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脱氧雪腐镰刀菌烯醇在大鼠体内的分布研究

脱氧雪腐镰刀菌烯醇在大鼠体内的分布研究

引用

中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：万丹黄玲利潘源虎袁宗辉国家兽药残留基准实验室(HZAU)/农业部食品安全评价重点开放实验室华中农业大学动物医学院

【目的】脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是一种主要由禾谷镰刀菌产生的次级代谢产物,属于单端孢霉烯B族毒素。该毒素的急性毒性能引起的大和畜禽呕吐,腹泻,腹痛等消化道中毒症状;慢性毒性可导致拒食,体重减轻等。本研究的主要... 详细信息

【目的】脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是一种主要由禾谷镰刀菌产生的次级代谢产物,属于单端孢霉烯B族毒素。该毒素的急性毒性能引起的大和畜禽呕吐,腹泻,腹痛等消化道中毒症状;慢性毒性可导致拒食,体重减轻等。本研究的主要目的是从组织分布角度,阐明DON引起急性或慢性中毒的可能的靶组织,为毒性机理的研究提供科学依据。【方法】大鼠单次灌服氚标脱氧雪腐镰刀菌烯醇0.5mg/kg b.w.和2.5mg/kg b.w.,收集给药后6h,12h,24h,48h,72h,96h…的尿液和粪便,采用液闪计数仪测定不同时间各排泄物中放射性物质含量变化。大鼠连续5天灌服氚标脱氧雪腐镰刀菌烯醇0.5mg/kg ***和2.5mg/kg ***,于停药后6h,24h,48h,72h,96h股动脉放血处死大鼠,收集心、肝、脾、肺、肾、脑、血浆、生殖腺、肾上腺、皮肤、肌肉、脂肪、膀胱、胃、大肠、小肠等组织,采用液闪计数仪测定不同时间各组织中放射性物质含量变化。【结果】DON在动物体内排泄迅速,主要经粪便排泄。给药后24h,60%以上药物均排出体外,4d内,高剂量和低剂量组药物排除率分别为83.44±7.88%(n=6)和87.99±10.30%(n=6),尿排泄率分别为33.12±10.31%(n=6)和39.51±13.41%(n=6)。其中雌性动物的尿排泄率分别为42.26±3.07%(n=3)和57.13±1.18%(n=3);雄性动物的尿排泄率分别为23.97±2.26%(n=3)和27.29±0.67%(n=3)。DON可广泛分布于体内各组织器官,其中胃肠道的浓度最高,达到3-5mg/kg;DON消除迅速,除胃肠道以外,其他组织的浓度在48h内均降至100μg/kg。肾脏消除最慢,为残留靶组织。【结论】DON在动物体内吸收好、排泄迅速,主要排泄途径为粪便。两种剂量相比,低剂量经尿液排泄的比例较高剂量高;两种性别相比,雄性动物经尿液排泄的比例比雌性动物低。该化合物能透过血脑屏障和血睾屏障,广泛分布至全身各组织,其中胃、大肠和小肠的浓度极显著高于其他组织,说明胃肠道可能是DON毒性作用的靶组织;肾脏消除最慢,为残留靶组织。结合慢性毒性试验结果,雄性动物较雌性动物更加敏感的原因可能是雌性动物的胃肠道对毒素更耐受或吸收能力更强,从而能更多的将DON吸收入体内,通过代谢从尿液排泄;而雄性动物无法将胃肠道中的DON及时排泄。本研究阐明了DON在大鼠体内的吸收、分布和排泄特点,初步确定了DON的毒性作用的靶组织。研究结果为DON毒性机理研究提供了科学可靠的研究资料。

关键词： [3H]-DON 大鼠分布排泄

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T-2毒素及其主要代谢物在猪、鸡体内的毒动学与组织分布研究

T-2毒素及其主要代谢物在猪、鸡体内的毒动学与组织分布研究

引用

中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：赵海燕刘玉静曾东平方炳虎孙永学华南农业大学兽医学院国家兽药安全评价(环境评估)实验室(华南农大)

【目的】T-2毒素是由二线镰刀菌产生的A型单端孢霉烯族毒素,联合国粮农组织和世界卫生组织已将T-2毒素列为最危险的食品污染物。已有大量文献报道T-2毒素是动物饲料中最主要的霉菌毒素之一,对动物生长影响极大,其经动物性食品残留亦对... 详细信息

