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不同聚合度分布全脱乙酰壳寡糖的制备研究

不同聚合度分布全脱乙酰壳寡糖的制备研究

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中国海洋湖沼学会第十次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：李克成邢荣娥刘松秦玉坤李鹏程中国科学院海洋研究所

壳寡糖(chitosan oligosaccharide/chitooligosaccharide,COS),又称低聚葡糖糖胺、低聚氨基葡萄糖等,是一种碱性氨基寡糖,由2-氨基葡萄糖(GlcN,D)通过β-1,4糖苷键连接而成,其中含有部分的乙酰氨基葡萄糖残基(GlcNAc,A)。壳寡糖来源广泛...

壳寡糖(chitosan oligosaccharide/chitooligosaccharide,COS),又称低聚葡糖糖胺、低聚氨基葡萄糖等,是一种碱性氨基寡糖,由2-氨基葡萄糖(GlcN,D)通过β-1,4糖苷键连接而成,其中含有部分的乙酰氨基葡萄糖残基(GlcNAc,A)。壳寡糖来源广泛,安全无毒,水溶性好,有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、增强免疫力等多种生物活性,已引起国内外医药研究者对广泛关注。壳寡糖的生物活性受其聚合度和乙酰度的分布的影响。然而过去有关壳寡糖活性的文献报道中,所用的壳寡糖大都是含有各种聚合度和乙酰度的壳寡糖混合物,而且缺乏相应的结构表征,这给研究壳寡糖的构效关系带来很大的困难。因此,制备特定聚合度和乙酰度的壳寡糖是非常必要的。壳寡糖的生物活性与其糖环上的氨基有重要的关系,所以,全脱乙酰化壳寡糖的制备具有巨大的应用前景。本文建立了一套制备不同聚合度全乙酰化壳寡糖的制备方法。高脱乙酰度壳聚糖的制备:采用水和戊醇作为溶剂,以直接加热和微波加热两种方式用40%的烧碱对壳聚糖原料(脱乙酰度:82.0%)进行脱乙酰化。(1)以水作为溶剂直接加热,在沸水浴中加热搅拌2h,三次平行实验计算得到壳聚糖产物脱乙酰度为85.47%,较原料变化不大;以水作为溶剂微波加热,微波850W下加热反应10min,三次平行试验得到壳聚糖产物脱乙酰为91.96%,但是仍不能得到脱乙酰度大于95%的壳聚糖。(2)以戊醇做反应溶剂直接加热反应1.5-4.5h,可得到壳聚糖脱乙酰度在96.25%9.00%。壳聚糖脱乙酰反应实质上是酰胺的水解,OH-作为亲核试剂进攻壳聚糖中乙酰氨基水解为氨基。以水作为溶剂得到壳聚糖脱乙酰度较低,其原因主要是因为水的极性较强,使亲核试剂OH-溶剂化,从而大大降低了OH-亲核活性。另一方面,水的沸点较低,而脱乙酰过程需要一定的高温。采用沸点较高但极性较弱的戊醇可以大大促进脱乙酰化反应的进行。以戊醇做反应溶剂微波加热,微波加热5min,反应得到的壳聚糖产物脱乙酰度近90%。与直接加热相比,微波加热不能得到脱乙酰度大于95%的壳聚糖,其原因可能为微波加热时,戊醇溶剂挥发较严重,温度达不到戊醇沸点温度,且没有搅拌也不利于非均相反应进行。综上,微波加热能够促进壳聚糖在水中的脱乙酰化反应,然而一戊醇做溶剂时,微波加热并没有改善脱乙酰反应的进行。以戊醇做为溶剂直接加热可以得到脱乙酰度大于95%的高脱乙酰度壳聚糖。全脱乙酰化壳寡糖的制备:采用高浓度盐酸对制备的高脱乙酰度壳聚糖进行降解。(1)6MHCl。以投料比1:50(m:V)降解0.5-5h,结果发现,降解溶液中仍含有大量固体,说明6MHCl并不能降解高脱乙酰度的壳聚糖。在盐酸降解壳聚糖的过程中,主要进行糖苷键D-D,D-A,A-D的断裂以及脱乙酰化过程。而文献中报道反应速率常数:kAA/AD=54kdeacety=115kDD,由于本实验中所采用的高脱乙酰度壳聚糖中主要为D-D键的断裂,使得降解在6MHCl中几乎不能进行。(2)浓盐酸。同样以投料比1:50(m:V)采用浓盐酸对高脱乙酰度的壳聚糖进行降解,发现随着降解反应的进行,固体的高脱乙酰度壳聚糖逐渐溶解,说明浓盐酸能够对壳聚糖进行降解。我们通过核磁表征降解产物来对降解反应进行追踪,发现当降解进行5h产物1HNMR谱图中乙酰基上的H信号峰完全消失,说明此时降解产物为全脱乙酰化的壳寡糖。而随着反应时间的延长,浓盐酸降解将会导致更多的单糖产生,所以我们采用浓盐酸降解高脱乙酰度壳聚糖5h可得到全脱乙酰化壳寡糖。乙醇分级:醇沉是在多糖分离纯化过程中常用的分离手段,长链的多糖在高乙醇浓度的溶液中溶解度降低而沉淀出来。本实验中采用乙醇分级可以在一定程度上限定壳寡糖产物的聚合度分布。对以上制备的全脱乙酰化壳寡糖用80%乙醇进行分级,可得到两种不同聚合度分布的壳寡糖产物,经HPLC检测后发现,沉淀中壳寡糖聚合度分布为6-16,而上清液主要含有聚合度<7的壳寡糖。

