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UPLC-MS-MS法测定血浆中FD浓度及在Beagle犬体内的毒代动力学研究

UPLC-MS-MS法测定血浆中FD浓度及在Beagle犬体内的毒代动力学研究

引用

中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者：凌珊谢瑞吴家欣孙晶晶广州医药研究总院有限公司药物非临床评价研究中心

目的 FD是一种天然植物干燥茎块的提取物,目前作为抗肿瘤药物被广泛研究。研究表明其有良好的抗病毒、抗癌作用,尤其对体外培养的多种肿瘤细胞具有很强的抑制和杀伤效应,可诱导肿瘤细胞凋亡并具有抗血管生成作用,同时该药存在抗炎和保... 详细信息

目的 FD是一种天然植物干燥茎块的提取物,目前作为抗肿瘤药物被广泛研究。研究表明其有良好的抗病毒、抗癌作用,尤其对体外培养的多种肿瘤细胞具有很强的抑制和杀伤效应,可诱导肿瘤细胞凋亡并具有抗血管生成作用,同时该药存在抗炎和保肝作用。但其毒代动力学研究未见报道,且由于其水溶性较低,吸收不佳,故目前常采用静脉注射、静脉滴注的方式给药。本研究探索建立UPLC-MS-MS方法测定beagle犬血浆中FD含量,研究FD在Beagle犬体内单次给药的毒代动力学特征,为临床合理用药提供参考。方法选取Beagle犬24只,随机分为阴性对照组和低、中、高注射用FD组,以静脉滴注方式给药,血浆样品采用UPLC-MS-MS方法测定FD浓度,并用DAS计算毒代动力学参数。结果建立了专属、准确、灵敏的UPLC-MS/MS检测方法。仪器系统采用Waters ICLASS/XEVO TQ型液相色谱质谱联用及其UNIFI工作站,UPLC BEH反相C18超高效色谱柱(1.7μm,2.1x100mm),以0.25%甲酸溶液-甲醇为流动相,离子通道:呋喃二烯217.10>149.10 15ev ESI+;莪术二酮237.25>135.05 16ev ESI+。FD血浓度线性范围为15.6～5000 ng/ml,得标准曲线回归方程Y=0.00009X-0.002(R2=0.9991,n=5);批间和批内精密度均RSD<15%;准确度在85%～115%。FD给药后血药浓度-时间曲线符合二室模型,低、中、高剂量的毒代动力学参数为:t1/2分别为(40.86±26.24)min、(52.52±32.95)min、(91.63±55.83) min;达峰浓度Cmax分别为(657.78±228.95) ng/ml、(1367.31±294.57) ng/ml、(4757.097±2838.747) ng/ml;AUC(0-t)分别为(39075.007±15023.597) min·ng/ml、(70908.807±19064.207) min·ng/ml、(246668.227±119314.45)min·ng/ml,AUC(0-∞)分别为(41694.17±17006.93) min·ng/ml、(73188.93±20698.05)min·ng/ml、(252364.19±122852.58)min·ng/ml,平均滞留时间为(55.59±5.93)、(56.15±12.51)、(55.59±5.93)min,总清除率分别为(0.111±0.067)、(0.112±0.039)、(0.068±0.025)kg·L/mL。结论本方法稳定、准确且重现性好,满足FD的血浆药物浓度测定及毒代动力学研究的需要;而FD在Beagle犬体内消除较快,滞留时间短,基本分布于体液,而毒性剂量下,其Cmax和AUC与低中浓度不成线性关系,t1/2和总清除率也发生了变化,可见在毒性剂量下FD会对体内药物代谢造成影响,机制仍需进一步研究。

关键词： FD UPLC-MS-MS 毒代动力学 Beagle犬

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太赫兹波辐射对原代海马神经元的影响研究

太赫兹波辐射对原代海马神经元的影响研究

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中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者：赵黎伊如汉董霁迟云亮谭胜芝王浩宇王惠张静彭瑞云军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所

