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原代细胞3D系统的技术进展和应用

原代细胞3D系统的技术进展和应用

引用

2017（第三届）毒性测试替代方法与转化毒理学（国际）学术研讨会

作者：蒋敏齐来俊江苏齐氏生物科技有限公司美国CHI Scientific Inc.

细胞的3D培养系统是基于细胞和器官组织乃至生物体的一种特殊的科研工具,近几年得以飞速发展,从原始的缺陷型细胞株到如今的原代细胞,从当初的胶原基质培养到如今的高分子材料的三维支架,细胞3D系统的培养技术也经历了很大的革新,在应... 详细信息

细胞的3D培养系统是基于细胞和器官组织乃至生物体的一种特殊的科研工具,近几年得以飞速发展,从原始的缺陷型细胞株到如今的原代细胞,从当初的胶原基质培养到如今的高分子材料的三维支架,细胞3D系统的培养技术也经历了很大的革新,在应用方面,也从当初的单一的细胞之间的信息传递研究到如今在药代动力学,毒理学以及靶向药物的测试等方面广泛应用。就3D细胞和2D细胞系统的比较和应用优势而言,2D细胞培养的研究在扩宽我们对发育生物学、组织形态发生、疾病机制、药物发现、大批量蛋白生产、组织工程和再生医学方面的知识方面扮演了至关重要的角色。其操作简单、易重复等特点曾经在新药研发中占据重要的地位,然后近20年来,超过90%的候选药物通过了体外临床前研究,却在临床实验中未能达到预期的疗效或者安全指数,癌症药物的失败率更高,导致人们开始怀疑2D细胞系统的有效性。事实上,诸多研究表明,2D细胞培养试验中,细胞无法实现类似于生物体内的结构组织和连接,这使得细胞形态、存活力、增值能力、分化、基因和蛋白表达、对刺激的反应、药物代谢及一般的细胞功能受到了限制或减弱。而在体内,几乎所有的细胞都分布在一个复杂三维(3D)结构的细胞外基质(ECM)中,它们和相邻的细胞通过信号传导或者直接接触而产生相互作用。如此细胞-细胞和细胞-细胞外基质间的相互作用构建成了一个用于维持组织特异性和稳态的3D通讯网络。进而调控着细胞生命周期的各项活动。3D细胞培养创立了一个近乎体内细胞生长微环境的系统,相较于2D培养,3D细胞系统的生理相关性更加贴近体内组织的特异性。近年来,3D细胞系统被广泛应用于干细胞培养和分化、肿瘤生物学、药物和毒性筛选及组织工程等方面。在3D细胞系统的培养方面,目前以细胞三维支架(胶原、水凝胶、琼脂糖、人工合成高分子等)和悬浮培养为主要技术手段。而在细胞选择方面,逐步以原代细胞培养取代过去具有基因缺陷型的细胞株。3D原代细胞系统在新药研发、毒理学以及环境科学等领域的应用取得的很大进展,主要表现在以下几个方面:3D培养技术在干细胞研究中的应用(间充质干细胞、神经干细胞、胚胎干细胞、肿瘤干细胞等);3D培养技术在肿瘤药物研发中的应用(乳腺癌、肺癌、肝癌等);3D细胞系统在毒性、毒理研究中的应用(皮肤细胞);3D细胞系统在环境监测研究中的应用(肝实质细胞系统、肺上皮细胞系统)。本综述试图总结细胞3D系统的培养技术和应用,以及当下面临的挑战。系统地阐述3D细胞培养技术的发展;全面比较2D细胞和3D细胞系统的优势和缺点;详细描述3D原代细胞培养技术在新药研发、毒理学和环境科学等方面科研的应用。

关键词：新药研发生物体三维支架原代细胞培养细胞株

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罗格列酮、胰岛素对双酚A暴露引起AD样病理性蛋白改变中的作用及机制

罗格列酮、胰岛素对双酚A暴露引起AD样病理性蛋白改变中的作用及...