【目的】T-2毒素是由二线镰刀菌产生的A型单端孢霉烯族毒素,联合国粮农组织和世界卫生组织已将T-2毒素列为最危险的食品污染物。已有大量文献报道T-2毒素是动物饲料中最主要的霉菌毒素之一,对动物生长影响极大,其经动物性食品残留亦对人类健康造成潜在危害。本文通过对T-2毒素及其主要代谢物HT-2和T-2 Triol(三醇)在猪鸡的毒物代谢动力学与组织分布研究,旨在为T-2毒素在动物性食品安全监控中提供理论依据。【方法】(1)建立了T-2毒素及其代谢物在猪、鸡血浆和多种组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、胃、肠、脑)以及粪和尿中的HLPC-MS/MS检测方法;(2)对二元杂猪静注T-2毒素(0.5和1mg/kg b.W.)进行了原形及其代谢物的毒动学研究;对科宝白鸡经单剂量静注(0.5mg/kg)与多剂量内服(8mg/kg)T-2毒素进行毒动学研究。(3)对猪静注T-2毒素(1mg/kg.b.W.)和对科宝白羽鸡每12h经口染毒T-2毒素一次(总剂量8mg/kg)对各组织中的残留分布进行了研究。【结果】(1)HLPC-MS/MS法的线性良好,回收率均在71%以上,定量限分别为0.5ng/mL、1ng/mL和5ng/mL。(2)在猪静注T-2毒素后的血浆浓度依次为T-2毒素>HT-2毒素>T-2 triol,其消除半衰期分别为T-triol(60.5min和159min)>HT-2毒素(37.7min和73.7min)>T-2毒素(11.3和34.6min);在科宝白鸡单剂量静注与多剂量内服的消除半衰期分别为17.3 min和23.4min(T-2毒素)、33.6 min(HT-2毒素)、9.6 min和87.6min(T-2三醇),在鸡静注血浆中代谢物T-2三醇消除最快,HT-2毒素消除最慢;鸡在多剂量内服染毒后未能检出代谢物HT-2毒素。(3)对猪静注T-2毒素后,在肝、肾中未测到T-2毒素,在各组织中均未测得HT-2毒素和T-2二醇:在各组织中T-2毒素的消除半衰期依次为脂肪>肌肉>胃>脑>心脏>肠>肺脏>脾脏,在猪排泄中HT-2和T-2 Triol消除较快,分别于第4和第3天已检测不到。三者经尿排泄量分别占给毒量的2.41%、3.63%和6.32%。科宝白鸡经单剂量静注各组织中均存在T-2毒素及其多种代谢物分布,但浓度较低。T-2毒素组织分布为胃>肠>肺>肌>肾>脂>心>肝;HT-2为胃>肠>肾>肺心>肌>脂>肝;T-2Triol为肠>胃>肾>肺>肌肉>肝>心>皮脂;于-2毒素消除半衰期分别为心>胃>脂>肠>肾>肺>肌肉>肝;HT-2毒素为脂>肝>心>肺>肠>胃>肌>肾;T-2二醇为心>肝>肺>肌>肠>胃>脂>肾。

关键词： T-2毒素主要代谢物猪鸡组织分布

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不同中药方剂防治鸡传染性支气管炎的疗效研究

不同中药方剂防治鸡传染性支气管炎的疗效研究

引用

中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：王玲陈炅然郭天芬李宏胜杨峰胡广胜王旭荣中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃农业大学动物医学院

【目的】介绍防治鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)的中药方剂与临床效果,总结防治鸡IB中药的种类,探讨中药防治鸡IB研究存在的问题与应用前景。【方法】综述了以清热解毒为主,化痰止咳、清利咽喉为辅组成的中药复方制剂在... 详细信息

【目的】介绍防治鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)的中药方剂与临床效果,总结防治鸡IB中药的种类,探讨中药防治鸡IB研究存在的问题与应用前景。【方法】综述了以清热解毒为主,化痰止咳、清利咽喉为辅组成的中药复方制剂在防治鸡IB方面的应用现状及效果观察,归纳了防治呼吸型、肾形鸡IB的中药方剂种类,中西药结合防治鸡IB以及中西药临床疗效比较研究。【结果】鸡传染性支气管炎以呼吸道症状、产蛋量下降或肾脏病变为主要特征,现多采用疫苗免疫和西药治疗,由于IBV毒株具有高度易变异和多血清型的特点,现有疫苗缺乏交叉免疫或完全无交叉免疫,给鸡传染性支气管炎的诊断和防治带来了很大困难,发病后尚无特效药物治疗。中兽医学虽然没有鸡传染性支气管炎这一病名,但其所表现的临床特征与中兽医学肺、脾、肾三脏的病理病机密切相关,按照中兽医理论,鸡IB乃疫疠毒邪犯肺,痰浊壅塞,导致肺失宣肃、气滞血凝、津液失于布散所致,其病之根本在肺。中医治疗鸡传支坚持祛邪与扶正两大原则,祛邪是祛除有害病因——疫毒之邪,即抑制或消除致病因子,排除病理产物;扶正是通过增强机体的抗病力,提高免疫功能,扶正普遍应用于各种传染病的始终,基本原则是养阴保津。现代药理研究表明,有些中药不但具有抑杀病毒的作用,且能调节机体的免疫功能,具有非特异性的抗病毒功能。中药在防治鸡IB方面有着很大潜力和优势,采用中兽医之理、法、方、药防治,特别是同一方剂可防治鸡不同的呼吸道疾病,更证明了中兽医学"异病同治"辨证论治原则的应用价值。清热解毒类、凉血活血类、补益类中药能直接降解病原体的毒素,还能增强机体的免疫功能,因此,防治IB的方剂中把清热解毒类药作为主药用来抑制病毒,辅以清热化痰、平喘止咳药,达到祛邪的目的,且协同补益类中药共同增强机体免疫力,达到扶正的目的。【结论】中药避免了抗病毒药、抗生素类药物的不合理应用和禽蛋产品中的药物残留,用于临床收效甚好,所用方剂与西药相比具有独特的优势,经过科学配制可对禽病防治起到很大作用。在此基础上探讨了中药防治鸡IB的可能性,研发抗鸡IB中药所面临的问题及途径,以期进一步完善并扩大中药在防治畜禽传染性疾病上的应用。