目的:太赫兹波是位于微波和红外线之间的一种电磁辐射,频率范围在0.1 THz-10 THz,相应的波长在0.03 mm-3 mm之间。大量研究表明,神经系统是电磁辐射的敏感靶标之一,海马作为行为和学习记忆功能的重要脑区,与行为认知的形成密切相关。神... 详细信息

目的:太赫兹波是位于微波和红外线之间的一种电磁辐射,频率范围在0.1 THz-10 THz,相应的波长在0.03 mm-3 mm之间。大量研究表明,神经系统是电磁辐射的敏感靶标之一,海马作为行为和学习记忆功能的重要脑区,与行为认知的形成密切相关。神经元是脑结构和功能的基本单位,具有接受、整合和传递信息的功能。但目前太赫兹波对神经元的效应研究缺乏。因此,本研究探讨太赫兹波辐射对原代海马神经元结构和功能的影响,为太赫兹波辐射生物效应研究提供依据,并为其调控机制研究奠定基础。方法:分离培养乳鼠原代海马神经元,采用Microtech太赫兹波照射系统进行细胞辐射;太赫兹波频率及输出功率为0.12 THz/10 m W,辐射时间为30 min,将原代海马神经元随机分为假辐射组和10 mW组,假辐射组进行同等条件下的伪辐射。于辐射后即刻进行细胞收集,采用CCK8法检测神经元活力、透射电镜观察神经元超微结构、流式细胞仪检测神经元凋亡、高效液相色谱检测神经元氨基酸类神经递质含量、免疫荧光法检测神经元PSD95蛋白表达。结果:(1)原代海马神经元细胞活力改变:与假辐射组相比, 10 m W组细胞活力于辐射后即刻明显下降(P<0.05)。(2)原代海马神经元超微结构改变:假辐射组神经元胞核染色质均匀,XX等细胞器完整,结构基本正常,偶见线粒体嵴断裂;10 mW组胞核染色质均匀,线粒体肿胀、嵴断裂、空化,内质网肿胀,胞浆中溶酶体明显增多。(3)原代海马神经元细胞凋亡率变化:与假辐射组相比,10 mW组原代海马神经元凋亡率于辐射后即刻明显增加(P<0.01)。(4)原代海马神经元氨基酸类神经递质含量变化:与假辐射组相比,10mW组Glu和Gly含量明显增加(P<0.05或P<0.01);Ser和Phe含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。(5)原代海马神经元PSD95蛋白改变:假辐射组和10 mW组于辐射后即刻神经元的胞浆中PSD95均呈强绿色荧光,与假辐射组相比,10 mW组PSD95表达未见明显改变。结论:0.12 THz/10 m W太赫兹波辐射可引起乳鼠原代海马神经元结构损伤、活力下降、凋亡增加及神经递质代谢紊乱,提示该辐射剂量条件下太赫兹波可造成神经元损伤。

关键词：太赫兹波乳鼠海马原代神经元结构与功能 PSD95

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线粒体膜心磷脂参与调节Drp1靶向干预介导肝癌细胞转归的体外试验研究

线粒体膜心磷脂参与调节Drp1靶向干预介导肝癌细胞转归的体外试验...

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中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者：车琳郭倪君黄婧潘虹黎思鹏喻文鳌许林林忠宁林育纯分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室厦门大学公共卫生学院

目的线粒体膜心磷脂(CL)作为新的脂质信号,线粒体动力相关蛋白1(Drp1)作为线粒体动态中线粒体分裂的关键因子,二者在线粒体定位和分布均对细胞能量代谢、线粒体动力学和凋亡等起关键作用,特别是二者之间蛋白质-脂质关联性参与线粒体质... 详细信息

