生长素调控桃砧木‘GF 677’不定根形成的生理与分子机制

作     者：郝兰兰 

作者单位：甘肃农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王鸿

授予年度：2024年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：桃砧木 不定根 转录组 生物信息 功能验证 

摘      要：我国桃砧木年消耗量近亿株,在“十四五期间,老桃园正处于更新换代高峰期,急需大量无性系砧木来满足生产需求。目前国内对桃砧木不定根形成的机理尚不明确,对后续桃砧木生产上的应用受到限制。而桃砧木‘GF 677’亲合性好,基因型一致,抗重茬。本研究以‘GF 677’为试验材料,设置不同浓度激素CK（清水对照）、T1（160 mg/L IBA+160 mg/L NAA）、T2（200 mg/L IBA+120 mg/L NAA）、T3（240 mg/L IBA+80 mg/L NAA）、T4（280 mg/L IBA+40 mg/L NAA）以处理插穗基部,扦插后取0 d、7 d、14 d、21 d和28 d的韧皮部进行各项生理指标测定,进而确定最佳的扦插激素浓度组合,分析其生根的生理机制。此外,开展最佳浓度的转录组学研究,筛选主要代谢通路中的关键差异基因并通过荧光定量（q RT-PCR）再次验证其表达水平,筛选出PpSAT1和PpSAT4基因为不定根形成的关键基因,并对其进行克隆及功能验证。主要结果如下: 1.T2（200mg/L IBA+120mg/L NAA）处理下显著提高了插穗IAA、GA3和ZR的含量,激发SOD、POD、PPO和IAAO活性的同时,促进了可溶性糖和可溶性蛋白的积累,从而促进了不定根的生长发育。与其他处理相比,T2处理的生根率、平均根长、根数和根粗最优,综合排名为T2T1T3T4CK。 2.转录组学分析表明,主要富集在半胱氨酸和蛋氨酸、精氨酸和脯氨酸、糖酵解/糖异生代谢途径。分析其代谢通路中的差异基因,结果表明:丝氨酸乙酰转移酶（serine acetyltransferase,SAT1、SAT4）、果糖-1,6-二磷酸酶（fructose-1,6-bisphosphatase,FBPase）、鸟氨酸氨基转移酶（ornithine aminotransferase,OAT）、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶原酶（S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme,SAM）、和乙酰丝氨酸裂解酶(O-acetylserine（thiol）lyase,OAS)等相关基因在不定根形成中起重要作用。 3.桃丝氨酸乙酰转移酶（SAT）基因家族生物信息学分析表明:共有4个基因,氨基酸介于287-395 aa,分子量介于30.49-43.04 k D,等电点在6.00-8.30之间。系统进化分析表明:桃、拟南芥、葡萄和水稻的SATs基因在每个分支中具有较高的同源性和密切的进化关系。顺势作用元件分析表明,存在光响应、MeJA响应、赤霉素响应、生长素响应、脱落酸响应、水杨酸响应和干旱诱导等响应元件。 ***-PCR分析结果显示,PpSAT1和PpSAT4在各时期的表达量最显著,与转录组学相一致。对此,将PpSAT1和PpSAT4进行克隆,其片段大小分别为1188 bp和864 bp。系统进化树显示:PpSAT1与欧洲甜樱桃亲缘关系最近;PpSAT4与扁桃亲缘关系最近。氨基酸序列比对发现,PpSAT1和PpSAT4蛋白序列均相比其他物种的蛋白序列在N端存在一定程度的差异,而在C端较为保守。 5.对PpSAT1和PpSAT4基因构建过表达载体PpSAT1/PpSAT4-CAM-FLAG,遗传转化桃近缘种李子和异源拟南芥。过表达李子和拟南芥的生长状况显著优于野生型,其根系各项指数以及POD和SOD活性也显著高于野生型,说明两个基因均可以促进不定根的形成。