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天然化合物oblongfolin C调节内质网应激和miRNA诱导细胞死亡

天然化合物oblongfolin C调节内质网应激和miRNA诱导细胞死亡

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：王晓宇劳远至吴曼徐宏喜上海中医药大学中药学院上海201203 中药创新药物研发上海高校工程研究中心上海201203

目的：中药藤黄和同属植物中所含的藤黄酸及其类似物具有显著的抗肿瘤活性,其抗肿瘤机制的多样性也越来越受到关注.我们前期报道了云南藤黄来源的天然化合物oblongfolinC 具有显著的抗肿瘤活性的作用,但具体作用机制尚未明确,本课题将...

目的：中药藤黄和同属植物中所含的藤黄酸及其类似物具有显著的抗肿瘤活性,其抗肿瘤机制的多样性也越来越受到关注.我们前期报道了云南藤黄来源的天然化合物oblongfolinC 具有显著的抗肿瘤活性的作用,但具体作用机制尚未明确,本课题将深入研究oblongfolinC 在抑制人肠肿瘤中的作用机制.方法：(1)应用Ettan 2D 蛋白质双向电泳系统,对oblongifolin C 处理前后的细胞裂解液进行双向电泳,银染,扫描及数据处理,选取表达量差异超过3 倍的蛋白质点,进行质谱分析,运用二维蛋白质结合质谱分析找到oblongifolin C 的作用与内质网应激相关;(2)用荧光实时定量PCR 和western blot 进一步检验内质网应激表达量和蛋白质表达量;(3)用电子显微镜观察oblongifolin C 处理后内质网的亚结构;(4)用ER tracker 染色观察oblongifolin C 处理后内质网的变化;(5)用荧光实时定量PCR 检测细胞内miRNA 的变化.结果：为了对oblongifolin C 进行深入的机制研究,我们运用蛋白质组技术检测oblongifolin C 24 小时处理前后细胞蛋白质组的变化,二维蛋白质结合质谱显示oblongifolinC 调节了40 个蛋白质的表达量,IPA 软件分析发现oblongifolin C 诱导细胞死亡与内质网应激关系最为密切(p value 4.57E-04).我们进一步用荧光实时定量PCR 和western blot 进行验证,发现oblongifolin C 可以上调BIP,HSP90b1,CHOP,HYOU1,sXBP1 等未折叠蛋白相关蛋白,提示oblongifolin C 通过诱导内质网应激诱导细胞死亡.ER tracker 和电子显微镜结果也显示oblongifolin C 可以增加内质网应激.进一步研究发现,oblongifolin C 可以上调miRNA181a 和miRNA 1291 的表达,使用miRNA 181a 和miRNA 1291 的抑制剂可以有效逆转oblongifolin C 诱导的细胞死亡和内质网应激,提示oblongifolin C 通过上调miRNA 181a 和miRNA 1291,诱导内质网应激和细胞死亡.结论：云南藤黄来源的化合物oblongifolin C 可以通过上调miRNA 181a 和miRNA 1291,诱导内质网应激和细胞死亡,为抗肿瘤天然化合物的创新性研究提供理论基础.本研究还首次发现miRNA 181a 和miRNA 1291 可能在人肠癌细胞中诱导细胞死亡中起到重要的作用.

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天麻酚性成分H体外抗血小板聚集及体内抗血栓形成作用研究

天麻酚性成分H体外抗血小板聚集及体内抗血栓形成作用研究

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：申婷向彬肖纯李秀芳云南中医学院云南昆明650500

目的：近年来的研究认为,血小板异常活化和聚集在脑血栓形成及缺血性脑卒中发生发展过程中扮演着重要的角色,抗血小板治疗被推荐用于降低复发性脑卒中的风险.目前临床常用的抗血小板药物如阿司匹林、氯吡格雷由于具有“药物抵抗”及出...