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基于证据权重法的黄河口沉积物环境质量评价

基于证据权重法的黄河口沉积物环境质量评价

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中国海洋湖沼学会第十次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：吴斌宋金明中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室中国科学院研究生院

为了探讨河口复杂条件下,多重环境胁迫对沉积物环境质量的影响,研究了2011年汛期黄河口14个表层沉积物及配对的底栖生物群落结构特征,通过聚合沉积物化学与底栖生态二元证据水平,以证据权重法综合评价了黄河口及其邻近海域沉积物环境质... 详细信息

为了探讨河口复杂条件下,多重环境胁迫对沉积物环境质量的影响,研究了2011年汛期黄河口14个表层沉积物及配对的底栖生物群落结构特征,通过聚合沉积物化学与底栖生态二元证据水平,以证据权重法综合评价了黄河口及其邻近海域沉积物环境质量。沉积物化学分析显示,尽管研究海域沉积物中重金属受多种来源和上游污染物增加的影响,黄河口沉积物中Cu、Pb、Zn、Cr、As、Hg等6种重金属各自平均含量仅为16.5、16.0、21.0、17.4、6.5和0.0444mg·kg-1,与8种常用区域背景值以及沉积物质量基准比较,上述浓度均低于8种常用的区域背景值（Pb、Hg部分站位除外）以及一致性沉积物质量基准的阈值下限,总体处于低风险水平。然而,通过多种单变量统计和多变量统计方法（非参数多维排序）对黄河口海域不同站位的底栖生物群落结构分析表明,不同站位的底栖生物群落结构差异较大,黄河口底栖生物处于较脆弱的状态:（1）调查区内底栖生物的优势度不明显,本次调查在黄河口海域的14个站位上共采集到大型底栖无脊椎动物46科56属67种,其中环节动物门多毛纲18科25属31种,占所有底栖动物种类的46.3%;甲壳动物亚门15科15属19种（占28.4%）;软体动物10科13属14种（占21.0%）;棘皮动物2科2属2种（占2.9%）;腔肠动物1科1属1种（占1.4%）。优势度大于1%的物种仅9种,其中软体动物紫壳阿文蛤的优势度指数最高,为5.821%;优势度明显的物种仅在1～2个站位大量分布,而在其他站位则仅有零星分布。（2）研究区域内底栖生物种多毛类的比例呈增加趋势,而甲壳类则相反,底栖生物的总栖息密度为33～1313个/m2,平均值为396个/m2;总生物量为0.11～21.71g/m2,平均值为6.00g/m2。其中环节动物多毛纲的平均栖息密度为166个/m2,平均生物量为1.10g/m2;软体动物的平均栖息密度为164个/m2,平均生物量为3.03g/m2;甲壳动物的平均栖息密度为59个/m,平均生物量为0.97g/m2;棘皮动物的平均栖息密度为7个/m2,平均生物量为0.18g/m2;腔肠动物的平均栖息密度为1个/m,平均生物量为0.53g/m2。研究区内多毛类的平均栖息密度在五大类群中最大,软体动物次之,而腔肠动物最小;但从生物量来看,软体动物平均生物量密度最高,而棘皮动物最小。尽管棘皮动物个体较大,但由于仅在14%的站位零星出现,因此平均生物量密度较低;而多毛类、软体动物尽管个体相对较小,但在所有站位均有出现,其栖息密度和生物量相对较高。相较于早前的研究,黄河口底栖生物呈现多毛类比例增加的趋势,显示底栖环境恶化。（3）底栖生物处于较脆弱的状态,并具有明显的空间分布特征,黄河口海域底栖生物的Margalef物种丰富度指数（d）为1.24～5.33,平均值为3.32,所有站位底栖生物的d和Shannon-Weiner多样性指数（H’）变化趋势较吻合,且具有显著的空间异质性,在近河口海域,由于河口物理、化学环境的剧烈变化,以及可能的人为干扰（黄河调水调沙、排污等）,其底栖生物群落处于较脆弱状态,而渤海湾中部、莱州湾西部以及正对黄河口的东部海域,由于受河口的影响减弱,人为干扰相对较低,其底栖生态系统较为稳定,物种丰富度和生物多样性较好。（4）为了更好地表征不同站位上底栖生物群落结构的差异,通过定量比较不同站位上底栖生物群落结构的相似性,以非参数多为排序对各站位上的底栖生物群落结构进行分析,结果表明,研究区内各站位底栖生物群落结构相似性较低,空间异质性显著。综合上述沉积物质量信息,表明黄河口沉积物环境质量已恶化,但并非由重金属引起;通过分析黄河口近三十年来的污染历史和开发现状,黄河三角洲仅近岸的石油开采活动以及始自2002年黄河上游调水调沙活动是引起当前研究海域沉积物环境质量降低的主要原因。调水调沙后,黄河口径流量、输沙量月际变化极大,伴随着海水、冲淡水的入侵,底栖生物难以适应环境的剧烈变动;另一方面黄河三角洲油田开采活动的干扰和污染物的排放,对沿岸海域底栖生物的生存造成不利影响。

