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4 篇 南京医科大学
4 篇 温州医科大学
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2 篇 武汉轻工大学
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2 篇 华东生物医药研究...
2 篇 中国科学院成都文...
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空肠弯曲杆菌单结构域血红蛋白提高大肠杆菌生长能力的研究

空肠弯曲杆菌单结构域血红蛋白提高大肠杆菌生长能力的研究

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：许力熊炜杨江科武汉轻工大学生物与制药工程学院

在有氧发酵中,在溶液中维持一个合适浓度的溶氧对发酵是十分重要的。通过细菌血红蛋白来促进发酵罐中细胞对氧气的利用来缓解供氧不足问题是一个新型、节约、节能的方式。细菌血红蛋白是一种能将氧气从细胞内环境传递到代谢过程,允许细... 详细信息

在有氧发酵中,在溶液中维持一个合适浓度的溶氧对发酵是十分重要的。通过细菌血红蛋白来促进发酵罐中细胞对氧气的利用来缓解供氧不足问题是一个新型、节约、节能的方式。细菌血红蛋白是一种能将氧气从细胞内环境传递到代谢过程,允许细菌在微氧条件下生长的氧结合蛋白。在本研究中,我们开发了一种异源表达的新型血红蛋白,用来解决工业生产对高菌密度、蛋白合成和新陈代谢的要求。为提高***在现有发酵水平下的生物量,获得新型的基因工程底盘细胞,我们基于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)血红蛋白基因(chb),比较分析了组成型和诱导型启动子对血红蛋白在***基因工程菌中的表达状况及对***生长的影响。我们首先合成了空肠弯曲杆菌血红蛋白基因chb,并让chb基因在诱导型启动子(PT7和Pvgh)和组成型启动子(P2和PspoI-II)控制下表达;随后,测定了由四种类型启动子控制的血红蛋白工程菌在摇瓶和蓝盖瓶中的生长状况。结果表明CHb可增加细胞在低氧条件下的氧气利用率,显著提高大肠杆菌的生长。在发酵罐中的试验也表明四种工程菌同样对细胞生长具有出促进作用;我们进一步比较分析了菌体密度、细胞鲜重和CO差式光谱值间的相互关系,讨论了四种类型启动子控制的基因工程菌在诱导表达和生长调控等方面的特点,为在微氧和好氧等不同发酵条件下选用基因工程底盘细胞提供了参考。为了深入了解CHb作用机制,我们采用NMR技术分析了CHb工程菌代谢物的变化水平并通过荧光定量PCR对重要代谢途径上的作用酶表达量进行检测。NMR结果显示CHb工程菌胞内18种物质含量上升,结合荧光定量PCR,经passway分析表明CHb工程菌细胞内糖酵解作用和TCA循环加速,产生了NADH和FADH2。推测,由于在电子传递链末端CHb传递的分子氧增加,呼吸链反应加快,促使糖酵解作用和TCA循环加速产生填补消耗,,释放大量能量,从而加快了细胞的生长的速度。

关键词：空肠弯曲杆菌血红蛋白生长能力启动子 CO差式光谱 NMR 荧光定量PCR

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用于旅行及灾后流行性腹泻的三联皮粘膜疫苗LTm-EVS研究初报

用于旅行及灾后流行性腹泻的三联皮粘膜疫苗LTm-EVS研究初报

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：刘地张娜郭华马兴元华东理工大学生物工程学院国家反应器工程重点实验室

我国是一个自然灾害多发的国家,地震、滑坡、洪水、泥石流等灾害频频发生,给人们的生命和财产带来了巨大的损失。灾害的发生往往伴随着疫情的爆发,而灾后流行性腹泻又是其中最主要的疾病,这使灾区民众雪上加霜。同时,中国又是一个旅游大... 详细信息