关键词：中药防治鸡传染性支气管炎疗效

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黄连解毒汤对感染大肠埃希菌大鼠脑组织TLR9表达的影响

黄连解毒汤对感染大肠埃希菌大鼠脑组织TLR9表达的影响

引用

中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：刘晓强周宏超俞亚玲赵守中杨鸣琦李引乾西北农林科技大学动物医学院

【目的】Toll样受体(Toll-like Receptors,TLRs)是近年来备受关注的一种模式识别受体(pattem recognition receptor,PRR),主要在免疫效应细胞如巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells,DC)和B细胞中表达,能够识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMP),从而启动天然和获得性免疫应答反应。其中,TLR9特异性识别存在于细菌和病毒中的核酸序列,是哺乳动物细胞识别细DNA中CpG模体的主要受体,为了探讨(TLR9)及相关炎症因子在脑损伤中的调节机制,本研究采用免疫组织化学SP法对正常大鼠、感染大肠埃希菌大鼠和黄连解毒汤预防大鼠脑组织中的TLR9表达及相关因子的动态变化进行了研究。【方法】66只SD大鼠随机分成3组。试验组(n=30):与其他组同步饲养,处理当天分别腹腔注射大肠埃希菌菌液0.5 mL/只(2.4×10～9CFU/mL),每组5只。黄连解毒汤预防组(n=30):与其他组同步饲养,每只按12.6 ml/kg剂量提前6d灌服黄连解毒汤,处理当天分别腹腔注射大肠埃希菌菌液0.5 mL/只(2.4×10～9CFU/mL),每组5只。对照组(n=6):与其他组同步饲养,处理当天腹腔注射等量生理盐水。分别于注射后的3、6、9、12、18、24 h随机处死一个攻毒小组和防治小组的大鼠及1只对照组大鼠,并取其大脑组织,用4%多聚甲醛固定。每个脑组织分为两部分:一部分脑组织常规石蜡包埋,HE染色,光学显微镜下观察病理变化;另一部分脑组织则进行常规免疫组织化学SP法,观察脑组织TLR9及相关因子的表达。TLR9以细胞质或细胞膜呈蓝色为阳性细胞。每张切片高倍镜(10×40倍)下随机选择5个不同的视野,图像信号采集与分析系统拍照,采用自带图像分析软件计数每个视野中阳性细胞数,取其平均值。利用SPSS17.0软件进行统计学分析。全部计量资料用X±S表示,两组资料比较采用t检验;以P<0.05为差异具有统计学意义性。【结果】TLR9在大鼠正常生理状态下有少量表达,感染大肠埃希菌后,TLR9的表达出现明显变化,且这种变化随着时间的推移而越发明显。在感染后3h时TLR9表达量较正常生理状态下显著增加,在6h时开始显著增加,12h时达到高峰,与对照组和试验组相比,有极显著差异(P<0.01)。预防组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。该研究结果显示黄连解毒汤可通过抑制TLR9的表达对细菌所致的脑损伤产生保护作用。【结论】TLR9参与了脑组织抵抗消灭外来病原的过程,是脑组织先天性免疫和与获得性免疫间转化的重要因素。

关键词： Toll受体9 黄连解毒汤脑组织大肠埃希菌

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T-2毒素在猪肝脏和肠道中代谢途径研究

T-2毒素在猪肝脏和肠道中代谢途径研究

引用

中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：吴庆华黄玲利袁宗辉国家兽药残留基准实验室(HZAU)/农业部食品安全评价重点开放实验室华中农业大学

【目的】T-2毒素是单端孢霉烯族毒素类中毒性最强的一类毒素。它由镰刀菌（Fusarium）产生。T-2毒素能够引起动物的拒食、呕吐、腹泻、共济失调、体重减轻、不育、免疫系统、抑制蛋白质合成、造血系统受到损害等疾病。同时它也是世界上... 详细信息