关键词：环境质量沉积物证据权重法黄河口

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鲐鱼蛋白酶解工艺优化及其抗氧化活性测定

鲐鱼蛋白酶解工艺优化及其抗氧化活性测定

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中国海洋湖沼学会第十次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：王雪芹邢荣娥刘松于华华李鹏程中国科学院海洋研究所

鲐鱼,又名青鲇鱼,是海洋中上层低值鱼类,在我国各海域均有分布,尤以东海产量最多。鲐鱼营养价值很高,是我国重要的加工鱼种,每年加工成各类冷冻鱼片和鱼罐头数量达数万吨。近几年来,鲐鱼高值化利用的报道逐渐增多,然而,对鲐鱼的研究多...

鲐鱼,又名青鲇鱼,是海洋中上层低值鱼类,在我国各海域均有分布,尤以东海产量最多。鲐鱼营养价值很高,是我国重要的加工鱼种,每年加工成各类冷冻鱼片和鱼罐头数量达数万吨。近几年来,鲐鱼高值化利用的报道逐渐增多,然而,对鲐鱼的研究多停留在酶解优化阶段,对其活性方面研究较少,且目前对鲐鱼不同部位组分差异的深入研究未有报道。鱼类富含蛋白质,且所含氨基酸比值与人体肌肉成分极为接近,吸收利用率高。水解动物蛋白通常可采用化学法和酶解法,酶法水解效率高,水解条件温和可控,在营养成分的保留上具有无可比拟的优点,适于生产鱼类水解蛋白。本文以鲐鱼为原料,以水解度为指标,研究酶解提取鲐鱼不同部位蛋白的最佳工艺参数,并对其抗氧化活性进行初步探讨,将鲐鱼蛋白水解成易于人体消化吸收和富含功能活性物质的营养液,为深海低值鱼的开发利用提供理论依据。蛋白酶解:鲐鱼是很好的食用鱼类,其肉质紧实,蛋白质含量较高,而鲐鱼鱼头、鱼尾、内脏往往成为下脚料,作为废物处理掉,高值化利用程度低。本文将鲐鱼分为鱼肉和下脚料（鱼头、鱼尾、内脏）两个组分进行比较和评价,测得其水分含量分别为69.2%和70.4%。按照干基计算,粗蛋白含量分别达到38.5%和37.2%,是一种很好的蛋白质资源。选择胰蛋白酶,酸性蛋白酶,木瓜蛋白酶,风味蛋白酶,中性蛋白酶作为水解用酶,分别在各种酶最佳条件下对鲐鱼不同部位进行水解,其中风味蛋白酶对鲐鱼不同部位的水解效果较好,因此,本文选取风味蛋白酶进行最佳的酶解条件探讨。首先对风味蛋白酶进行单因素实验,以水解度为指标,确定其加酶量、液固比、酶解时间、酶解温度和pH值的最佳酶解范围,考虑到各因素之间的相互影响,在单因素研究的基础上,进一步进行正交试验,得到鱼肉和下脚料蛋白的最佳酶解条件。其中鱼肉蛋白水解的最适条件为:加酶量1200U/g,物料比1:15,pH值5.5,48℃酶解6.5h,在此条件下进行验证,鱼肉蛋白的水解度为37.8%。下脚料蛋白水解的最适条件为:加酶量1200U/g,物料比1:8,pH值6.0,48℃酶解6.5h,在此条件下进行验证,下脚料蛋白的水解度为37.1%。