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2017（第三届）毒性测试替代方法与转化毒理学（国际）学术研讨会

作者：余鹏飞王军肖杭南京医科大学公共卫生学院

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）俗称老年性痴呆,是一种以进行性认知和记忆功能障碍为主要临床症状的神经退行性疾病。大脑中胰岛素代谢的紊乱被认为AD的重要发病因素之一。我们既往动物实验结果显示,双酚A（BisphenolA,BP... 详细信息

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）俗称老年性痴呆,是一种以进行性认知和记忆功能障碍为主要临床症状的神经退行性疾病。大脑中胰岛素代谢的紊乱被认为AD的重要发病因素之一。我们既往动物实验结果显示,双酚A（BisphenolA,BPA）暴露可导致成年及子代小鼠发生脑胰岛素抵抗,并上调AD早期病理性标志蛋白淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）及p-tau的表达。罗格列酮（rosiglitazone,Ros）是一种过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）激动剂,作为胰岛素增敏剂而广泛应用于2型糖尿病的治疗。研究发现罗格列酮和胰岛素可改善胰岛素抵抗及其信号传导,同时还可降低炎症反应,减轻AD患者远期认知功能损害的程度。目的:基于胰岛素信号通路对学习记忆的重要作用,我们探讨BPA暴露是否可以通过干扰中枢胰岛素信号致早期病理性蛋白的形成,并且胰岛素增敏剂罗格列酮及胰岛素是否可以改善BPA引起中枢胰岛素抵抗及由中枢胰岛素抵抗所引起下游神经病理性蛋白的改变。方法:该实验使用具神经细胞特征的大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞系（PC-12）及神经瘤母细胞（SH-SY5Y）,通过western blot、免疫荧光和酶联免疫吸附法（ELISA）等实验方法,探讨BPA、罗格列酮及胰岛素对AD早期病理性蛋白APP和β淀粉样蛋白(β-amyloidpeptide,Aβ)及tau蛋白多种磷酸化位点的表达影响。结果:BPA暴露后,APP、tau蛋白苏氨酸205位点磷酸化水平随着浓度的增加而上升且呈时间依赖性升高,而其它tau蛋白5个磷酸化位点（Ser199、Ser396、Thr205、Ser214和Ser404）经BPA处理后都表现出不同程度的升高;借助于ELISA,发现细胞上清中Aβ含量在BPA处理组呈明显升高趋势;进一步研究显示,该现象可能和BPA促进β分泌酶1（β-secretase,BACE-1）表达上调有关。相反,罗格列酮和胰岛素可以降低APP的表达和BACE-1活性,减少Aβ生成,并且通过改善胰岛素信号抑制tau蛋白的过度磷酸化,表现为tau蛋白磷酸化位点S199、S396、T205、S214和S404磷酸化水平的显著降低。结论:BPA可促进tau蛋白异常高度磷酸化及Aβ前体蛋白APP表达升高,同时上调BACE-1和β淀粉样蛋白的表达,继而导致中枢神经系统Aβ堆积,发生神经退行性样病变。而罗格列酮、胰岛素可通过改善胰岛素信号进而降低p-tau、APP及Aβ的生成。因而中枢胰岛素信号通路在BPA引起的神经退行性样病变的干预中发挥重要作用,可作为干预靶点,具有积极的预防和应用价值。

关键词： BPA 罗格列酮 AD样病理性蛋白

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面向化学品风险评价的计算(预测)毒理学:进展与前瞻

面向化学品风险评价的计算(预测)毒理学:进展与前瞻

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2017（第三届）毒性测试替代方法与转化毒理学（国际）学术研讨会

作者：陈景文王中钰乔显亮李雪花谢宏彬蔡喜运工业生态与环境工程教育部重点实验室大连理工大学环境学院

进入新世纪以来,为高效地评价和预测化学品的环境风险,风险评价方法发生着巨大的变革。计算毒理学无疑处于这场变革的前沿——它融合毒理学、环境化学、化学/生物信息学、系统生物学等学科资源,构建数学或计算机模型以实现化学品的环境... 详细信息