【目的】T-2毒素是单端孢霉烯族毒素类中毒性最强的一类毒素。它由镰刀菌（Fusarium）产生。T-2毒素能够引起动物的拒食、呕吐、腹泻、共济失调、体重减轻、不育、免疫系统、抑制蛋白质合成、造血系统受到损害等疾病。同时它也是世界上危害粮食作物的最重要的毒素之一。T-2毒素可在动物肝脏和肠道中发生广泛代谢。且已有报道表明T-2毒素被动物摄入后,能够残留在可食性组织内,从而进一步危害人类健康。T-2毒素发生代谢转化后,毒性随之发生变化,有的代谢物甚至毒性升高。所以为了研究清楚T-2毒素在猪体内代谢途径,我们开展了T-2毒素在猪的肝脏和肠道的代谢研究,从而进一步为毒性研究提供数据。【方法】本研究采用了肝脏和肠道内容物的体外培养法。肝脏微粒、胞液和盲肠内容物进行了制备。然后大鼠肝微粒体或胞液（2mg/mL）、0.05 M Tris-HCl（1 mM EDTA、0.15 M KCl,pH7.4）和NADPH生成系统(β-NADP（2 mM）、6-磷酸葡萄糖（10 mM）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（1 U）、MgCl（5 mM）)。体系在37℃下预孵育5 min后,然后加入T-2毒素,浓度100μM,开始孵育。整个孵育体系体积为200μL。不加T-2毒素的肝微粒体作为空白对照。整个孵育过程持续120 min,终止反应。反应溶液经涡旋混匀,1 5000 r离心15 min,取上清液,并过0.22μM滤膜。滤液通过LC/MS-ITTOF检测分析。50μL T-2毒素（100μM）加入450μL盲肠内容物中,进行孵育。在20 min,40 min,1,2,4,8,24 h分别终止孵育,放入-80冰箱。HPLC-QTrap MS系统（API 4000,Darmstadt,Germany）分析T-2毒素及其代谢物。样品分离通过ZORBAX EclipseXDB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm;3.5μm）进行分离。流动相A为水,B为乙腈。采用梯度洗脱,0-5 min,10%B;5-30 min,10%-100%B。进样体积10μL。PDA检测器扫描波长为200-400nm,柱温40℃,分析时间30min。【结果】经过2小时的孵育后,在猪的微粒体中,除T-2毒素外,发现了HT-2 toxin、neosolaniol（NEO）、3'-OH-T-2和3'-OH-HT-2毒素四种代谢物。在猪肝胞液中,发现了其中HT-2毒素、NEO、3'-OH-T-2三种代谢物,并且两个体系中,HT-2毒素均为主要代谢物,含量最高。肝微粒体的代谢能力比胞液强。经过24小时的盲肠内容物孵育后,发现T-2毒素的盲肠内容物被逐步降解,只发现了HT-2毒素。几头猪对T-2毒素的降解差异很大。HT-2毒素的生成量与T-2毒素的降解呈反比。【结论】猪肝脏和肠道均能有效代谢T-2毒素,但肝脏代谢能力更强。HT-2毒素是肝脏和肠道内的主要代谢物,表明T-2毒素对猪的毒性,是由T-2和HT-2毒素共同作用。

关键词： T-2毒素肝脏肠道代谢

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2002和2009年食品动物源产CTX-M-14大肠杆菌传播分子机制比较

2002和2009年食品动物源产CTX-M-14大肠杆菌传播分子机制比较

引用

中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：郭玉芳甄盼盼汤电王丽华付晓平任君玉张文慧刘志杰赵秋云蒋红霞华南农业大学

【目的】通过比较和分析2002年和2009年产CTX-M-14大肠杆菌传播分子机制的特点,推测产CTX-M-14大肠杆菌传播分子机制的演变趋势,进而为bla传播机制及其变化规律的研究提供参考。【方法】从本实验室保存的2002（4/455株）和2009年（8/32... 详细信息