目的：近年来的研究认为,血小板异常活化和聚集在脑血栓形成及缺血性脑卒中发生发展过程中扮演着重要的角色,抗血小板治疗被推荐用于降低复发性脑卒中的风险.目前临床常用的抗血小板药物如阿司匹林、氯吡格雷由于具有“药物抵抗”及出血风险,应用受到了一定的限制,因此,寻找安全有效的抗血小板药物是缺血性脑血管病防治研究的重点.课题组前期研究发现天麻乙酸乙酯提取物具有显著抗血小板活性,从该提取物中分离得到的酚性成分H 在初步研究中显示了一定的抗血小板活性,本研究对其体外抗血小板聚集及体内抗血栓形成作用进行了研究.方法：(1)天麻酚性成分H 体外抗血小板聚集的作用研究：采用Bron’s 比浊法,以二磷酸腺苷(ADP)和花生四烯酸(AA)为诱导剂,对天麻酚性成分H(18.75-300μmol/L)体外抗血小板聚集作用进行考察.(2)采用大鼠动-静脉旁路血栓模型及尾静脉注射角叉菜胶诱发小鼠尾部血栓形成模型对天麻酚性成分H 的体内抗血栓形成作用进行考察.结果：(1)天麻酚性成分H 对ADP 和AA 诱导的家兔体外血小板聚集均有抑制作用,对ADP 诱导的血小板聚集IC50 为166.8μmol/L,95％可信限为137.0-203.18μmol/L;对AA诱导的血小板聚集IC50 为0.03μmol/L,95％可信限为0.0002-4.71μmol/L.(2)天麻酚性成分H 具有显著体内抗血栓形成作用,5m/kg 可显著抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成,抑制率达68.12％,7m/kg 时可明显抑制尾静脉注射角叉菜胶后24h、48h、72h 小鼠尾部血栓形成,使黑尾长度明显缩短.结论：(1)天麻酚性成分H 具有显著体外抗血小板聚集作用,其可同时对抗ADP 及AA 诱导的家兔体外血小板聚集,以对AA 途径的血小板聚集作用最强;(2)天麻酚性成分H 具有较强的体内抗血栓形成作用.

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岩藻黄素对兔耳痤疮实验模型的干预效果

岩藻黄素对兔耳痤疮实验模型的干预效果

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：卢旭许光辉廖应养黄亦琦福建中医药大学药学院福州350122 厦门市医药研究所天然药物研发中心厦门361008 厦门市医药研究所天然药物研发中心厦门361008

目的根据 Kligman 造模方法,建立兔耳痤疮动物实验模型,用不同剂量的岩藻黄素(10％纯度,甘油为溶质)外涂,观察其疗效.方法 1.实验于厦门市医药研究所动物实验室完成.选用健康成年家兔27 只,1.8-2.1Kg,普通级,雄性,购自上海斯莱克实验...

目的根据 Kligman 造模方法,建立兔耳痤疮动物实验模型,用不同剂量的岩藻黄素(10％纯度,甘油为溶质)外涂,观察其疗效.方法 1.实验于厦门市医药研究所动物实验室完成.选用健康成年家兔27 只,1.8-2.1Kg,普通级,雄性,购自上海斯莱克实验动物有限公司.2.建立Kligman 兔耳痤疮动物模型：均在每只家兔左耳内侧面耳导管开口处约2cm×2cm 范围,每日涂2％煤焦油溶液1 次,每次0.5mL,连续14d.并将随机抽取2 只,肉眼观察和病理组织学分析,验证造模成功与否,不成功依据上述方法,继续造模.余下24 只家兔随机分为4 组,每组6 只,正常组、模型对照组、2％岩藻黄素组和4％岩藻黄素组.3.干预：各组均在造模部位2cm×2cm 范围涂抹对应药物0.5g,每日1 次,连续涂抹两周,每次于给药6h 后使用温水洗净.正常组和模型对照组均给予生理盐水0.5mL 涂抹于造模处;2％岩藻黄素组为2％的岩藻黄素涂抹于造模处;4％岩藻黄素组为4％的岩藻黄素涂抹于造模处,.4.指标检测：①一般情况：每天观察家兔的精神状态、行为活动、毛色、摄食、饮水、粪便等情况,每5d 称量体重一次.②使用8mm 打孔器在涂药部位打孔制备耳片,取造模部位耳片用10％甲醛固定后,石蜡包埋切片,HE 染色后待病理组织学分析.结果 ①正常组：肉眼观察：表皮薄白,光下透明,毛孔排列整齐,同一部位毛孔大小均匀;毛孔无堵塞物.病例组织学分析：真皮层薄,均匀;真皮结构交接清晰.②模型对照组：继续多饲养1 周后,肉眼观察：红肿消失;毛孔增大,部分毛囊仍有黑色角栓,皮肤表面粗糙,增厚,部分模型有瘢痕;组织学分析：皮肤角质化过度,颗粒层、棘层肥厚,真皮内仍见较多的炎症细胞浸润,毛囊口及漏斗部仍见角化物质堆积,毛囊漏斗部破裂,甚至扩大如壶状,皮肤结构破坏严重、分界模糊.③涂抹岩藻黄素组1 周后,肉眼观察：无红肿;局部毛囊角栓减少;4％岩藻黄素组皮肤表面基本正常;有淡黄色的色素沉淀.组织学分析：表皮增厚明显减轻,真皮炎症细胞明显减少,但仍见毛囊口轻度扩张,皮肤真皮结构分界清晰,但仍未完全齐整.结论褐藻(海带)提取物岩藻黄素对兔耳痤疮实验模型的干预具有积极的作用,能一定程度上减少皮肤角质化及瘢痕的形成、抑制炎症的发生,可能呈现剂量相关性.