鲐鱼鱼肉和下脚料蛋白酶解液共检出16种氨基酸,两者含量最高的均是与鲜味有关的谷氨酸,其次是精氨酸,此外,天门冬氨酸和亮氨酸在鱼肉蛋白酶解液中含量较高,而下脚料蛋白酶解液中甘氨酸和赖氨酸含量较高,含量最低的均是组氨酸。可见,鱼肉和下脚料蛋白酶解液氨基酸组成存在差异。鲐鱼鱼肉蛋白酶解液中氨基酸总量为38.53%,其中必需氨基酸/总氨基酸和必需氨基酸/非必需氨基酸比值分别为0.42和0.72,鲐鱼下脚料蛋白酶解液中氨基酸总量为43.17%,比值分别为0.41和0.69,两者均高于FAO/WHO建议值0.40和0.60。说明鱼肉和下脚料蛋白酶解液营养均衡,有作为制备生物活性肽的应用前景。抗氧化活性:目前对鲐鱼的大部分研究都停留在酶解优化阶段,对其活性的研究较少,本文在酶解条件优化的基础上,对鲐鱼鱼肉和下脚料酶解液的抗氧化活性进行初步探讨,比较了鲐鱼不同组分对·OH的清除能力和还原能力的差异。鲐鱼鱼肉和下脚料蛋白酶解液对·OH的清除能力随着质量浓度的增加而增加,清除能力与质量浓度呈现较好的对数回归关系,相关系数分别为0.993和0.995。其中下脚料对·OH的清除能力高于鱼肉,由回归曲线推出蛋白酶解液的EC50值分别为0.5806mg/ml和0.2786mg/ml,同理,VC的EC50值为3.044mg/ml。可见,鲐鱼蛋白酶解液具有较强的清除羟自由基的能力,可作为潜在的抗氧化剂应用。此外,鲐鱼鱼肉和下脚料蛋白酶解液具有一定的还原能力,且还原能力随着质量浓度的增大而提高,两者均呈较好的线性关系,相关系数分别为0.996和0.997。当鱼肉和下脚料蛋白酶解液的质量浓度为1mg/ml时,吸光值分别为0.832和0.459,相当于约36μg/ml和17μg/mlBHT在这个反应体系中的还原能力。鱼肉蛋白酶解液的还原能力高于下脚料蛋白酶解液,而后者却具有较好的·OH的清除能力,可见,鲐鱼不同部位的抗氧化活性存在一定差别。

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冲绳海槽晚更新世以来沉积物中的碳酸盐对大气CO2变化的响应

冲绳海槽晚更新世以来沉积物中的碳酸盐对大气CO2变化的响应

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中国海洋湖沼学会第十次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：李学刚宋金明李凤业袁华茂李宁段丽琴中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室

沉积物中碳酸盐含量的高低、碳酸盐矿物组合、碳氧同位素组成以及它们保存的好坏都与当时的物质来源、海水温度、盐度等环境条件密切相关,可以说沉积物中的碳酸盐忠实的记录了全球环境变化的全过程,利用沉积物中的碳酸盐可有效恢复古环... 详细信息