【目的】通过比较和分析2002年和2009年产CTX-M-14大肠杆菌传播分子机制的特点,推测产CTX-M-14大肠杆菌传播分子机制的演变趋势,进而为bla传播机制及其变化规律的研究提供参考。【方法】从本实验室保存的2002（4/455株）和2009年（8/329株）分离的食品动物源大肠杆菌中,筛选12株bla阳性菌株,采用PCR扩增和序列测定的方法检测超广谱β-内酰胺酶类（ESBLs）基因、PMQR基因及其它抗生素耐药基因（如rmtB和floR）;通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）以及种族系统进化关系研究分析12株细菌的亲缘关系;通过接合转移实验、复制子分型以及blaCTX-M-14上下游插入元件的检测,阐明产CTX-M-14大肠杆菌传播分子机制。【结果】12株产CTX-M-14大肠杆菌除了携带其他ESBLs编码基因,如bla和bla外,还携带其他抗生素耐药基因,如oqxA、floR、aac（6'）-Ib-cr以及rmtB。与2002年相比,2009年大肠杆菌携带耐药基因的种类和数量均较多。PFGE分型结果显示2002年4株猪源bla阳性菌株中两两具有相同的PFGE图谱;2009年2株鸭源大肠杆菌具有相同谱型,而其他来自不同养殖场的bla阳性大肠杆菌呈现各不相同的PFGE模式。这表明同一时间内不同动物间,产CTX-M-14大肠杆菌中bla的传播方式主要是水平传播,但同一养殖场内CTX-M-14仍存在克隆传播现象。种族系统进化关系研究表明4株2002年分离的菌株全部属于A组,而2009年的菌株中有4株菌属于B1组,3株属于A组,另外1株属于D组。接合转移实验发现,12株bla阳性菌株全部接合转移成功。其中,2002年的4株菌株都是bla转移,而2009年的8株菌中有4株的bla和floR或rmtB共同转移。质粒复制子分型结果表明,2002年的菌株中携带bla的质粒类型是IncF（2/4）、IncHI1（2/4）和IncN（2/4）;而2009年是IncI1（2/8）、IncK（3/8）、IncHI2（1/8）、IncF（2/8）、IncI1（1/8）。与2002年相比,2009年携带blaCTX-M-14的质粒的复制子的种类更多。插入元件检测发现,在4株2002年阳性菌株bla基因的上均检测到ISECP1,而下游均检测到了IS903,但2009年菌株除了部分在上下游都可以分别检测到ISEcp1和IS903外,还有的只能检测到上游的ISEcpI或下游的IS903。【结论】大肠杆菌中bla的传播主要是依靠水平传播,但在同一养殖场的动物间也存在着克隆传播。而水平传播的方式中,该基因多与其他耐药基因的共同转移,这就说明其他耐药基因的传播在一定程度上也会促进该基因的传播。插入元件ISECP1和IS903在CTX-M-14的水平传播中发挥着重要的作用,但是其往往会被其他的基因截断。此外,携带bla的质粒的复制子的种类越来越多。由此推测,产CTX-M-14型大肠杆菌传播分子机制正呈现多样化、复杂化的演变趋势。

关键词： CTX-M-14 传播机制复制子食品动物源

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醋酸铅诱导NRK细胞凋亡依赖caspase-3和caspase-9途径线粒体通路

醋酸铅诱导NRK细胞凋亡依赖caspase-3和caspase-9途径线粒体通路

引用

中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：贺秀媛陈渊袁莉芸袁慧鲁银魏强邓思君邬静邓立新河南农业大学牧医工程学院湖南农业大学动物医学院

铅是环境中广泛存在的一种古老的重金属毒物。肾脏是铅损伤的靶器官,进入机体后绝大多部分铅需经肾脏排泄,经肾小球滤过的铅在肾小管中可被重吸收,在肾小管上皮细胞内蓄积,对肾脏产生毒害作用,并依赖于铅暴露的剂量而导致细胞凋亡或死... 详细信息

铅是环境中广泛存在的一种古老的重金属毒物。肾脏是铅损伤的靶器官,进入机体后绝大多部分铅需经肾脏排泄,经肾小球滤过的铅在肾小管中可被重吸收,在肾小管上皮细胞内蓄积,对肾脏产生毒害作用,并依赖于铅暴露的剂量而导致细胞凋亡或死亡。近年来,关于铅致肾细胞凋亡机理的研究已成为国内外研究的热点。【目的】为探讨醋酸铅诱导体外培养大鼠肾小管上皮细胞凋亡的作用,并揭示其凋亡通路,为阐明醋酸铅的肾脏毒性作用及机制,进一步研制和开发治疗和控制动物铅中毒的靶药物提供理论依据。【方法】以体外培养的大鼠肾小管上皮细胞系NRK为细胞模型,经终浓度分别为0,0.5,1.0,2.0μmol/L的醋酸铅溶液作用12 h后,采用MTT法检测不同剂量的醋酸铅对其增殖的抑制率;通过Hoechst33342和Annexin V-FITC/PI双染法检测醋酸铅引起的NRK凋亡;用罗丹明123检测线粒体膜电位变化;用分光光度法、western blot分别检测caspase-3和caspase-9的活性及其蛋白的表达,以及caspase广谱抑制剂和caspase-9的抑制剂（Z-VAD-FMK和Ac-LEHD-FMK）对醋酸铅诱导细胞凋亡的抑制作用。【结果】不同浓度的醋酸铅的处理,均可抑制NRK细胞的生长,各染毒组与对照组相比均差异极显著（P<0.01）,且醋酸铅对细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量-效应依赖性。醋酸铅对NRK的IC为（2.44±0.32）μmol/L;所有剂量的醋酸铅均极显著降低了线粒体膜电位（P<0.01）,并呈现剂量相关性;Hoechst 33342凋亡检测表明,随着醋酸铅浓度的升高,细胞凋亡现象越明显;流式细胞术检测结果显示,细胞凋亡率出现明显变化,与对照组相比差异显著或极显著（P<0.05,P<0.01）,分别为4.2%,13.6%,26.0%和47.6%,呈现剂量相关性;而细胞坏死率差异不显著,从1.1%到2.7%之间,凋亡率的变化与Hoechst 33342检测结果相符;随着剂量增加,active-Caspase3的表达逐渐增多,且与醋酸铅浓度呈剂量依赖性;与对照组相比,染铅组pro-caspase-9的表达逐渐降低,而active-caspase-9的表达则明显增强,且与醋酸铅浓度呈明显的剂量-效应关系。因此,可以证明醋酸铅可以激活Caspase3和9,呈剂量依赖性;NRK细胞经caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK和caspase-9抑制剂Ac-LEHD-FMK预处理1h后,明显降低了细胞凋亡率,提高了活细胞的比例,凋亡率分别由23.7%降低到12.4%和16.2%,活细胞数量由74.4%显著提高到82.4%和86.2%。因此,广谱抑制剂Z-VAD-FMK抑制凋亡的能力强于caspase-9抑制剂。这一结果也进一步证明了醋酸铅诱导凋亡的作用与caspase的激活有紧密联系。但是仅仅是降低了凋亡率,并未大幅抑制凋亡。由此推测,在醋酸铅诱导凋亡过程中,应该还存在非依赖caspase途径。【结论】醋酸铅可抑制NRK细胞增殖,降低线粒体膜电位,破坏细胞膜的完整性,激活caspase-9和caspase-3,启动caspase级联反应,引发caspase依赖性的线粒体凋亡通路诱导NRK细胞凋亡。