我国是一个自然灾害多发的国家,地震、滑坡、洪水、泥石流等灾害频频发生,给人们的生命和财产带来了巨大的损失。灾害的发生往往伴随着疫情的爆发,而灾后流行性腹泻又是其中最主要的疾病,这使灾区民众雪上加霜。同时,中国又是一个旅游大国,旅游业是我国一个新兴的支柱产业,而随着人流的增大与生态环境的恶化,"旅行者腹泻"呈现频发与高发态势。由于上述原因,在我国流行性腹泻和旅行者腹泻成为最常见的由于胃肠道感染引发的疾病,尤其是在热带和亚热带地区,这导致了严重的健康危害和经济损失。在引发胃肠道感染性腹泻的病原菌中,产肠毒素大肠杆菌(ETEC),霍乱弧菌(***)、志贺氏菌(Shigella)是其中最主要的三大病原菌,大约80%的感染性腹泻都是由它们引起的。抗生素的滥用导致耐抗生素菌的产生与限制抗生素使用政策的实施,使疫苗预防感染性疾病成为"后抗生素时代"的理想选择。为此,我们针对引发感染性腹泻的主要病原菌,设计了一种通过皮肤给药的三联皮贴疫苗LTm-EVS。这种疫苗由双突变体不耐热肠毒素LTm(R192G/L211A),霍乱弧菌鞭毛蛋白(FlaA)和志贺毒素B亚单位(StxB)三种抗原蛋白组成。其中LTm(R192G/L211A)抗原蛋白也充当着疫苗中的佐剂的作用。为了制备抗原蛋白,我们采用了基因工程的方法将抗原蛋白基因载入表达载体,同时利用大肠杆菌表达系统高效表达重组抗原蛋白,并利用重组蛋白所带有的纯化标签进行镍亲和层析和凝胶层析两步纯化。通过简单的微针贴片呈递系统和可溶性疫苗涂层,来实现将疫苗抗原传递到皮肤的抗原提呈细胞的目标。这种三联腹泻疫苗LTm-EVS提供了一种新的利用微针贴片技术来预防流行性腹泻和旅行者腹泻的思路。作为一种简便,安全,利于大规模接种的疫苗,它可以促进疫苗的覆盖率,特别是在拥有庞大的人口并缺乏足够的医疗保健的基础设施的发展中国家。新型三联疫苗LTm-EVS的临床前研究和开发,为进一步的动物实验和临床评价奠定了前期基础。

关键词：灾后流行性腹泻旅行者腹泻三联皮贴疫苗LTm-EVS 粘膜佐剂LTm

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新型生物材料[PEAD:肝素]包裹bFGF对小鼠皮肤创面愈合作用研究

新型生物材料[PEAD:肝素]包裹bFGF对小鼠皮肤创面愈合作用研究

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：叶晶晶时洪雪林丽肖健温州医科大学药学院分子药理中心

背景:皮肤损伤是医学界最普遍、最繁重的问题,给患者带来严重的心理负担和沉重的经济负担。在我国,每年有数百万急性创伤病例,包括烧烫伤、手术伤口、外伤等。据统计,每年我国创面修复与再生治疗需求高达1亿人次左右。目前创面处理方式... 详细信息

背景:皮肤损伤是医学界最普遍、最繁重的问题,给患者带来严重的心理负担和沉重的经济负担。在我国,每年有数百万急性创伤病例,包括烧烫伤、手术伤口、外伤等。据统计,每年我国创面修复与再生治疗需求高达1亿人次左右。目前创面处理方式主要是更换敷料,该疗法的缺点是加重患者感染的危险,且治疗方案有限、愈后效果差,价格昂贵等。因此,开发新的治疗剂型满足临床需要刻不容缓。创面愈合是一个动态的过程,依赖于多种细胞因子、酶及细胞的共同协调。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)已被证明有加速创面愈合的作用,但缺点是bFGF半衰期较短,需频繁给药,因此适当的药物递送系统急需被开发。我们前期设计了一种以肝素为基础的具有生物活性的聚阳离子聚合物,bFGF能够从团聚体中缓慢释放,促进人成纤维细胞迁移和细胞增殖,增强其生物活性。方法:建立C57BL/6小鼠皮肤全层切除创伤模型。4%水合氯醛(0.1 ml/10 g)腹腔注射麻醉,剃去老鼠背部毛发,用脱毛膏去除干净。采用圆形皮肤打孔器在其背部做两个直径为6 mm的创面,防止皮肤由于皱缩而愈合,创面用环形胶圈固定(内径8 mm,外径16 mm)。模型随机分为四组,分别是生理盐水组、空白载体组、单纯bFGF组和bFGF团聚体组,单剂量(1.6μg bFGF/创面)给药。分别在第0、7、14、17天测量创面面积,创面愈合率(%)=(造模第一天创面面积—取材日创面面积)/造模第一天创面面积×100%。药物干预17天后,处死,取皮肤组织包埋切片。HE染色、马森染色评价组织形态学变化;免疫荧光观察组织血小板内皮细胞粘附因子(CD31),评价血管生成。结果:体外实验表明,bFGF可从团聚体中缓慢释放,促进人成纤维细胞迁移和细胞增殖,增强其生物活性。体内实验表明,bFGF团聚体可以加速小鼠皮肤愈合,在第17天时实验组创面完全愈合。苏木精-伊红染色和马森染色表明bFGF团聚体促进创面肉芽组织形成和胶原产生,促使创面再上皮化发生。荧光结果表明bFGF团聚体促进肉芽组织中CD31的表达,加速新生血管形成。结论:bFGF团聚体通过缓慢释放bFGF,使创面有足够的时间浸润在富含生长因子的环境中,促进肉芽组织的形成及血管生成,促进创面组织再上皮化,提高创面的营养供给,从而促进创面的愈合。