目的线粒体膜心磷脂(CL)作为新的脂质信号,线粒体动力相关蛋白1(Drp1)作为线粒体动态中线粒体分裂的关键因子,二者在线粒体定位和分布均对细胞能量代谢、线粒体动力学和凋亡等起关键作用,特别是二者之间蛋白质-脂质关联性参与线粒体质量控制(MQC)等调控的分子机制尚待阐明。本研究旨在探讨线粒体CL外化与Drp1互作调控线粒体自噬对肝癌细胞转归的影响。方法采用生物信息学分析TCGA数据库中肝细胞癌(HCC)病人癌和癌旁组织RNA-seq数据中Drp1编码基因(DNM1L)的转录水平,Kaplan-Meier生存分析其与病人生存期的关联性。体外试验采用人肝癌HepG2、MHCC97H细胞,并给予Mdivi-1或si DNM1L建立Drp1抑制模型,以及Mdivi-1联合CCCP处理建立线粒体自噬干预模型;qPCR检测DNM1L mRNA水平;透射电镜(TEM)观察线粒体结构;心磷脂探针(NAO)、TOM20和LC3B抗体的免疫荧光(IF)染色观察共定位分布;蛋白免疫印迹(WB)检测Drp1和细胞周期相关蛋白水平;流式细胞术检测细胞周期。结果数据库分析,与癌旁组织相比,HCC病例肿瘤组织中DNM1L mRNA水平显著上调;且肿瘤组织中DNM1L高表达(n=65)患者的5年总体生存率显著低于DNM1L低表达(n=65)患者(P<0.05)。与人正常肝L02和QSG7701细胞相比,HCC细胞中DNM1L m RNA水平高表达(P<0.05);TEM观察和半定量分析显示HCC细胞株中线粒体数目明显减少(P<0.05)。体外试验中,Mdivi-1或si DNM1L处理组HepG2、MHCC97H细胞中Drp1、CDK2和Cyclin E1蛋白水平均降低(P<0.05)。CCCP处理组HepG2和MHCC97H细胞中线粒体碎片化和CL外化增加,NAO、TOM20和LC3B共定位增强;Mdivi-1联合CCCP干预组细胞中Drp1和LC3B蛋白降低、p62蛋白升高,线粒体碎片化和CL外化减少,三者共定位减弱。结论 DNM1L基因(Drp1)高表达与肝细胞致癌和HCC患者预后有关;靶向Drp1干预经由调节HCC细胞周期和线粒体自噬影响细胞转归,与线粒体膜CL外化参与Drp1的互作和在线粒体的定位分布有关;为肝致癌过程中CL代谢通路的调控机制及其靶向干预提供新思路。

关键词：心磷脂(CL) 线粒体质量控制 Drp1 肝细胞癌线粒体自噬

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喹噁啉类原型及其主要代谢物的遗传毒性研究

喹噁啉类原型及其主要代谢物的遗传毒性研究

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中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者：刘倩莹雷志鑫罗讯 Ihsan Awais 刘相莲戴梦红郝海红王旭袁宗辉国家兽药残留基准实验室(HZAU)/农业部兽药残留检测重点实验室/农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室(武汉)华中农业大学动物医学院

目的喹噁啉类药物是一类具有广谱抗菌促生长作用的化合物,主要品种有卡巴氧,喹乙醇,乙酰甲喹,喹烯酮和喹赛多。喹噁啉类化合物母环结构中的氮氧基团还原是该类化合物的只要代谢方式。尽管其遗传毒性的研究已开展多年,但研究的关注点主... 详细信息