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栀子环烯醚帖部位的快速持久抗抑郁作用及其对PKA-CREB信号通路激活的依赖性

栀子环烯醚帖部位的快速持久抗抑郁作用及其对PKA-CREB信号通路激...

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：任荔张海楼陶伟伟陈茵邹之璐沈琴琴郭小燕陈刚南京中医药大学基础医学院转化系统生物学与神经科学研究中心南京中医药大学中医脑病重点实验室南京210023

目的：主流抗抑郁西药具有起效缓慢的缺点，目前研究较多的快速抗抑郁药物氯胺酮因成瘾性、肝毒性和神经毒性等副作用在临床应用中受到限制.近来本实验室的基础及临床研究发现，中药越鞠丸具有快速起效治疗抑郁症的特性，而栀子为其中...

目的：主流抗抑郁西药具有起效缓慢的缺点，目前研究较多的快速抗抑郁药物氯胺酮因成瘾性、肝毒性和神经毒性等副作用在临床应用中受到限制.近来本实验室的基础及临床研究发现，中药越鞠丸具有快速起效治疗抑郁症的特性，而栀子为其中的关键成分.本研究旨在探索栀子环烯醚帖部位是否具备快速起效抗抑郁作用及其相关机制.方法：1.有效剂量初筛实验(初始起效时间点实验和药效持续时间实验)：采用给药后24 小时进行小鼠悬尾实验、强迫游泳实验和新奇抑制摄食实验，从高(200mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)三个剂量来初步筛选具有快速抗抑郁潜力的栀子环烯醚帖部位.给药2 小时及给药30 分钟后进行悬尾实验以测试有效剂量栀子环烯醚萜部位的起效时间.给药3 天、5 天、7 天组的小鼠分别进行新奇抑制摄食实验、悬尾实验、强迫游泳实验，给药10 天及14 天的小鼠进行新奇抑制摄食实验.2.慢性模型验证实验：给予慢性温和刺激造模组小鼠有效剂量栀子环烯醚帖24 小时后依次进行开场实验、糖偏好测试、新奇抑制摄食实验、悬尾实验、强迫游泳实验，给药3 天、5 天、7 天组的小鼠分别进行新奇抑制摄食实验、悬尾实验、强迫游泳实验，给药10 天及14 天的小鼠进行新奇抑制摄食实验.3.分子实验：Western blot 实验检测30 分钟、2 小时及24 小时小鼠海马区BDNF 的表达.2 小时及24 小时小鼠海马区PKA、p-CREB 及CREB 的表达.4.阻断剂实验：测试组小鼠腹腔注射PKA 阻断剂H89 后给予有效剂量的栀子环烯醚帖，分别于给药后30 分钟、2 小时、24 小时进行小鼠悬尾实验.结果：1.有效剂量初筛实验中，给予中剂量环烯醚帖(栀子快速抗抑郁等效剂量)30分钟后显著降低了小鼠悬尾实验的不动时间.栀子环烯醚帖的抗抑郁作用能够在小鼠悬尾、强迫游泳模型上持续到第7 天，在新奇抑制摄食模型条件下能够至少持续到第14 天;2.与越鞠丸类似，在慢性不可预知的温和刺激模型中，环烯醚萜单次给药24 小时后，逆转了造模动物糖偏好的降低，悬尾及强迫游泳测试中不动时间的延长，以及新奇抑制摄食实验中单位摄食量的降低和摄食潜伏时间的延长等抑郁-焦虑样行为.其在慢性模型上单次给药的抗抑郁作用同样能够持续至少14 天;3.分子研究结果提示栀子环烯醚萜单次给药24 小时后海马PKA-CREB 信号通路的激活，而该时间点的抗抑郁作用不依赖于BDNF 的激活;4.对PKA-CREB 信号通路的阻断逆转了其24 小时的抗抑郁效应.结论：栀子环烯醚萜部位可能为栀子和越鞠丸快速持久抗抑郁效应中的关键药物部位.与越鞠丸类似，该部位的快速持久抗抑郁作用依赖于PKA-CREB 信号通路的激活.与越鞠丸不同的是，该部位早期抗抑郁作用不依赖于BDNF 快速表达的升高.