关键词：聚阳离子 bFGF CD31 肉芽组织创面愈合

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PslG,a Self-produced Glycosyl Hydrolase Triggers Biofilm Disassembly by Disrupting Exopolysaccharide Matrix

PslG,a Self-produced Glycosyl Hydrolase Triggers Biofilm Dis...

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者： S.Yu T.Su H.Wu S.Liu D.Wang T.Zhao Z.Jin W.Du M.Zhu S.Chua L.Yang D.Zhu L.Gu 马旅雁 Institute of Microbiology Chinese Academy of Sciences University of the Chinese Academy of Sciences Shandong University Washington State University Nanyang Technological University 中国科学院微生物研究所

Biofilms are surface-associated communities of microorganism embedded in extracellular matrix. Exopolysaccharide is a critical component in the extracellular matrix that maintains biofilm architecture and protects resident biofilm bacteria from antimicrobials and host immune attack. However, the self-produced factors that target the matrix exopolysaccharides, are poorly understood. Here we show that PslG,

关键词：细菌生物被膜 PslG,a Self-produced Glycosyl Hydrolase Triggers Biofilm Disassembly by Disrupting Exopolysaccharide Matrix 胞外多糖

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壳青霉纤维素酶结合结构域结合位点的研究

壳青霉纤维素酶结合结构域结合位点的研究

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：熊炜许力杨江科武汉轻工大学生物与制药工程学院

纤维素是自然界最有潜质的生物质。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称包括内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH或外切葡聚糖酶)、β-葡萄糖苷酶(BG),它们协同作用,分解纤维素产生寡糖和纤维二糖,最终水解为... 详细信息

纤维素是自然界最有潜质的生物质。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称包括内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH或外切葡聚糖酶)、β-葡萄糖苷酶(BG),它们协同作用,分解纤维素产生寡糖和纤维二糖,最终水解为葡萄糖。在结构上,内切纤维素酶通常由催化结构域(catalytic domain,CD)、结合结构域(cellulose binding domain,CBD)组成,两个结构域由连接肽(Linker)相连。纤维素酶在水解纤维素的过程中,首先需要CBD与纤维素吸附将其固定,而后CD才能将其水解。我们在对壳青霉内切纤维素酶EGL1的研究中发现CD结构域在没有CBD的参与下,仍然能够吸附上纤维素上并且有水解活性。这种吸附作用可能与CD结构域下底部和活性中心的芳香族氨基酸有关;在对在对EGL1 CBD结构域的研究中,发现CBD有两个芳香族氨基酸富集区。为了研究结合位点的吸附功能,我们将EGL1CBD的两个芳香族氨基酸富集区的芳香族氨基酸分别突变成甘氨酸形成四种突变体pET-28a-eGFP-CBD-2R (3位点突变,位于前端芳香族氨基酸富足区),pET-28a-eGFP-CBD-3R(4位点突变,3位点位于前端芳香族氨基酸富足区,1位点位于后端芳香族氨基酸富足区),pET-28a-eGFP-CBD-4F(3位点突变,位于后端芳香族氨基酸富足区),pET-28a-eGFP-CBD-5F(1位点突变,位于后端芳香族氨基酸富足区),将四种突变体与pET-28a-eGFP-CBD,pET-28a-eGFP在大肠杆菌中表达纯化后得到空白样品e GFP,对照蛋白e GFP-CBD,突变eGFP-CBD-2R、eGFP-CBD-3R、eGFP-CBD-4F、e GFP-CBD-5F。用激光共聚焦显微镜观察6种蛋白与纤维素绑定后的情况,根据荧光信号判断绑定情况如下:eGFP-CBD> eGFP-CBD-5F> eGFP-CBD-4F> eGFP-CBD-2R> e GFP-CBD-3R>eGFP。用等温滴定微量量热仪检测6种蛋白与纤维五糖的吸附热,吸附结果与绑定实验结果一致。同源模拟EGL1CBD的三维结构,前端芳香族氨基酸靠近Linker。可以得出结论,EGL1 CBD的吸附位点主要在前端芳香族氨基酸富足区即靠近Linker的位置。本研究为纤维素酶的后续研究提供理论性基础。