沉积物中碳酸盐含量的高低、碳酸盐矿物组合、碳氧同位素组成以及它们保存的好坏都与当时的物质来源、海水温度、盐度等环境条件密切相关,可以说沉积物中的碳酸盐忠实的记录了全球环境变化的全过程,利用沉积物中的碳酸盐可有效恢复古环境。根据对南极冰芯中CO2的研究,晚更新世以来大气CO2浓度发生了巨大的变化,特别是在距今18Ka的时期,大气CO2的浓度最低,只有182ppm,随后大气CO2浓度不断升高,到工业革命前大气CO2浓度升高到280ppm,目前已为388ppm。大气CO2浓度的不断升高,必将导致大洋表层海水CO2体系平衡的变化,这种变化必然会体现在沉积物中碳酸盐含量的变化上。沉积沉积物中的碳酸盐含量的高低取决于以下三个因素:（1）碳酸盐的来源,即钙质骨骼的生物生产力,主要指浮游生物如有孔虫、颗石藻、翼足类等生物壳体碎片的输入量;（2）非碳酸盐沉积物,首先是陆源碎屑矿物的输入,即非钙质颗粒的"稀释作用"（3）碳酸盐的深海溶解作用,它随着水温降低、压力加大而增强。冲绳海槽位于东海陆架与日本琉球岛弧之间,晚更新世全球海平面降低,东海陆架成为沿海大平原,全新世海平面抬升,东海陆架再度成海,这种特殊的地理位置和环境变迁使其成为研究古海洋学的理想场所。众多学者（主要是国内学者）对冲绳海槽的古海洋环境的演化进行了研究,对冲绳海槽的古环境演化有了比较深入的了解,但针对沉积物中碳酸盐的研究成果并不多。本文研究了冲绳海槽4个岩心中碳酸盐及其氧同位素的变化特征,初步剖析了晚更新世以来沉积物中的碳酸盐对大气CO2变化的响应。从碳酸盐的来源来看,冲绳海槽沉积物中碳酸盐的δ18O与同层次沉积物中有孔虫δ18O呈显著正相关关系,表明沉积物中的碳酸盐与有孔虫关系密切,海洋有孔虫等钙质生物是冲绳海槽沉积物中碳酸盐的主要来源。根据该区沉积物中有机碳的δ13C的测定结果,沉积物中的δ13C在17.3‰-22.9‰之间,远小于陆生C3植物的δ13C,表明该区沉积物中有机质主要是海洋自生的。从该区沉积物中有机碳和无机碳含量的相关分析看,二者呈显著的正相关关系,表明二者有相似的来源,这也从另一个方面证明了该区碳酸盐主要以海洋自生为主。另外,研究站位于东部陆坡区的底部,在正常情况下有东海输运的物质也很少能到达该区;且该站水深为974米,远小于该区的碳酸盐补偿深度,碳酸盐的溶解作用较弱。所以该区碳酸盐的含量主要由该区碳酸盐的生产决定的。从沉积物中碳酸盐的总体分布看,沉积物中碳酸盐的含量变化与大气中CO2的变化趋势一致,在60-70ka间大气CO2浓度较低,只有190ppm左右,这一时段为末次冰期初期,温度较低,导致生物的初期生产力较低,碳酸盐的来源较少,使该时段的碳酸盐含量较低;随后在57ka左右,大气CO2浓度迅速升高到220ppm左右,碳酸盐初级生产力也迅速提高,导致沉积物中碳酸盐的含量也相应增加;在50ka年左右,大气CO2浓度再次降低,相应的沉积物中的碳岩也相对应为低含量;其后沉积物中碳酸盐的含量变化也与大气CO2浓度的波动相一致,特别是18ka以后的冰后期,大气CO2浓度日益升高,沉积中碳酸盐的含量也不断升高。但值得注意的是在18-35ka之间,大气CO2浓度较低且波动并不大,但沉积物中的碳酸盐含量却持续增加。这段时间正好是末次盛冰期,表层海水的稳定较低,海洋碳沉积物酸盐生物的初级生产力并不高,所以在35ka时沉积物中碳酸盐的含量极低,但此后该地区海平面不断降低,从而使到达冲绳海槽底部的陆源碳酸盐物质不断增加,导致这一时期沉积中的碳酸盐含量也不断增加。根据沉积物中有机碳含量计算得到的冲绳海槽晚更新世以来有机碳的通量和输出生产力的变化与沉积物中有机碳含量的变化相似,值得注意的是18ka以来冲绳海槽海域有机碳通量和输出初级生产力并没有随大气CO2的持续升高而升高,而是保持了一个相对稳定的状态,表明18ka以来大气CO2浓度已不是限制海洋初级生产的主要因素,营养盐供给应当是限制冲绳海槽初级生产的主要因素。从所恢复的冲绳海槽晚更新世以来表层海水pCO2看,晚更新世以来海水中pCO2的变化与大气CO2浓度的变化趋势基本一致,特别是在18ka以来,其变化趋势更加一致,但海水中pCO2明显小于大气CO2分压,表明该海域在晚更新世以来一致是大气CO2的汇。

关键词：碳酸盐碳氧同位素响应海水二氧化碳分压冲绳海槽

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