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木瓜三萜抗吲哚美辛诱导RGM-1细胞凋亡的作用

木瓜三萜抗吲哚美辛诱导RGM-1细胞凋亡的作用

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：覃慧林张永峰贺海波唐红波刘呈雄汪鋆植颜为红罗华天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)/湖北省土家族医药研究所宜昌443002湖北首都医科大学附属北京妇产医院北京100026

目的：木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai 的干燥近成熟果实,以“百益之果”著称,具有舒筋活络、和胃化湿的功效,用于湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、暑湿吐泻、转筋挛痛、脚气水肿等的治疗.尽管当前国内外对木...

目的：木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai 的干燥近成熟果实,以“百益之果”著称,具有舒筋活络、和胃化湿的功效,用于湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、暑湿吐泻、转筋挛痛、脚气水肿等的治疗.尽管当前国内外对木瓜的抗炎药理活性有广泛的研究报道,但鲜见有对消化系统相关的研究报道.本人前期研究发现其重要活性成分木瓜三萜显示出了较好的胃粘膜保护作用,为阐释皱皮木瓜既具有抗炎作用,又具有抗胃溃疡作用提供了依据,但具体机制仍有待进一步阐明.基于此本实验利用吲哚美辛诱导RGM-1细胞损伤模型,探讨木瓜三萜对吲哚美辛诱导RGM-1 细胞损伤的影响,探讨其可能的作用机制.方法：用吲哚美辛诱导RGM-1 细胞建立细胞损伤模型,MTT 法检测不同浓度木瓜三萜对RGM-1 细胞增殖、流式细胞术和Hoechst33258 染色分析木瓜三萜对吲哚美辛诱导细胞凋亡的影响,JC-1 染色法测定细胞线粒体跨膜电位水平,Caspase 试剂盒检测RGM-1 细胞中Caspase-9 和Caspase-3 的活性,Real-time PCR 检测RGM-1 细胞中TFF1、p53、Bcl-2 及BaxmRNA 表达,Western blot 检测RGM-1 细胞中TFF1 和p53 蛋白表达.结果：当木瓜三萜浓度低于100μg/mL 时,木瓜三萜对RGM-1 细胞的生长无明显的影响;当木瓜三萜浓度低于50μg/mL 时,木瓜三萜与吲哚美辛联用对RGM-1 细胞的生长有促进作用;木瓜三萜可显著增加吲哚美辛诱导RGM-1 细胞损伤的活性(P＜0.05,P＜0.01),升高线粒体膜电位,抑制细胞凋亡和改善细胞形态,上调TFF1 蛋白表达及TFF1、Bcl-2 mRNA表达和Bcl-2 与Bax 的比值,下调p53 蛋白表达及p53 和Bax mRNA 表达,降低Caspase-9及Caspase-3 活性(P＜0.05,P＜0.01).结论：木瓜三萜对吲哚美辛诱导RGM-1 细胞损伤的保护作用与其抑制RGM-1 细胞凋亡有关,其作用机可能与上调TFF1、Bcl-2 表达,下调p53、Bax、Caspase-3、Caspase-9 表达有关.本研究为木瓜中的主要活性组分木瓜三萜用于NSAIDs 的防治及具有抗炎同时又具有胃粘膜保护作用的新型抗炎药物的研发提供基础药理学依据.

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基于网络药理学的四逆散抗抑郁作用机制

基于网络药理学的四逆散抗抑郁作用机制

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：孙鹏魏盛武继彪山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室山东济南250355

目的：基于网络药理学方法对四逆散方剂进行研究,以期预测发现四逆散抗抑郁主要活性成分的作用靶点,探讨四逆散“多成分-多靶点-多通路”的作用机制.方法：(1)四逆散分子数据库构建：通过检索中国知网(http：//)及新加坡国立大学生物信...