关键词：醋酸铅肾小管上皮细胞凋亡线粒体通路

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谷胱甘肽S-转移酶A1对结肠癌细胞凋亡的影响

谷胱甘肽S-转移酶A1对结肠癌细胞凋亡的影响

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中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：李蕊李睿张秀英东北农业大学动物医学院

【目的】谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是一组多功能Ⅱ相药物代谢酶。有研究表明,GSTs的过表达与化疗耐药性的产生密切相关,细胞可通过表达GSTs而保护自身免受化疗药物的损害,从而降低化疗药物疗效,这一现象已成为肿瘤治疗过程中重要的难题之... 详细信息

【目的】谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是一组多功能Ⅱ相药物代谢酶。有研究表明,GSTs的过表达与化疗耐药性的产生密切相关,细胞可通过表达GSTs而保护自身免受化疗药物的损害,从而降低化疗药物疗效,这一现象已成为肿瘤治疗过程中重要的难题之一。GSTA1是GSTs家族中一个非常重要的亚型,对GSTAl表达调节及其在癌细胞中凋亡作用的研究具有重要的意义。神经酰胺是细胞内重要的脂质第二信使,可介导多种细胞生物学效应,能诱导多种胂瘤细胞发生凋亡。本研究以神经酰胺作为调节GSTA1表达和诱导细胞凋亡的工具,用于揭示GSTA1对结肠癌细胞凋亡的影响,对于阐明GSTA1与癌细胞凋亡及化疗耐药性之间的关系具有重要意义,研究结果可用于指导临床合理用药,提高化疗药物治疗效果和降低耐药性的产生。【方法】以结肠癌细胞株Caco-2和HT-29为试验对象,首先采用western blot和real-time PCR法检测了外源性具有渗透性的神经酰胺类似物(C2-神经酰胺)处理对GSTA1蛋白和mRNA表达的影响,以雄烯二酮(androstenedione)为底物测定神经酰胺处理对GSTA1活性的影响。再以western blot和real-time PCR检测凋亡效应分子caspase-3的激活和凋亡调节因子Bcl-2家族表达情况,以评价神经酰胺对细胞凋亡的影响。采用MTS法检测了C2-神经酰胺对细胞增殖和毒性的影响。最后,采用RNA干扰技术使Caco-2细胞中GSTA 1表达沉默或将含有GSTA 1的质粒转染HT-29细胞使GSTA 1过表达,通过改变细胞中GSTA1含量来双向验证GSTA1沉默或过表达对神经酰胺介导的细胞凋亡的影响。【结果】研究结果表明,神经酰胺处理后,Caco-2细胞中GSTA1蛋白、mRNA表达及酶活性分别升高了1.850、3.093和1.964倍,与对照组比较差异显著(p<0.01或p<0.001),而在HT-29细胞中未能检测到GSTA1蛋白和mRNA的表达,提示两种细胞系中GSTA1的表达存在明显著异。神经酰胺处理不能诱导Caco-2细胞中激活型caspase-3蛋白的表达,同时抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax mRNA表达均无明显变化(P>0.05),而神经酰胺处理HT-29细胞后,与对照组相比较,处理组激活型caspase-3蛋白表达增加了7.142倍(P466倍(P<0.001),Bax mRNA表达升高5.938倍(P<0.001),提示神经酰胺可诱导HT-29细胞凋亡,但不诱导Caco-2细胞凋亡。随着神经酰胺处理时间的延长,处理组中Caco-2细胞数量基本保持恒定,而对照组细胞数量持续增加,表明神经酰胺可以抑制细胞的增殖,而HT-29细胞的数量随着处理时间的延长而逐渐减少,表明神经酰胺对HT-29细胞具有一定的细胞毒性。用神经酰胺处理GSTA1 siRNA转染后的Caco-2细胞,在siRNA转染组中GSTA1的沉默并未增加激活型caspase-3蛋白表达。用神经酰胺处理GSTA1质粒转染后的HT-29细胞,质粒转染组中GSTA1的过表达并未减少激活型caspase-3蛋白表达,表明GSTA1沉默或过表达对神经酰胺介导的细胞凋亡无影响。【结论】以上结果提示GSTA1不能保护结肠癌细胞免受由神经酰胺引起的凋亡。