关键词：壳青霉纤维素酶结合结构域激光共聚焦显微镜等温滴定微量量热仪

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肺炎支原体膜蛋白的表达、纯化及抗原性检测

肺炎支原体膜蛋白的表达、纯化及抗原性检测

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：陈晨齐永徐亭亭潘英李素芹李佳萌李素梅王新国徐艺菲李越希中国药科大学生命科学与技术学院南京军区军事医学研究所南京医科大学基础医学院

目的:肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia,Mp)作为人类呼吸道感染疾病的常见病原体,可引发小儿及青壮年的非典型性肺炎及其他急性呼吸道疾病,P1、P116和P30蛋白是密集分布于Mp菌体表明的膜蛋白,既可作为黏附细胞器使菌体黏附于宿主表面又... 详细信息

目的:肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia,Mp)作为人类呼吸道感染疾病的常见病原体,可引发小儿及青壮年的非典型性肺炎及其他急性呼吸道疾病,P1、P116和P30蛋白是密集分布于Mp菌体表明的膜蛋白,既可作为黏附细胞器使菌体黏附于宿主表面又能使菌体在宿主细胞表面滑动,将其抗原性强的蛋白片段P116N,P1C,P30分别进行表达,分析其免疫原性和抗原性。方法:采用生物信息学软件对肺炎支原体表面膜蛋白P1,P116及P30进行抗原表位分析,筛选其中抗原表位较富集的优势抗原片段作为目的蛋白;优化筛选的基因序列,使其能在合适的原核表达载体中进行高效表达。构建重组质粒pET28a(+)–P116N,pET28a (+)–P1C,pET28a (+)–P30,并分别转化到*** BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,采用亲和层析技术对含有GST标签的目的蛋白进行分离纯化,经过SDS-PAGE和Western blot的验证,获得了较高纯度的蛋白。分别使用三种膜蛋白抗原对采用三次免疫加强法对新西兰大耳白兔进行背部八点免疫,兔颈动脉取血制备兔抗血清。将制备的兔血清作为一抗,稀释比为1:200,而将酶标的羊抗兔IgG作为二抗,暗室胶片曝光,采用ELISA对其抗原性和免疫原性进行分析,并测定其效价。结果:分析***膜蛋白的全长序列,并将蛋白的抗原性、亲水性和表面可及性等参数作为分析指标,最终选取三个氨基酸片段作为研究对象,成功构建重组质粒pET28a (+)–P116N,pET28a (+)–P1C,pET28a (+)–P30,质粒转化入*** BL21(DE3),挑选转化子,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白为可溶性表达,采用谷胱甘肽溶液对目的蛋白进行梯度洗脱,条带明确较单一,与理论分子量相符。Westernblot结果显示制备的多抗血清能特异性识别抗原,ELISA结果显示三种膜蛋白均能较好地与多抗血清进行特异性反应,效价可达1:107。结论:纯化获得的重组蛋白具有较好的免疫原性和抗原性,免疫效果良好,可作为肺炎支原体的候选疫苗,为肺炎支原体疫苗的进一步研究奠定了基础。

关键词：肺炎支原体融合蛋白抗原性疫苗

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A New High Throughput Screening Platform for Protease Engineering

A New High Throughput Screening Platform for Protease Engine...

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：易犁张桂敏马延和湖北大学生命科学学院中国科学院天津工业生物技术研究所

酶工程是生物工程的主要分支之一。如何快速准确地进行酶的优化筛选一直以来是酶工程领域的重要研究方向。早期的优化筛选方法由于方法学的局限主要集中于点突变,平板筛选等低通量模式。然而由于酶的活性功能通常是由多个氨基酸协同作... 详细信息

酶工程是生物工程的主要分支之一。如何快速准确地进行酶的优化筛选一直以来是酶工程领域的重要研究方向。早期的优化筛选方法由于方法学的局限主要集中于点突变,平板筛选等低通量模式。然而由于酶的活性功能通常是由多个氨基酸协同作用决定,低通量筛选模式无法适应超大突变株文库筛选的要求。随着流式细胞仪和高通量测序仪的出现,以及高效荧光抗体标记的发展,新一代高通量优化筛选方法的建立成为了可能。

关键词：蛋白酶高通量筛选酵母内质网滞留系统催化活性

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汽爆作为秸秆饲料化技术的可行性探究

汽爆作为秸秆饲料化技术的可行性探究

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：和立文孟庆翔李德勇任丽萍中国农业大学动物科学技术学院/动物营养学国家重点实验室