进入新世纪以来,为高效地评价和预测化学品的环境风险,风险评价方法发生着巨大的变革。计算毒理学无疑处于这场变革的前沿——它融合毒理学、环境化学、化学/生物信息学、系统生物学等学科资源,构建数学或计算机模型以实现化学品的环境暴露、危害性与风险性的高效预测和评价,并提升对毒性机制的认识。计算毒理学研究的核心内容有3个方面:(1)化学品从环境释放、环境分布归趋、生物体内暴露、至生物及生态系统产生不利结局这一全过程的模拟预测方法学,揭示化学品的毒性通路和不利结局路径是其关键;(2)种类众多且数目不断增多的大量化学品环境风险的模拟预测,对此,定量构效关系(QSAR)模型可以发挥重要作用;(3)化学品对不同生物种属风险的模拟预测,其核心是跨物种(属)风险外推方法学,对此,现代分子模拟技术和组学技术有望发挥重要作用。在模拟化学品环境分布归趋、生物体内暴露水平时,需要借助多介质环境模型以及基于生理的毒代动力学(PBTK)模型。而构建上述模型的关键则在于提供准确的环境行为和生物动力学参数。然而,化学品的环境行为十分复杂,一些重要的环境、生化行为,例如环境光化学降解、气相自由基降解、环境水解、生物酶促反应等缺乏足够的实验研究。同时,相关环境、生化行为的分子机制尚未被明确理解,不利于我们对其他环境化学品的同类行为进行预测评价,也限制了具有良好预测能力的机理透明的QSAR模型的开发。近年来,本课题组针对决定有毒有机物环境持久性的光化学行为及转化产物的毒理效应,开展了分子机制和模拟预测研究,主要内容包括:(1)研究了抗生素、多溴联苯醚(PBDEs)及其代谢产物等新型污染物的不同形态在水中直接、自敏化和介质敏化降解的环境光转化机制;基于量子化学计算,发展了气相污染物·OH自由基光氧化降解途径、动力学和产物的模拟预测方法,构建了环境光降解动力学参数的QSAR预测模型。(2)采用分子模拟,揭示了PBDEs被细胞色素P450酶活性中心催化转化为羟基多溴联苯醚(HO-PBDEs)、以及HO-PBDEs等化合物与激素受体的作用机制;发现可电离分子不同离解形态与激素受体蛋白具有不同的分子作用机制,构建了环境内分泌干扰效应的预测毒理模型。展望未来,对于用较小的模型体系即能较好表征的问题,采用高精度的量子化学计算方法可弥补实验数据的缺失;而对于复杂的毒理学问题,基于分子模拟所揭示的化学品与生物大分子的相互作用机制,研发出更有效的针对特异毒性靶点的描述符体系,有望提升QSAR模型的机理性和预测效果。

关键词：化学品环境分布 PBDEs 模拟预测激素受体风险评价

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替代方法在植入性医疗器械中的应用

替代方法在植入性医疗器械中的应用

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2017（第三届）毒性测试替代方法与转化毒理学（国际）学术研讨会

作者：黎砚书肖小华余华江西省医疗器械检测中心江西省药物研究所

植入性医疗器械被越来越广泛地应用于临床,从植入式骨板、骨钉、骨针、植入性心脏起搏器、植入性心房除颤器、人工耳蜗、各种植入性电极（用于帕金森病、癫痫等疾病的治疗）、植入性胰岛素泵,到形形色色的植入性血管支架等,到近些年来... 详细信息

