蛭龙活血通瘀胶囊通过NLRP3信号途径抗动脉粥样硬化的分子机制研究

作     者：刘孟楠 

作者单位：西南医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨思进

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：动脉粥样硬化 蛭龙活血通瘀胶囊 U937细胞 NLRP3炎症小体 细胞焦亡 

摘      要：目的:炎症反应贯穿动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发展的始终，AS发病机制的核心是炎症细胞与炎症因子之间的相互作用。细胞焦亡是细胞程序性死亡的一种方式，致炎因子通过诱导AS中的炎症细胞表达并释放炎症因子形成联级放大参与AS的形成，是AS病变的始动因素之一。本研究在体内实验部分通过构建高脂血症颈动脉粥样硬化家兔模型，探究蛭龙活血通瘀胶囊通过NLRP3途径对该模型疾病的影响及相关作用机制，以期为该药物防治心脑血管疾病的相关基础研究及临床应用提供依据;在体外实验部分以U937巨噬细胞为研究对象，观察不同浓度蛭龙活血通瘀胶囊成分对U937巨噬细胞焦亡模型细胞活力的影响，探讨药物对NLRP3炎症小体及相关蛋白表达的的影响，通过质粒转染探讨蛭龙活血通瘀胶囊通过NLRP3信号途径抗AS的作用机制。 方法:1.体内实验部分:将50只新西兰大白兔随机分为对照组(Control)、模型组(Model)、蛭龙活血通瘀胶囊组(ZL)、阿托伐他汀钙组(Atorvastatin)、蛭龙活血通瘀胶囊+阿托伐他汀钙组(ZL+Atorvastatin)，每组10只，适应性喂养一周后除Control组外均行颈动脉空气干燥术，并予高脂饲料饲喂养（96％的普通饲料、2％的胆固醇、2％的猪油），Control组予普通饲料喂养。术后开始给药，蛭龙活血通瘀胶囊剂量为3.12g/kg/d，阿托伐他汀钙片0.51mg/kg/d，在实验第5周末处死家兔并取血清及颈动脉组织，检测血脂，ELISA实验检测血清IL-1β、NF-κB及IL-18蛋白表达，HE染色、油红O染色、NLRP3免疫组化观察颈动脉组织病理学变化，免疫印迹实验检测p-NF-κB、NF-κB、NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18、IL-18蛋白质表达。 2.体外实验部分:利用PMA将U937单核细胞诱导为巨噬细胞，LPS+ATP激活NLRP3炎症小体建立细胞焦亡模型;CCK-8法筛选超滤后蛭龙活血通瘀胶囊成分对U937巨噬细胞活力值影响最适宜的高、中、低剂量用药浓度;将实验分为对照组(Control)、焦亡诱导组(LPS+ATP)及蛭龙活血通瘀胶囊ZL（3μg/mL，10μg/mL，30μg/mL）用药组，处理U937巨噬细胞24h后，流式细胞术检测各组细胞焦亡率，运用免疫印迹法测定各组细胞裂解物和培养上清液中Gsdmd-N、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达水平;高质粒转染NLRP3蛋白在细胞中的表达，流式细胞术及免疫印迹法检测蛭龙活血通瘀胶囊成分对转染后U937巨噬细胞抑制NLRP3蛋白表达的水平。 结果:1.体内实验部分:与Control组比较，Model组血脂各项指标显著增高(P0.01)，表明造模成功;与Model组比较，各用药组的血脂各项指标有所改善，差异具有统计学意义(P0.05或P0.01);ELISA实验结果显示，与Model组比较，ZL组，Atorvastatin组和ZL+Atorvastatin组的血清IL-1β、NF-κB及IL-18蛋白表达均显著下降(P0.05或P0.01);HE染色提示Model组中颈动脉组织细胞显著增生，可见由大量泡沫细胞构成的脂质斑块，斑块内有炎症细胞浸润，治疗后炎症细胞减少，其中ZL+Atorvastatin组效果最好;油红染色提示Control组未见红染的脂质条纹及斑块，Model组中有大量的红染斑块，经治疗后，ZL组，Atorvastatin组和ZL+Atorvastatin组红染斑块减少，其中ZL+Atorvastatin组症状最轻;NLRP3免疫组化提示模型组颈动脉病变组织中有大量NLRP3阳性表达，比对照组中显著增多;经治疗后，ZL组，Atorvastatin组和ZL+Atorvastatin组NLRP3阳性表达减少，其中ZL+Atorvastatin组NLRP3阳性表达最少;在免疫印迹实验结果显示，与Model组比较，ZL组，Atorvastatin组和ZL+Atorvastatin组中p-NF-κB，NLRP3，Caspase-1，pro-IL-1β，IL-1β，pro-IL-18和IL-18蛋白水平均显著下降(P0.05或P0.01)。 2.体外实验部分:流式细胞检测提示，与Control组比较，经过ZL(3μg/mL，10μg/mL，30μg/mL)治疗U937巨噬细胞细胞焦亡模型后，焦亡率下降，差异有显著性(P0.05，P0.01，P0.01);免疫印迹实验提示，与Control组相比，焦亡诱导组Gsdmd-N、IL-1β、Caspase-1、ASC、NlLRP3表达水平上升，差异有显著性(P0.