目的：基于网络药理学方法对四逆散方剂进行研究,以期预测发现四逆散抗抑郁主要活性成分的作用靶点,探讨四逆散“多成分-多靶点-多通路”的作用机制.方法：(1)四逆散分子数据库构建：通过检索中国知网(http：//)及新加坡国立大学生物信息学和药物设计研究组的中药化学成分查询网站(http：//***/group/TCMsite/***)收集四逆散中相应的化学成分.(2)化学成分的相关信息的获：化合物的结构以及其他化学信息从PubChem 数据库获取(http：//***/).在这里我们下载对应分子sdf 格式2D 文件,组成分子数据库.对应分子的结构信息用来后续的分析.(3)化学成分的化学指纹的生成：根据在PUBCHEM 上获取的结构信息用Chemfp 程序来构建四逆散中所含药物化合物的指纹图谱.同时将Drugbank 中含有的小分子药物结构都生成相应的化学指纹图谱.(4)药物相似性网络的构建：运用Tanimoto 系数距离衡量两者之前的相似性.用每个药物作为定点,每一条边的权重用Tanimoto 系数表示.其中从四逆散中鉴别出的化学成分记为待查(Query),和Drugbank 中小分子药物一起构建网络.(5)人类蛋白质-蛋白质(靶点-靶点)相互作用网络的构建：通过OMIM 数据库构建人类蛋白质-蛋白质(靶点-靶点)相互作用靶标网络.(6)药物与相对应蛋白质相互作用网络的构建：Drugbank 数据库中录入了某些小分子药物和对应蛋白质靶点相互作用的网络.根据这个数据库供应的信息,构建出四逆散中药物成分和对应蛋白质相互作用的网络.(7)待查化学成分(Query)的网络分析：依据以上叙述的药物相似性网络(Drug similarity network)、人类蛋白质-蛋白质(靶点-靶点)相互作用网络(Humanproteins-protein(target-targets)interaction network)和药物—蛋白质相互作用(Drug - proteininteraction network)网络三种网络,将鉴别出的四逆散中的化学成分即待查(Query)和人类的蛋白质通过网络整合到一起.利用网络上待测和蛋白质的最短距离,我们能够找到待测最有可能作用的蛋白质靶点.(8)确定靶点的生理或病理作用：将靶点映射到相关的疾病数据库,如GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE 数据库,OMIM_DISEASE 数据库,得出所测靶点的相关疾病;将靶点映射到KEGG 数据库,找到作用靶点相关信号或代谢通路;将靶点映射到基因本体上(Gene ontology),找到靶点中的富集基因.结果：网络分析揭示四逆散中34 个主要成分通过调节突触传递,神经冲动传递,细胞信号转导等生物学过程以及对神经活性的配体-受体相互作用,氮代谢,氨基酸代谢等信号通路产生影响从而发挥抗抑郁作用的.结论：四逆散抗抑郁作用体现了中药多成分、多靶点、多途径的作用特点,该研究为深入阐释四逆散抗抑郁作用机制提供科学依据,为进一步抗抑郁新药研发提供研究基础.

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3-氢化松苓酸B诱导人胃癌HGC-27细胞程序性死亡的研究

3-氢化松苓酸B诱导人胃癌HGC-27细胞程序性死亡的研究

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：张盼闫喜明汪鋆植佘欣欣余海立贺海波李湜李莉娥天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)/湖北省土家族医药研究所湖北宜昌443002 宜昌人福药业有限公司湖北宜昌443002

目的：大白栓Trametes lactines(Berk)是一种多孔菌科栓菌属的大型真菌,生长在阔叶木材上,是一种土家族药用真菌,前期研究发现大白栓中主要化学成分为三萜类化合物3-氢化松苓酸B(TAB).文献报道TAB 能起到抑制凝血酶的活性,对多种肿瘤细...