目的喹噁啉类药物是一类具有广谱抗菌促生长作用的化合物,主要品种有卡巴氧,喹乙醇,乙酰甲喹,喹烯酮和喹赛多。喹噁啉类化合物母环结构中的氮氧基团还原是该类化合物的只要代谢方式。尽管其遗传毒性的研究已开展多年,但研究的关注点主要在原型药物上,无法证实遗传毒性与原型和代谢物之间的关系。另外,对于喹噁啉类代谢物的遗传毒性机制也尚不甚清楚。基于此,我们依据农业部《新兽药特殊毒性试验方法》和美国FDA要求,开展了喹噁啉类原型及其主要N-O基团还原代谢物的遗传毒性研究。方法采用四项遗传毒性组合实验,即小鼠淋巴瘤细胞基因突变实验,鼠伤寒沙门氏菌基因突变试验,体外染色体畸变实验,体内小鼠骨髓微核试验,对喹噁啉类的主要6个N-O基团还原的代谢物进行了遗传毒性研究。采用小鼠淋巴瘤细胞基因突变实验对喹噁啉类的5个原型进行了遗传毒性评价。结果 N1脱氧乙酰甲喹,脱二氧乙酰甲喹和脱二氧卡巴氧除在鼠伤寒沙门氏菌基因突变试验中为阴性外,在其余的三个遗传毒性实验中均为阳性,且其遗传毒性大小与原型一致,即为N1脱氧乙酰甲喹>脱二氧乙酰甲喹>脱二氧卡巴氧。脱二氧喹乙醇,N1脱氧喹烯酮,N4脱氧喹烯酮在四项遗传毒性试验中均为阴性。喹噁啉类原型在小鼠淋巴瘤细胞基因突变实验均为阴性。结论喹赛多不具有致突变作用。乙酰甲喹和卡巴氧的遗传毒性是由原形及其代谢物共同引起,表明了喹噁啉类的代谢物在其遗传毒性中发挥了重要作用。因此,对其代谢物的遗传毒性应高度关注。鉴于喹噁啉类具有相同的母环结构,推测侧链的差异是该类化合物的遗传毒性产生的主导因素。本研究从代谢物的角度阐释了喹噁啉类的遗传毒性机制,表明了喹噁啉类的代谢物在其遗传毒性中发挥了重要作用,因此需谨慎对待喹噁啉类药物临床使用的安全问题。

关键词：喹噁啉类代谢物毒性机制基因突变喹噁啉类药物乙酰甲喹

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The role of Nrf2 in hepatocytes and macrophages in the regulation of liver fibrosis

The role of Nrf2 in hepatocytes and macrophages in the regul...

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中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者：王惠惠吕航李璐朱佳玉陈艳楠富景奇徐苑苑皮静波中国医科大学公共卫生学院

Nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) is a key transcription factor that regulate oxidative/xenobiotic stress response and inflammation. Loss of Nrf2 expression aggravates liver to toxin-induced fibrosis and hepatocellular carcinoma in mice, the underlying mechanisms remainunclear. To investigate the anti-fibrogenic functions of Nrf2 in hepatocytes and macrophages,mice lacking Nrf2 in hepatocytes (Nrf2loxp/loxp Alb Cre, L-KO) or macrophages(Nrf2loxp/loxp Lys2Cre, M?-KO) were generated to evaluate hepatic fibrogenic response to carbon tetrachloride (CCl4). Furthermore, primary hepatocytes isolated from L-KO mice were used to reveal related mechanism. As data shown, hepatocyte Nrf2 deficiency mice showed sever liver fibrosis characterized by increased collagen deposition, myofibroblast content accumulation along with elevated liver Ctgf and Timp1 gene expression with long-term repeat CCl4 treatment. L-KO mice displayed aggravated liver injury, elevated lipid peroxidation and inflammatory response after a single treatment of CCl4. While, no difference of liver fibrosis and liver injury were observed in macrophage Nrf2 deficiency mice after repeat and single CCl4 treatment. The L-KO mice livers displayed increased macrophage infiltration accompanied with elevated Tnf-α, Il-6, Il-1βand Ccl2 expression. Primary hepatocytes isolated from L-KO mice showed increased Ccl2expression, indicating Nrf2 in hepatocytes negatively regulates Ccl2-recruited macrophage infiltration during fibrogenic process. These data identify the anti-fibrogenic roles of Nrf2 in hepatocyte rather than in macrophage.

关键词： Liver fibrosis Nrf2 inflammatory response chemokine

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Application of local lymph node assay(BrdU-ELISA) in the detection of 25% cyhalofop-butyl EC skin sensitization in Mice

Application of local lymph node assay(BrdU-ELISA) in the det...

