3-羟基天冬氨酸在兴奋性氨基酸神经递质系统中起着重要作用,它是一种谷氨酸转运蛋白抑制剂,与N-甲基-D-天冬氨酸受体也有亲和作用[1,2]。该分子存在双手性中心,有D,L-苏式和D,L-赤式四种构型(图1),不同构型的3-羟基天冬氨酸在功能和活性上存在差异。因此,实现四种立体异构体的分离分析具有重要的生物学意义。本实验建立了一种毛细管电泳质谱联用定性定量检测双手性中心分子3-羟基天冬氨酸的方法,实现了四种构型的完全分离。首先合成了D,L-赤式-3-羟基天冬氨酸,核磁定量确定纯度为91%。FMOC-Cl为衍生化试剂,随衍生化试剂的增加和衍生化时间的增长,衍生化产率趋于稳定,视为衍生化反应完全。采用Box-Behnken实验设计探究背景缓冲液各组成成分对分离度和灵敏度的影响,影响显著的因素如图2所示。模型预测得出最优分离条件为49 m M乙酸铵,6 mMβ-CD,15%异丙醇。随后对质谱参数、鞘流液组成及流速等进行优化,其中喷雾气压力对分离影响较大,随喷雾压力的减小分离度增大(图3)。未经衍生化的3-羟基-天冬氨酸不能实现手性分离,而衍生化后可实现两对对映体的完全分离(图4),说明FMOC-Cl对于该手性对映体的拆分具有辅助作用。目标分子在10-400μM浓度范围内线性关系良好(R2≥0.9989),LOD为2.5μM,LOQ为10μM,迁移时间相对标准偏差小于0.13%,峰面积相对标准偏差小于2.86%(n=6)。以大鼠脑脊液为基质,在50μM,100μM,200μM三个浓度水平加标,回收率位于87.4%-96.5%,说明该方法准确可行。
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