关键词：谷胱甘肽S-转移酶A1 结肠癌细胞凋亡神经酰胺

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饲料中常见霉菌毒素对猪肾细胞(PK15)的联合毒性研究

饲料中常见霉菌毒素对猪肾细胞(PK15)的联合毒性研究

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中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：雷明彦张妮娅齐德生华中农业大学动物科技学院

【目的】由于饲料中霉菌毒素的联合污染,对养殖业造成巨大危害,因而,研究饲料中常见的霉菌毒素的联合毒性具有重大意义。本试验采用传代细胞(猪肾细胞PK15)培养的方法,研究黄曲霉素毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、呕吐毒素(DON)和伏... 详细信息

【目的】由于饲料中霉菌毒素的联合污染,对养殖业造成巨大危害,因而,研究饲料中常见的霉菌毒素的联合毒性具有重大意义。本试验采用传代细胞(猪肾细胞PK15)培养的方法,研究黄曲霉素毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、呕吐毒素(DON)和伏马菌素BI(FB1)对其的联合毒性。【方法】采用MTT法研究单一和多种霉菌毒素对PK15的细胞毒性;同时测定细胞上清液中乳酸钠脱氢酶(LDH)的释放率来判断霉菌毒素对细胞膜的损伤情况;采用中心组合设计和SAS逐步回归拟合出回归方程,判定联合作用类型:活性氧(ROS)测定采用检测试剂盒进行测定;细胞凋亡采用流式细胞术进行检测。【结果】(1)单一霉菌毒素对PK15的细胞毒性:PK15与霉菌毒素孵育48h后,AFB1、ZEA、DON的EC50分别为26.9μM、121.8μM、3.6μM;EC30分别为38.8μM、86.6μM、1.8μM;(0-250μM)FB1与细胞孵育48h后,细胞活力基本保持在70%以上,故无法求出其EC50;(2)单一霉菌毒素(24H处理)对PK15细胞膜损伤的影响:细胞LDH相对释放率为150%时,AFB1、ZEA、DON对应的浓度分别为:79.5μM、100.5μM、3.3μM;细胞LDH相对释放率为130%时,AFB1、ZEA、DON对应的浓度分别为:24.9μM、84.2μM、2.4μM。(3)根据中心组合设计,由拟合的方程可得出:在联合暴露48h后,AFB1和ZEA、ZEA和DON对PK15的毒性表现为协同效应;同时AFB1和FB1联合作用之后,仅表现为AFB1的细胞毒性;但当AFB1、ZEA和DON三者联合作用24h后,AFB1和ZEA两者间表现为拮抗效应;(4)两者联合的条件下,ZEA能减弱由低浓度(1μM)AFB1引起的细胞膜损伤;在低浓度ZEA(10μM)或DON(1μM)的条件下,随着AFB1浓度的增加,细胞膜损伤显著增加;(5)AFB1、DON都能引起细胞氧化应激,而ZEA(10-40μM)对细胞的氧化应激没有影响;在低浓度(1μM)AFB1或1-4μM DON条件下,ZEA能缓解两者诱导的氧化应激;在低浓度DON或ZEA的条件下,随着AFB1浓度的增加,细胞氧化应激加剧,并且DON+AFB1和ZEA+AFB1呈现协同或加型效应;(6)AFB1、DON都能引起细胞凋亡,而ZEA(10-40μM)对细胞凋亡没有影响;低浓度ZEA能缓解(1,5μM)AFB1诱导的细胞凋亡,且主要体现在减少早期凋亡的细胞数量;在低浓度AFB1的条件下,高浓度(40μM)ZEA能显著增加晚期凋亡的细胞数量,表现为协同效应;AFB1和DON的联合能加剧细胞的凋亡。【结论】结合MTT和LDH释放率的结果,霉菌毒素对PK15的毒性依次为:DON>AFB1>ZEA>FB1。在本试验条件下,AFB1和ZEA、ZEA和DON对PK15的毒性表现为协同效应;但是在DON存在的条件下,AFB1和ZEA表现为拮抗效应。在致氧化损伤方面,ZEA能缓解由低浓度AFB1或DON引起的氧化损伤,AFB1+DON和AFB1+ZEA呈现协同或加型效应。在致细胞凋亡方面,低浓度ZEA能缓解AFB1的凋亡效应,而高浓度ZEA与AFB1之间体现协同效应;AFB1和DON的联合能加剧细胞的凋亡。

关键词：黄曲霉素毒素B1 玉米赤霉烯酮呕吐毒素猪肾细胞联合毒性

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氨基化磁性纳米粒子分析饲料中有机砷的研究

氨基化磁性纳米粒子分析饲料中有机砷的研究

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中国毒理学会兽医毒理学与饲料毒理学学术讨论会暨兽医毒理专业委员会第4次全国代表大会会议