植入性医疗器械被越来越广泛地应用于临床,从植入式骨板、骨钉、骨针、植入性心脏起搏器、植入性心房除颤器、人工耳蜗、各种植入性电极（用于帕金森病、癫痫等疾病的治疗）、植入性胰岛素泵,到形形色色的植入性血管支架等,到近些年来发展起来的3D打印人体植入物,对于治疗多种疾病,维持患者正常健康生活发挥着不可或缺的作用。但一个植入性医疗器械被批准用于临床,相较于其他的医疗器械需要进行更加复杂的评价过程,目前的生物安全性评价涉及多项试验,包括细胞毒性、迟发型超敏反应、皮内反应、急性全身毒性、亚急性和亚慢性毒性、遗传毒性、植入试验、血液相容性,长期或永久植入的还需考虑慢性毒性、致癌性、生物降解、毒代动力学、免疫毒性、生殖/发育毒性或其他器官特异性毒性,其中除细胞毒性、部分遗传毒性试验、部分血液相容性试验等项目是体外方法外,其余均需更大量的动物进行试验。近些年来,以减少、优化和替代为核心的动物试验替代方法已经被愈来愈多的的科学家所接受。2013年3月11日起,欧盟委员会下令全面禁止用动物对化妆品的安全性进行测试,全面禁止销售任何用动物进行测试过的化妆品,包括化妆品成分。尤其我国国家食品药品监督管理总局在2016年11月7日发布,将《化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验方法》作为第18项毒理学试验方法纳入《化妆品安全技术规范》（2015年版）第六章,这标志着替代试验正式被纳入现行法规。因此,寻求可用于医疗器械特别是植入器械安全性评价的替代方法势在必行。经过验证的试验:如直接多肽反应试验（DPRA）,KeratinoSens试验,人细胞系活化试验（h-CLAT）是根据皮肤致敏的机制而设计的迟发型超敏反应的离体替代试验;用受试物在BALB/c 3T3细胞中性红摄取试验的IC值来预测急性全身毒性;细菌基因突变试验（OECD471）、哺乳动物细胞基因突变试验（OECD476）和哺乳动物细胞诱裂性试验（OECD473）体外试验结果均为阴性,为避免动物的过度使用,通常不再论证并不宜再进行动物遗传毒性试验,若全部结果均为阳性,则应进行体内诱变性试验,同时ISO推荐金黄地鼠胚胎细胞形态转化试验这种短期的致癌性检测方法用做遗传毒性试验阴性（非遗传毒性）的高风险医疗产品的检测,以弥补缺乏动物致癌性检测的不足或作为动物致癌性检测的前筛选;对可吸收医疗器械或含可溶出物质的医疗器械,如果在吸收、代谢和分布研究方面有充分可靠的数据,或对材料或医疗器械浸提液中所有成分进行鉴别,若均无生殖和发育毒性时,就无需进行生殖毒性试验。随着组织工程技术的发展,"人造器官"也可一定程度上用于毒性评价,如Truskey GA发现组织工程血管可能是有前途的药物安全评价工具,也可以用于临床上植入的血管支架评价的工具。随着我国越来越多的医疗器械产品进入欧盟和世界市场,必将对中国的医疗器械检验技术和标准提出了新的技术壁垒。为此,我们应该加大医疗器械安全性评价动物试验替代方法的科研投入力度,以尽快实现与国际先进方法接轨。

关键词：植入性医疗器械替代方法替代试验

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肥胖代谢综合征与正常体重代谢异常发生非酒精性脂肪性肝病的危险性研究

肥胖代谢综合征与正常体重代谢异常发生非酒精性脂肪性肝病的危险...

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中华医学会第四届肝病与代谢学术研讨会

作者：张弛湖南省人民医院

目的比较肥胖代谢综合征(obesity with metabolic syndrome)、正常体重代谢异常(metabolically unhealthy normal weight,MUNW)发生NAFLD危险性的差异.方法湖南省人民医院体检中心2006年6月～2010年1月体检人群4067例,其中1358例再次来我院体检,398例每年随访一次,连续4年.其中,男性279例,女性119例.年龄在27至89岁,平均年龄为(58.09±15.57)岁.肥胖诊断标准采用2000年国际肥胖工作组(International obesity task force,IOTF)规定的亚太地区肥胖标准.代谢综合征(metabolic syndrome,MS)诊断标准根据2001年美国胆固醇教育计划(the National Cholesterol Education Program,NCEP)成人组第三次报告(ATP-Ⅲ)关于MS的定义进行诊断.NAFLD的诊断根据2010年中华医学会肝病学分会诊断标准中的影像学诊断定义,行腹部B超检查进行诊断.对72例肥胖MS、64例MUNW进行随访,分析其发生NAFLD的危险性.

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代谢正常肥胖发生非酒精性脂肪性肝病的危险性研究

代谢正常肥胖发生非酒精性脂肪性肝病的危险性研究

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中华医学会第四届肝病与代谢学术研讨会

作者：贺肴张弛刘瑛廖青田晶晶宁昭哲王敏熊璞王霞陈晶湖南省人民医院湖南师范大学第一附属医院

目的探讨代谢正常肥胖(metabolically healthy obese,MHO)发生非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的危险性.方法湖南省人民医院体检中心2006年6月～2010年1月体检人群4067例,其中1358例再次来我院体检,398例每年随访一次,连续4年.其中,男性279例,女性119例.年龄在27至89岁,平均年龄为(58.09±15.57)岁.肥胖诊断标准采用2000年国际肥胖工作组(International obesity task force,IOTF)规定的亚太地区肥胖标准.代谢综合征(metabolic syndrome,MS)诊断标准根据2001年美国胆固醇教育计划(the National Cholesterol Education Program,NCEP)成人组第三次报告(ATP-Ⅲ)关于MS的定义进行诊断.MHO诊断同样采用ATP-Ⅲ标准,肥胖但未达到MS即诊断为***的诊断根据2010年中华医学会肝病学分会诊断标准中的影像学诊断定义,行腹部B超检查进行诊断.对84例MHO进行随访,分析其发生NAFLD的危险性.

