运动和饮食调节提高Lipophagy改善NAFLD作用及机制研究

作     者：高宇 

作者单位：空军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王枫

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：非酒精性脂肪肝 高脂膳食 Lipophagy改善 饮食调节 发病机制 

摘      要：背景 非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD)是全球重大公共卫生事件，严重影响了约10亿人口的身体健康。至今尚未明确其具体的发病机制及临床有效治疗药物，因此深入探讨NAFLD的发病机理，寻找可能的潜在干预治疗靶点，将会为临床有效防治NAFLD提供科学依据。 自噬是一种普遍存在的生理过程，是机体细胞为适应恶劣环境及对抗各种应激做出的一种自我保护反应，自噬也参与了众多疾病的发生发展。最新研究进展表明代谢性疾病包括NAFLD等脂肪堆积过程中的脂代谢紊乱与自噬障碍密切相关，激活自噬能够改善脂质代谢紊乱。Lipophagy是一种选择特异性自噬，是脂滴(Lipid droplets，LDs)和胆固醇(Cholesterol，CHOL)被自噬体选择性吞噬并传递给溶酶体，融合后在酸性脂肪酶和水解酶相互作用下将LDs分解为甘油和游离脂肪酸(Free fatty acids，FFA)的一种细胞内降解脂肪的途径，以此去除多余的脂质来保护细胞免受脂毒性侵害。已有研究表明，Lipophagy能有效降解LDs来调节细胞内的脂代谢水平，改善肥胖症的严重程度。但Lipophagy是否能够作为防治NAFLD的一个潜在干预靶点仍不清楚。运动和饮食调节是代谢性相关疾病的常用干预手段，那么它们是否能够通过调控Lipophagy来改善NAFLD，其内在的分子机制如何，以及二者的干预机制是否有交集等仍不清楚。 为了验证上述这些问题，我们体内采用由高脂膳食(High fat diet，HFD)诱导大鼠的NAFLD模型和体外采用的FFA诱导的细胞脂肪沉积模型，从对Lipophagy的调控机制角度探讨运动和饮食调节对HFD引起的NAFLD以及肝脏衰老的改善作用及机制，为将来临床制定NAFLD及其引起的相关疾病的防治策略提供实验室依据。 目的 通过HFD诱导的大鼠NAFLD模型及FFA诱导的细胞脂肪沉积模型，研究运动和饮食调节对HFD引起NAFLD及肝脏衰老的保护作用，并阐明Lipophagy及其上游的信号通路在此过程中的作用和机制。 方法 ***大鼠给予HFD3个月建立动物NAFLD模型，建模成功后，设对照组，将动物分为Chow、HFD、HFD+Exercise、HFD-Chow和HFD-Chow+Exercise五组，其中HFD-Chow为由高脂饲料改为常规普通饲料，Exercise为按照设计完成规定的运动，继续喂养2个月。 2．对肝组织切片进行HE和油红O染色以观察病理学改变及LDs累积情况。 3．采用试剂盒检测肝组织切片SA-β-gal染色及酶活性。 4．采用试剂盒检测肝组织甘油三酯(Triglyceride ，TG)、脂褐素、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平。 5．采用WesternBlot方法检测肝脏中自噬分子LC3、Lamp1、Lamp2、p62、Atg5、Atg7、Beclin1蛋白水平;Lipophagy标志物溶酶体PLIN2蛋白水平;调控自噬通路Akt、mTOR、AMPK、ULK1及其相应的磷酸化蛋白水平;以及肝脏和肌肉中成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21，FGF21)蛋白水平。 6．采用ELISA试剂盒检测血清中FGF21和Irisin的水平。 7．采用Q-PCR方法检测肝脏和肌肉中FGF21mRNA水平。 8．采用HepG2细胞和WI-38细胞，建立FFA处理诱导脂肪沉积细胞模型，设对照组给予外源性FGF21以及AMPK分子特异性抑制剂Dorsomorphin，观察FGF21和AMPK信号通路在调控FFA诱导的细胞脂肪沉积的作用机制。 9．采用GFP-RFP-LC3腺病毒感染细胞荧光成像检测自噬通量。 10．采用稳定转染的LC3和LDs特异性染料Bodipy荧光双标成像方法检测Lipophagy。 11．采用LDs特异性染料Bodipy标记荧光成像方法检测LDs累积。 12．同动物实验相类似，采用相应试剂盒检测TG、脂褐素、MDA以及SA-β-gal染色及酶活性。 13．采用WesternBlot方法检测细胞中自噬代表性标志分子LC3、上游关键分子AMPK和ULK1及其磷酸化水平。 结果 1．运动和饮食调节均可以有效改善HFD引起的NAFLD，联合效果更好。 肝组织切片HE染色和油红O染色显示HFD可以显著提高肝脏中LDs的累积，TG水平也相应显著提高。运动和饮食调节均能够有效抑制HFD引发的LDs累积和TG水平的升高，二者联合作用效果更明显。 2．运动和饮食调节均可以显著改善HFD引起的自噬及Lipophagy的抑制，饮食调节主要通过调节Akt/mTOR/ULK1(Ser757)信号通路发