快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA 的方法

专利申请号：CN201510019638.4

公 开 号：CN104560957A

发 明 人：董晓 宋亚峰 党书毅 周明 王俊峰 段班燕 熊胜梅 

代 理 人：王文君

代理机构：11002 北京路浩知识产权代理有限公司

专利类型：发明申请

申 请 日：20150429

公 开 日：20150114

专利主分类号：C12N15/10(20060101)

关 键 词：大鼠 分段扩增 两对引物 酶切位点 逆转录 克隆 限制性内切酶酶切 混合 编码序列 操作难度 定向克隆 片段连接 全长cDNA 随机引物 序列设计 选择分段 扩增 两个 位点 选取 连接 克服 选择 正确 进行 

摘      要：本发明提供了快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的方法。分别用oligo(dT)和随机引物逆转录大鼠mRNA，将cDNA产物混合；在目的cDNA片段上选择分段扩增的酶切位点，在此位点前后选取序列设计两对引物，分别用两对引物对混合的cDNA产物进行分段扩增，两片段3’端加A后分别与不含分段扩增的酶切位点的T载体连接，选择克隆方向正确的载体，将含有两个cDNA片段的载体分别用相应的限制性内切酶酶切后通过定向克隆的方法将两片段连接，获得全长大鼠5-脂肪氧合酶cDNA。本发明方法克服了mRNA表达量低时难以获得cDNA的情况，大大降低了直接逆转录获得全长cDNA编码序列的操作难度。