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中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者： QIN Heng CHENG Jie JIN Su-xiang QIAN Wen ZHANG Wan YAN Ting DONG Hao ZHANG Cheng-xiang ZHANG Lu-lu WANG Yu-bang HUAN Fei The Safety Assessment and Research Center for Drugs of Jiangsu Province School of Public Health Nanjing Medical University

Objective To detect 25%cyhalofop-butyl EC skin sensitization with local lymph node assay (BrdU-ELISA) in Mice. Methods The female BALB/C mice were tested and the samples were set up to 100%, 50%, 25%, and the negative control group (olive oil and AOO) and the positive control group (25%basal cinnamaldehyde) were set up. Test sample were laid on thedorsum of the bilateral mice ears for three consecutive days;then the mice received an intraperitoneal injection of BrdU (5 mg/mouse) on the Sixth day;after 24 hours, the lymph nodes of the mice were removed and weighted, then made into cell suspension, the lymphcell proliferation was measured with BrdU-ELISA method. Results The body weights for female mice for all treated groups are not different from the control group. The increase of ear thickness and ear weight in each dose group was not more than 25%. The stimulus indexes of solvent and blank control groups were SI1 and SI2<1.6, and the stimulus indexes of positive control group(25%hexyl cinnamaldehyde) were SI1 and SI2>1.6, and the test system was reliable. The stimulation indexes of 25%cyhalofop-butyl EC with low, medium and high dose groups were SI1and SI2<1.6, and there was no dose-response relationship. Conclusions The results of 25%cyhalofop-butyl EC in the local lymph nodes assay of mice were negative, that is, 25%cyhalofopbutyl EC has no sensitization.

关键词： BALB/C mouse BrdU Skinsensitization

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A Meta-analysis About CircRNAAs the Biomarker of Gastric Cancer

A Meta-analysis About CircRNAAs the Biomarker of Gastric Can...

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中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者： Fei Jiang Fanglan Hong Xiaobing Shen Key Laboratory of Environmental Medical Engineering and Education Ministry Nanjing Public Health College Southeast University Department of Preventive Medicine Nanjing Public Health College Southeast University

Background:Gastric cancer was a malignant tumor in the world with the fifth incidence and third mortality and circRNA has close connect with it. however, it’s not clear how circRNA affects the gastric cancer. We performed a systematic review and meta-analysis to evaluate the relationship between circRNA and gastric cancer, aiming to identify circRNA can be used as a biomarker for the diagnosis of gastric ***:We conducted a comprehensive search of PubMed, Web of Science and Embase for published experimental studies about circRNA as a diagnostic biomarker for gastric cancer from 2013 to June 2018. Two investigators independently reviewed the included studies and extracted relevant data. Sensitivity, specificity,area under curve (AUC), positive likelihood ratios, negative likelihood ratios, and diagnostic OR (DOR) were calculated to evaluate the diagnostic efficacy by STATA 12.0. The credibility is expressed in 95%confidence intervals (95%CI). Q Test and I2 are used for heterogeneity test, and subgroup analysis is performed at the same ***:Our final analysis included 11 studies,including 12 kinds of circRNAs, 11 in tissues, 5 in plasma, and all down regulated. Their pooled sensitivity, specificity, positive likelihood ratios, negative likelihood ratios, diagnostic OR and AUC with their 95%confidential intervals (95%CIs) were 0.713 [0.630, 0.784], 0.779 [0.701,0.842], 3.232 [2.463, 4.242], 0.368 [0.292, 0.463], 8.778 [6.108, 12.614] and 0.81 [0.78, 0.84]respectively. Subgroup analysis revealed that the sensitivity, specificity, positive likelihood ratios,diagnostic OR and AUC of circRNAs in plasm were higher than tissues but negative likelihood ratios. It’s also same in subgroup with different sample sizes (more than 100 and less than 100).The heterogeneity of the literatures was mainly due to the different backgrounds of gastric cancerand the differences in experimental design and operation process. And the Deeks’ funnel map revealed there was no ob

关键词： A Meta-analysis About CircRNAAs the Biomarker of Gastric Cancer

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An Association Study between Polymorphisms of Encoding miRNA Genes and Telomere Length in omethoate–exposure Workers

An Association Study between Polymorphisms of Encoding miRNA...

