1水平;HE染色察看组织病理学变化;Western blot检测GST-P1、AFP、TGF-β1、p Smad3C、p21、p Smad3L、c-Myc、Nrf2/p Nrf、HO-1蛋白水平;免疫荧光法检测p Smad3C/L的表达。***-IV对TGF-β1刺激的Hu H-7细胞增殖、迁移、侵袭的影响及机制探究分组如下:对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AS-IV（5μM）组、TGF-β1+AS-IV（10μM）组、TGF-β1+AS-IV（20μM）组。除对照组外,其余组采用TGF-β1（9或40 p M）刺激Hu H-7细胞。AS-IV各浓度组加入相应终浓度的药物处理24 h,其余组加入等体积溶媒。CCK-8法、细胞划痕法、Transwell小室法分别检测细胞增殖、迁移、侵袭能力;DCFH-DA法检测细胞内ROS水平;Western blot检测p Smad3C、p21、p Smad3L、c-Myc、Nrf2/p Nrf2、HO-1蛋白水平;细胞免疫荧光法检测p Smad3C、Nrf2的表达和分布。结果***-IV减缓DEN/CCl4/C2H5OH诱导的小鼠肝癌病理进程观察各组小鼠肝脏,模型组可见肿瘤病灶和结节斑块,AS-IV给药组肿瘤病灶和结节斑块数量有所减少。HE染色显示,模型组小鼠肝细胞排列紊乱,可见蓝染明显、大小不一的异型细胞核,大范围可见肝癌细胞病灶区;与模型组相比,AS-IV给药组肝组织病变程度有所改善。检测肝癌标志蛋白AFP、GST-P1发现,与对照组相比较,DEN/CCl4/C2H5OH诱导小鼠肝组织中AFP、GST-P1蛋白水平显著升高;而随着AS-IV给药剂量的增加,小鼠肝组织中AFP、GST-P1蛋白水平逐渐降低,进一步验证了AS-IV对小鼠肝癌的抑制作用。另外,肝功能指标（ALT、AST）和氧化应激损伤指标（SOD、MDA）检测结果表明,DEN/CCl4/C2H5OH诱导小鼠出现了显著的肝功能损伤和氧化应激损伤;而AS-IV给药后,小鼠肝功能损伤和氧化应激损伤程度逐渐得到减轻。***-IV调控p Smad3C/L通路相关蛋白减缓小鼠肝癌病理进程2.1 AS-IV降低肝癌小鼠血清和肝组织中TGF-β1水平通过EL