目的：大白栓Trametes lactines(Berk)是一种多孔菌科栓菌属的大型真菌,生长在阔叶木材上,是一种土家族药用真菌,前期研究发现大白栓中主要化学成分为三萜类化合物3-氢化松苓酸B(TAB).文献报道TAB 能起到抑制凝血酶的活性,对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用,但对胃癌细胞HGC-27 具有更好的抑制作用.同时TAB 还能逆转P-gp 蛋白引起的耐药作用,且与化疗药物紫杉醇有药物协同作用.因此为进一步研究TAB 对肿瘤细胞增殖抑制的选择性及机制,探讨TAB 对人胃癌细胞HGC-27 程序性死亡可能的作用机制,为进一步利用TAB 提供依据.方法：MTT 法测定TAB(10、20、40μmol/L)处理HGC-27 和GES-1 细胞24h、48h 后的细胞活力并计算抑制率.使用流式细胞仪测定细胞TAB 对胃癌细胞HGC-27 细胞周期及凋亡的影响.使用吖啶橙染色及透射电子显微镜实验观察TAB 对HGC-27 细胞自噬的影响;Western blot 法检测自噬相关蛋白Beclin-1、CyclinD1、LC3 I、LC3 II 和P70S6K 表达的影响.结果：TAB 对HGC-27 细胞的增殖具有抑制作用,并呈明显的时间、剂量依赖性,并且对正常胃细胞GES-1 无细胞毒性.TAB(10、20、40μmol/L)处理HGC-27 细胞24h 后,可将细胞阻滞于G0/G1 期,但对细胞凋亡无明显影响.TAB(20μmol/L)处理HGC-27 细胞24h后,透射电镜观察细胞出现大量的自噬泡和自噬体,流式细胞仪检测细胞自噬比例随浓度增加而增高;TAB 浓度增加可促进LC3 I 向LC3 II 转化,并促进Beclin-1 和p21 的表达,抑制CyclinD1 的表达,增加P70S6K 的表达.结论：TAB 可使HGC-27 细胞自噬比例增加,自噬调控因子Beclin1 表达随3-氢化松苓酸B 剂量增加逐渐升高,TAB 可诱导HGC-27 细胞发生自噬性死亡,但是对细胞凋亡无明显影响.本研究为胃癌相关药物的研发提供药理研究基础.

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芒柄花素调控E-Cadherin的表达发挥抗过敏性疾病作用研究

芒柄花素调控E-Cadherin的表达发挥抗过敏性疾病作用研究

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：李恋曲王燕王晓钰陶羽包凯帆王璨沈丹丹洪敏南京中医药大学江苏南京210046

目的：随着过敏性疾病的发病率日渐增高,过敏性疾病已成为全球关注的问题.本课题组前期研究发现,玉屏风散含药血清中芒柄花素的含量较高,本文在前期研究的基础上,对芒柄花素的抗过敏作用机制进行研究.方法：(1)Th2 型ACD 模型的建立：BA...

目的：随着过敏性疾病的发病率日渐增高,过敏性疾病已成为全球关注的问题.本课题组前期研究发现,玉屏风散含药血清中芒柄花素的含量较高,本文在前期研究的基础上,对芒柄花素的抗过敏作用机制进行研究.方法：(1)Th2 型ACD 模型的建立：BALB/c 小鼠于第0 天在腹部刮毛,第二天、第三天在腹部无毛部位涂1.5％FITC,第六天用0.5％FITC 涂于小鼠右耳,左耳涂相同溶剂,24h 后,测定小鼠两耳厚度,称两耳重量,计算耳肿胀度,ELISA 检测2 型细胞因子,小鼠耳组织病理学检测炎细胞浸润情况.(2)小鼠ACD 诱导初期模型的建立：BALB/c 小鼠于第1 天及第2 天双耳分别涂布0.6％FITC 溶液致敏,24h 后取耳组织样本.电镜观察耳组织上皮细胞之间的紧密连接;免疫组化和western blot 检测E-Cadherin 蛋白的表达.(3)用Poly(I：C)刺激16HBE 细胞24h,免疫荧光和western blot 检测上皮细胞之间E-Cadherin 蛋白表达水平及分布,考察芒柄花素对E-Cadherin 的表达与分布的影响.结果：(1)芒柄花素可明显减轻小鼠ACD 模型的耳肿胀、局部炎细胞浸润、2 型细胞因子分泌等炎症症状.(2)芒柄花素对小鼠ACD 诱导初期模型的结果显示：电镜观察结果：正常小鼠耳组织上皮细胞间连接紧密,结构清晰,无明显间隙,同时可见桥粒连接相邻细胞膜,形成完整的上皮组织结构.经FITC 致敏后,上皮细胞间间隙明显增大,细胞间连接疏松,给予芒柄花素可减小细胞间间隙.E-Cadherin 蛋白在各组间表达以及分布发现,致敏后小鼠耳部皮肤组织内E-Cadherin 蛋白水平较正常小鼠明显下调,E-cadherin 在上皮细胞之间的分布与正常小鼠相比,发生了紊乱现象,给与芒柄花素后E-Cadherin 蛋白水平显著性上调,紊乱现象很大程度上得到了改善.(3)Poly(I：C)刺激上皮细胞后,免疫荧光结果显示上皮细胞之间的E-Cadherin 蛋白分布明显发生了紊乱,细胞膜上的E-Cadherin 蛋白基本分布到了细胞质和细胞核中,给与芒柄花素,上皮细胞之间的E-Cadherin 蛋白的分布明显发生了改善,western blot 结果显示Poly(I：C)刺激上皮细胞后,上皮细胞之间的E-Cadherin 蛋白的表达量显著降低,而给与芒柄花素后,E-Cadherin 蛋白的表达量显著升高.结论：芒柄花素能抑制过敏性炎症,其机制可能与改善上皮细胞之间E-Cadherin 表达与分布有关.