作者：王培龙李燃苏晓鸥朱若华中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所首都师范大学化学系

【目的】有机胂作为饲料添加剂,有洛克沙胂、阿散酸、对羟基苯胂酸、对硝基苯胂酸、酰胺基苯胂酸等（见图1）。其中,3-硝基-4-羟基-苯胂酸（Roxarsone,ROX）与对氨基苯胂酸（p-ArsanilicAcid,p-ASA）。这两种有机胂饲料添加药物在世界... 详细信息

【目的】有机胂作为饲料添加剂,有洛克沙胂、阿散酸、对羟基苯胂酸、对硝基苯胂酸、酰胺基苯胂酸等（见图1）。其中,3-硝基-4-羟基-苯胂酸（Roxarsone,ROX）与对氨基苯胂酸（p-ArsanilicAcid,p-ASA）。这两种有机胂饲料添加药物在世界各国广泛使用。美国食品和药品管理局（FDA）最甲于1964年允许洛克沙胂用于鸡饲料,1983年正式批准用作猪鸡的促生长剂。我国农业部1996年批准了有机胂制剂的使用,随后我国逐渐开始大量生产,并广泛用于畜禽饲养业。虽然有机胂对于畜牧业的发展具有重要意义,但是有机胂也具有一定的毒性,过量的添加可使动物中枢神经系统失调,使脑病和视神经萎缩的发病率升高。而且有机胂在饲料加工、储存和运输过程可能降解为其它砷化合物,对动物产生毒害作用,同时威胁人体健康。因此为了监控有机胂的使用和潜在危害性,有必要建立准确可靠的检测方法。目前,国外对ROX和p-ASA的研究主要集中在毒理、生理、代谢和环境影响等方面。而检测方法的研究相对较少,Weston等建立了气相色谱火焰离子检测器测定P-ASA的方法,但ROX对p-ASA的测定有干扰。Pergantis等建立了HPLC-ICP-MS测定ROX的方法。Pergantis等研究建立了μ-HPLC-ICP-MS测定ROX和p-ASA及其它有机胂的方法,因无合适的前处理方法,ROX的色谱峰的峰形较著,有较为严重的拖尾。【方法】将FeO纳米粒子进行氨基化,利用氢键作用力可以提高FeO纳米粒子对苯胂酸的吸附性能。本项研究考查了有机相还原法及无机相共沉淀法在磁性FeO纳米粒子合成过程中的应用,利用硅烷基化试剂和氨基化试剂对表面进行氨基化修饰,应用透射电镜对材料进行了表征（见图2）。利用合成的材料以及五种苯胂酸的标准液进行性能实验,氨基化修饰的磁性FeO纳米粒子在5min内对五种苯胂酸实现较好的吸附,吸附率达100%,最小吸附浓度达到0.5ng/g,最大吸附量为0.9mg/g。用二次蒸馏水经30min可以实现较完全的洗脱,富集倍数可达250倍。在吸附苯胂酸的过程当中,氨基化修饰的磁性FeO纳米粒子具有较好的抗干扰能力,在13种金属离子及3种有机结构类似物存在的情况下,吸附效果影响不大。实验结果表明氨基化磁性FeO纳米粒子对五种苯胂酸均具有较好的富集能力。【结果】对样品处理的方法进行了探讨,最终确定以甲醇为萃取剂,以超声提取为萃取方法,以90min为萃取时间分二步进行萃取的萃取程序。提取的样品经氮基化纳米粒子富集后,结合原子吸收分光光度法对鸡饲料样品中的苯砷酸含量进行检测,线性范围为10-200ng/mL,检出限在1ng/mL左右,对五种苯胂酸的标准溶液平行测定五次,RSD均在3%左右。鸡饲料样品中苯胂酸加标回收率实验结果为在加标量20ng及50ng时回收率在95%左右,加标量在5ng时回收率在70%以上。利用高效液相色谱-质谱法联用技术测定鸡饲料样品中的苯胂酸。使用BEHC18色谱柱,利用乙腈和0.1%的甲酸为流动相,在6min内实现了五种苯胂酸的分离,分离效果较好,线性范围为0.5ng/mL-10ng/mL,相关系数为0.99。比较了氨基化磁性Fe3O4纳米粒子与常规SPE对样品处理的效果,结果表明合成的材料可以极大地净化样品,用此方法对鸡饲料样品进行加标回收率实验,加标量为0.5ng/g,加标回收率在80%-120%之间。【结论】因苯胂酸的极性较强,pKa值差异较大,通过常规的阴阳离子交换固相萃取柱难以进行净化。本项研究通过氨基化修饰FeO,获得功能化磁性纳米离子,对5种苯胂酸具有较好的选择性吸附和净化能力。

关键词：氨基化修饰磁性纳米粒子有机胂液相色谱-串联质谱

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