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中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者： Hui Zhang Wei Wang Department of Occupational and Environmental Health College of Public Health Zhengzhou University

Objective The aim of the present study was to assess the correlation between polymorphisms of encoding miRNA genes and telomere length in omethoate–exposure *** 180 omethoate–exposure workers with working hours of more than 8 years and 115healthy controls were recruited in the study. Genotyping for the selected single nucleotidepolymorphisms loci were performed using the flight mass spectrometry. Real-time fluorescent quantitative PCR method was applied to determine the relative telomere length in human peripheral blood leukocytes *** After adjusting the covariate of affecting relative telomere length, covariance analysis showed that the female was significantly longer than that of the male in control group(P<0.046).For the miR-145 rs353291 locus, this study found that relative telomere length of mutation homozygous AG+GG individuals (3.58±0.62) was longer than that of wild homozygous AA(3.38±0.61) in the exposure group (P=0.039). In the control group, the relative telomere length of wild homozygous TT genotype (3.08±0.38) for miR-30a rs2222722 polymorphism locus was longer than that of the mutation homozygous CC genotype (2.91±0.30)(P=0.038). For the miR-145 rs353291 polymorphism locus, the relative telomere length showed an increasing trend along with the order of genotype AA, AG+GG in the exposure group(Ptrend=0.039). For the miR-30a rs111456995 polymorphism locus, the relative telomere length showed an increasing trend according with the order of-/-,-/T and TT in the control group (Ptrend=0.026). After multiple linear regression analysis, the independent variables of entering into the model were omethoate–exposure (b=0.562, P <0.001), miR-145 rs353291 (AG+GG)(b=0.205, P=0.010).Conclusions The results suggest that individual carrying AG+GG genotypes in miR-145 gene rs353291 polymorphism were susceptible to make prolong of telomere length induced in omethoate–exposure.

关键词： An Association Study between Polymorphisms of Encoding miRNA Genes and Telomere Length in omethoate exposure Workers miRNA

来源：评论

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The mechanism study on silica nanoparticles-induced blood hypercoagulable state and thrombus formation

The mechanism study on silica nanoparticles-induced blood hy...

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中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者： Junchao Duan Yang Yu Yang Li Yanbo Li Xianqing Zhou Zhiwei Sun Department of Toxicology and Sanitary Chemistry School of Public Health Capital Medical University Beijing Key Laboratory of Environmental Toxicology Capital Medical University

Silica nanoparticles (Si NPs) are widely applied in food sciences, industry and biomedicine, which greatly increase the human exposure and potential health risk. However, the effect of Si NPs on circulation system, especially on thrombus formation was largely *** study was aimed to explore the adverse effect of Si NPs on thrombus formation, and to elucidate the underlying mechanisms in zebrafish (Danio rerio). Using transgenic lines,Tg(mpo:GFP) and Tg(fli-1:EGFP) zebrafish, the activation of neutrophils-mediated inflammation and impairment of vascular endothelium were detected in caudal vein of zebrafish induced by Si NPs. The blood flow and blood velocity decreased significantly via ZebraBlood analysis,reflecting the haemodynamic changes triggered by Si NPs. The thrombus formation in Si NPstreated zebrafish embryos was markedly increased by erythrocytes staining. Based on microarray and bioinformatics analysis, JAK1/TF/PAR1 signaling pathway was verified by qRT-PCR and Western blot assay. For in-deep study, the il6st and f2r were knocked down with specific morpholinos (MO). Whole-mount in situ hybridization and qRT-PCR analysis showed that the expression jak1 and f3b were attenuated in il6st knockdown groups;while knockdown of f2r effective declined the fga expression induced by Si NPs. Knockdown of f2r also caused the inhibition of fibrinogen expression and thrombus formation. In summary, our data demonstrated that Si NPs induced inflammation-coagulation cascade, blood hypercoagulable state and thrombus formation via JAK1/TF/PAR1 signaling pathway;il6st and f2r are critical molecular targets forSi NPs-induced thrombus formation.