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小鼠模型非酒精性脂肪性肝病早期:UCP2基因缺乏保护肝细胞脂肪变性而促进肝小叶和门脉周围炎症形成

小鼠模型非酒精性脂肪性肝病早期:UCP2基因缺乏保护肝细胞脂肪变...

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中华医学会第四届肝病与代谢学术研讨会

作者：周美岑于平孙琦李玉秀北京协和医院河北省秦皇岛第三人民医院

目的建立UCP2基因敲除(UCP2-/-)小鼠高脂饲养模型,通过基因联合miRNA芯片分析,探讨UCP2基因在NAFLD早期形成中的作用.方法 4周龄雄性UCP2-/-和UCP2+/+小鼠,各分为高脂和正常饲养,每组各10只.高脂总热量4.83kcal/g,脂肪占58％.饲养第16...

目的建立UCP2基因敲除(UCP2-/-)小鼠高脂饲养模型,通过基因联合miRNA芯片分析,探讨UCP2基因在NAFLD早期形成中的作用.方法 4周龄雄性UCP2-/-和UCP2+/+小鼠,各分为高脂和正常饲养,每组各10只.高脂总热量4.83kcal/g,脂肪占58％.饲养第16周时测定血ALT、AST、TG、TC、FFA、胰岛素,进行2h腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)和90min胰岛素耐量试验(ITT).早相胰岛素分泌评估指标采用AIRg:△I/△G=I30-I0/G30-G0,胰岛素敏感性评估指标HOMA-IR、Si=1/Glu0×Ins0、AIRg×Si.小鼠肝脏组织(每组n=10)HE染色评估肝脏脂肪变性、炎症和纤维化程度,进行miRNA、基因芯片分析(每组n=3),分别用Taqman探针、SYBR法进行验证.

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全国多中心不同糖代谢人群肝脏脂肪含量现况调查及其与代谢紊乱的关系

全国多中心不同糖代谢人群肝脏脂肪含量现况调查及其与代谢紊乱的...

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中华医学会第四届肝病与代谢学术研讨会

作者：卞华夏明锋高鑫毕宇芳孙丽荣李强郑丽丽邸阜生李红高燕燕朱大龙包玉倩何兰杰陈璐璐王尧施军平复旦大学附属中山医院上海交通大学附属瑞金医院天津代谢病医院哈尔滨医科大学第二医院郑州大学附属第一医院天津市第三中心医院昆明医学院附属第一医院青岛大学医学院附属医院南京鼓楼医院上海交通大学附属第六人民医院宁夏医科大学总医院华中科技大学同济医学院附属协和医院东南大学附属中大医院杭州师范大学附属医院

目的调查全国15家三级甲等医院糖调节受损(IGR)、新诊断2型糖尿病(NT2DM)及已诊断2型糖尿病(KT2DM)患者肝脏脂肪含量(LFC).旨在了解糖代谢异常者LFC状况及其与代谢紊乱的关系.方法 2124例受试者进行了肝脏定量超声的检查,NC组619例(男/...

目的调查全国15家三级甲等医院糖调节受损(IGR)、新诊断2型糖尿病(NT2DM)及已诊断2型糖尿病(KT2DM)患者肝脏脂肪含量(LFC).旨在了解糖代谢异常者LFC状况及其与代谢紊乱的关系.方法 2124例受试者进行了肝脏定量超声的检查,NC组619例(男/女253/366),IGR组384例(男/女180/204),NT2DM组338例(男/女199/139),KT2DM组783例(男/女439/344),年龄分别为52.6±14.7,56.9±13.0, 51.5±12.3, 58.0±12.2岁.结果 ***在NC、IGR、NT2DM、KT2DM分别为9.8(6.1-15.5)％,11.6(6.8-21.5)％,18.5(9.0-28.4)％,13.5 (7.1-21.6)％,在NC、IGR及NT2DM组逐步上升(P均＜0.01),KT2DM低于NT2DM组(P＜0.01).

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老年非酒精性脂肪肝病人的预期转归分析

老年非酒精性脂肪肝病人的预期转归分析

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中华医学会第三届肝病与代谢学术研讨会

作者：王建文柳红梅匡荣光山东省千佛山医院老年病科 250014

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