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桂枝挥发油对内毒素中毒小鼠的保护作用

桂枝挥发油对内毒素中毒小鼠的保护作用

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：徐锋温桃群王凤桑文涛石博宇曾南成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地四川成都611137

目的：临床上脓毒症的死亡率较高,而脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,内毒素)与脓毒症中炎症反应关系密切,脓毒症中可见内毒素中毒的症状.桂枝挥发油具有抗炎、抗肿瘤和抗病毒等作用,其抗炎机制与抑制NF-κB 信号通路相关.但尚未见报道...

目的：临床上脓毒症的死亡率较高,而脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,内毒素)与脓毒症中炎症反应关系密切,脓毒症中可见内毒素中毒的症状.桂枝挥发油具有抗炎、抗肿瘤和抗病毒等作用,其抗炎机制与抑制NF-κB 信号通路相关.但尚未见报道桂枝挥发油对内毒素中毒模型小鼠的保护作用,本文主要观察桂枝挥发油对内毒素中毒小鼠模型的保护作用及机制,旨在丰富桂枝挥发油的抗炎作用研究.方法：将小鼠随机分为空白对照组、LPS 组、地塞米松组(5 mg/kg)及0.174 g/kg、0.348g/kg 桂枝挥发油组.除地塞米松组外,药物组灌胃给予相应剂量的桂枝挥发油(0.2 mL/10 g),空白对照组和LPS 组给予等体积的0.3％吐温溶液,连续给药5 天.地塞米松组于第4、5天腹腔注射给药(0.1 mL/10 g),共2 次.末次给药30 min 后,除空白对照组腹腔注射等体积生理盐水外,其余各组动物均腹腔注射15 mg/kg 的LPS 生理盐水溶液(0.1 mL/10 g),构建内毒素中毒小鼠模型.于造模后12 h 观察动物的活动状态,并处死动物.应用全自动血液分析仪测定动物全血白细胞计数(WBC)和血小板计数(PLT),采用ELISA 法和液相蛋白芯片技术测定血清中前炎症因子(IL-1β、IL-18、IL-5、IL-10、INF-γ 和TNF-α)及趋化因子(MCP-1、M-CSF、GM-CSF、MIP-1α 和MIP-1β)的含量,称量并计算小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及胸腺指数,制作肺组织的HE 染色病理切片及计算肺组织切片中嗜中性粒细胞的数目.采用RT-PCR 法测定小鼠肺组织中NF-κB(p65)、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β 和IL-18 mRNA 的表达量.结果：与模型组相比,桂枝挥发油组动物活动量增加,精神状态好转.与空白对照组比较,模型组动物全血WBC 计数显著升高,PLT 计数显著降低,肝脏、脾脏、肺脏、肾脏指数显著增加,而胸腺指数显著降低,桂枝挥发油对模型小鼠WBC、PLT 计数及脏器指数的异常表现影响较小.0.174 g/kg 桂枝挥发油能有效降低模型小鼠血清中IL-18、INF-γ 含量,0.348 g/kg 桂枝挥发油显著降低血清中INF-γ、IL-1β、MCP-1、M-CSF 和MIP-1β 水平.桂枝挥发油对LPS 所致肺组织的病理学变化有一定改善作用,0.348 g/kg 桂枝挥发油显著降低肺组织切片中嗜中性粒细胞的数目.桂枝挥发油对模型小鼠肺组织中p65、NLRP3、IL-1β 和IL-18 mRNA 的表达均体现出一定下调作用,其中0.174 g/kg 剂量显著抑制NLRP3 mRNA的表达,0.348 g/kg 桂枝挥发油显著抑制IL-1β mRNA 的表达.结论：桂枝挥发油通过其抗炎效应对LPS 诱导的内毒素中毒模型小鼠发挥保护作用,其机制可能与调节NLRP3 炎症小体信号通路相关.