关键词： Silica nanoparticles inflammation-coagulation cascade thrombus formation

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SiO2致RLE-6TN肺泡上皮细胞凋亡及缝隙连接的影响

SiO2致RLE-6TN肺泡上皮细胞凋亡及缝隙连接的影响

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中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛

作者：薄存香张玉贾强赛林霖邵华杜忠君山东省职业卫生与职业病防治研究院

目的:探讨Si O2对RLE-6TN肺泡上皮细胞凋亡及缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)功能的影响。方法:采用CCK-8检测细胞的存活率。取对数生长期的细胞接种于96孔板,调整细胞密度为5×104个/孔。培养24... 详细信息

目的:探讨Si O2对RLE-6TN肺泡上皮细胞凋亡及缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)功能的影响。方法:采用CCK-8检测细胞的存活率。取对数生长期的细胞接种于96孔板,调整细胞密度为5×104个/孔。培养24小时后,加入含不同浓度Si O2(0,25,50,100,150ug/ml)的DMEM培养液200ul/孔,培养24小时后,加入CCK-8试剂,酶标仪检测450nm处各孔OD值,每组设3个复孔,重复3次。细胞GJIC功能测定采用划痕标记染料示踪技术(SLDT)。将细胞接种于直径35mm的培养皿中,细胞长成融合单层后换入含不同浓度Si O2(0,25,50,100ug/ml)DEME培养液。染毒6h后,以37℃的0. 1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)冲洗细胞3次,加入预温的质量浓度为0. 05%的LY 2 ml,用锋利的手术刀片轻划细胞层,标记3分钟,吸出LY,用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次,加入pH 7. 0磷酸盐缓冲甲醛液固定,显微镜下观察荧光传递情况。每个浓度组设3个平行皿,每皿平行划痕5次,选择划痕较平滑处计数带有荧光的细胞层数。荧光局限于划痕边缘的单层细胞判为未传递(-),1～2层细胞有荧光为(+),2～3层细胞有荧光为(++),3～4层细胞有荧光为(+++),4～5层细胞有荧光为(++++),5层以上细胞有荧光为(+++++)。将每处划痕的观察结果(-)～(+++++)量化为0～5,然后计算各组16～20处划痕的平均值。采用Annexin V/PI双标记法流式细胞术检测细胞凋亡率,设Si O2 0,25,50,100ug/ml浓度组,每组设3个平行。用不含EDTA的胰酶消化细胞,离心收集细胞。PBS洗涤细胞2次,离心收集细胞,加入Annexin V-FITC、PI染液各5ul混匀,室温避光反应15min。再加入400ul的BindingBuffer混匀,用流式细胞仪检测。所有数据采用SPSS 16.0进行统计分析。结果:细胞存活率随Si O2浓度增高而降低,100,150ug/ml(分别为92.47±1.46,80.63±1.72,%)浓度组细胞存活率显著低于对照组(100.13±0.51,%),差异有统计学差异(P<0.05)。LY荧光染料沿划痕边缘垂直扩散的距离随处理浓度的增加而缩短,50,100ug/ml(分别为2.28±1.07,1.63±0.89)浓度组与对照组(3.00±1.03)比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡率随着染毒剂量的增高而增高,25, 50, 100ug/m (分别为2.18±0.14, 2.67±0.21, 3.82±0.30,%)均高于对照组(1.71±0.12,%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Si O2通过破坏RLE-6TN肺泡上皮细胞缝隙连接促进细胞凋亡

关键词： SiO2 缝隙连接通讯功能细胞毒性

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