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越鞠丸抗抑郁作用新特点与新机制研究

越鞠丸抗抑郁作用新特点与新机制研究

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中华中医药学会中药实验药理分会第十二次学术会议

作者：陈刚薛文达陶伟伟周欣唐娟娟张海楼任荔夏宝妹吴如燕南京中医药大学基础医学院转化系统生物学与神经科学研究中心南京中医药大学中医脑病重点实验室南京210023

目的：抑郁症的一线治疗西药具有起效慢的缺点,且部分患者对各种抗抑郁药物都不反应。近年来氯胺酮的快速持久起效抗抑郁作用及机制引起广泛关注,但是其成瘾和毒副作用限制其广泛的临床应用。本系列研究力图揭示可否利用中医药实现快速...

目的：抑郁症的一线治疗西药具有起效慢的缺点,且部分患者对各种抗抑郁药物都不反应。近年来氯胺酮的快速持久起效抗抑郁作用及机制引起广泛关注,但是其成瘾和毒副作用限制其广泛的临床应用。本系列研究力图揭示可否利用中医药实现快速持久抗抑郁作用,并揭示了其已知与独特的分子神经药理机制。方法：利用快速抗抑郁药物具备的持久抗抑郁性,以氯胺酮作为阳性对照,使用了不同的抑郁症相关模型,对中药越鞠丸的快速与持久抗抑郁作用进行了系统分析,对最新的的快速持久抗抑郁关于的BDNF 和mTOR 信号介导的快速增强神经可塑性进行了检验,通过品系差异性研究,分析了越鞠丸持久抗抑郁的特异性机制。结果：在ICR 品系中,越鞠丸单次给药可以在30 分钟产生降低悬尾不动时间的抗抑郁作用,并可持续24 小时,也缓解获得性无助与陌生环境摄食抑制行为,显示抗抑郁的快速性。在Kunming 品系小鼠中,越鞠丸同样在30 分钟有效,但可持续5 天。在两个品系的海马中,越鞠丸均可以在30 分钟导致BDNF 蛋白的转录后表达增强,提示其在越鞠丸早期抗抑郁中发挥作用。虽然ICR 小鼠上,3 小时产生BDNF 的基因表达增强,但是在24 小时恢复到基底,在Kunming 鼠中,越鞠丸3 小时后,有显著的CREB 与BDNF 基因和表达增强,且持续至少2 天,提示持久性与CREB-BDNF 相关。氯胺酮表现出相似的品系依赖性行为与分子信号差异。使用CREB 上游PKA 信号抑制剂可以逆转越鞠丸对BDNF 基因表达增强和抗抑郁作用,而对氯胺酮没有作用。使用mTOR 抑制剂雷帕霉素可以逆转氯胺酮,而对越鞠丸无效。验证了越鞠丸是通过激活海马细胞CREB-BDNF 来发挥抗抑郁作用的持久性与特异性。在昆明小鼠进行慢性不可预知轻度应激研究中发现,越鞠丸可以早在给药后2小时逆转糖偏好的降低,而氟西汀没有此作用,而且越鞠丸的逆转糖偏好和陌生环境摄食抑制行为可以持续到单次给药后第6 天,此时氯胺酮已没有抗抑郁作用。与氯胺酮一样,越鞠丸可以快速逆转前额叶mTOR 相关信号,如上游AKT,ERK 和下游S6k 与4EBP 的,及突触蛋白GluR1,synapin 1 等降低和NMDAR 亚单位NR1 的升高。而到给药6 天后,相对于氯胺酮,越鞠丸选择性地提高了AKT 信号,抑制NR1,信号说明他们特异性地参与了越鞠丸抗抑郁作用的持久性。此外,研究也发现栀子是越鞠丸快速持久抗抑郁的君方,在不同的化学部位中显示其快速持久抗抑郁潜力。临床初步研究结果支持越鞠丸抗抑郁的快速性。结论：不同的抑郁症动物模型研究结果显示,越鞠丸具有类似于氯胺酮的快速抗抑郁作用,且持久性比起更长,其快速抗抑郁作用可能是通过BDNF 的快速增强产生,而其持久抗抑郁作用依赖于CREB 引起的BDNF 基因表达增强,并与AKT 和NR1 的持久调节有一定的关系,导致快速持久的增强神经可塑性而介导抗抑郁作用。此系列研究首次揭示中医复方具有快速抗抑郁作用,具有广阔的临床应用与开发前景。

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