随着畜产品的社会需求压力日益加剧,畜牧业生产规模不断扩大,饲料资源短缺问题日益突出,人畜争粮矛盾越发尖锐,饲料行业的可持续发展遭受巨大挑战。与此同时,我国的非粮饲料资源特别丰富,尤其是秸秆资源产量巨大,若其得到有效利用将很... 详细信息

随着畜产品的社会需求压力日益加剧,畜牧业生产规模不断扩大,饲料资源短缺问题日益突出,人畜争粮矛盾越发尖锐,饲料行业的可持续发展遭受巨大挑战。与此同时,我国的非粮饲料资源特别丰富,尤其是秸秆资源产量巨大,若其得到有效利用将很大程度上缓解饲料资源不足。秸秆纤维含量高,是反刍动物重要的日粮组分和营养来源。通常,成熟秸秆的木质化程度较高,密实的木质纤维化结构很难被微生物消化和酶解,是其抗消化的关键因素。长期以来,国内外专家一直在积极探索各种秸秆加工技术以提高其饲用价值,常见的秸秆处理方法大致可分为物理方法、化学方法和生物学方法及各种方法组合应用。粉碎揉搓、加酸加碱等理化方法简便易行,但作用效果十分有限;青贮和黄贮是目前应用最为广泛的秸秆处理方法,很好的保存了秸秆的营养价值并改善其适口性和消化率,但其对秸秆木质纤维素结构的破坏作用有限且变异大,而且也不适用于干枯成熟秸秆的加工处理。近些年来,汽爆秸秆在生物质能源、工业材料及农业化肥等领域有着广泛的应用。汽爆是利用饱和水蒸汽将纤维原料加热至一定压力,使高压蒸汽渗入纤维内部,然后骤然减压,蒸汽从物料孔隙膨胀释放,使纤维发生机械断裂和化学变化的生物质预处理手段。研究表明,汽爆处理可有效破坏秸秆木质化结构,使原料中大部分半纤维素和少量木质素和纤维素降解而溶出。在秸秆制浆和糖化发酵等工业领域的广泛应用证明汽爆技术是一种有效的生物质预处理方法,但其作为饲料资源开发技术在畜牧生产中的应用价值还有待验证。为评估汽爆作为秸秆饲料化处理技术的可行性,本研究通过常规化学分析、体外产气量法以及模型预测等方法综合评价三种常见秸秆(玉米秸、小麦秸和稻秸)的汽爆处理效果。结果显示:汽爆处理后,秸秆的干物质和灰分的比例显著升高(P<0.05),同时中性洗涤纤维的比例则显著降低(P<0.01);不同种类秸秆的蛋白质、酸性洗涤纤维和木质素的比例变化不一致。汽爆处理消除(P<0.01)了秸秆体外发酵的延滞期(lag),提高(P<0.01)了产气速率(c)和前期的产气量(48h前),却降低(P<0.01)了理论最大产气量(B);汽爆处理对玉米秸和稻秸发酵产气的提升作用比小麦秸的效果好。汽爆处理显著提高(P<0.01)秸秆的粗饲料相对值(%)、干物质采食量(%BW)和粗饲料分级指数(MJ/d)。以上结果表明,汽爆处理使秸秆理化特性发生很大变化,粗饲料品质大幅度提高,由此可见,汽爆技术在饲料领域有很好的应用前景。

关键词：秸秆饲料化玉米秸饲料资源可行性探究

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肺癌特异性DKK 1基因转录调控元件的分析预测及活性筛选

肺癌特异性DKK 1基因转录调控元件的分析预测及活性筛选

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：李文茂高燕许瑞安华侨大学分子药物教育部工程研究中心华侨大学分子药物学研究所湖北医药学院附属太和医院PET中心

Dickkopf 1(DKK1)是经典wnt信号通路的拮抗剂,它可以与Lrp5/6受体蛋白结合,对wnt信号通路产生竞争性抑制作用。此外,DKK1在多种非小细胞细胞系、组织中均具有特异性、高水平表达的特点,可作为一种肺癌诊断的血清标志物。我们之前的研究... 详细信息

Dickkopf 1(DKK1)是经典wnt信号通路的拮抗剂,它可以与Lrp5/6受体蛋白结合,对wnt信号通路产生竞争性抑制作用。此外,DKK1在多种非小细胞细胞系、组织中均具有特异性、高水平表达的特点,可作为一种肺癌诊断的血清标志物。我们之前的研究发现DKK1启动子在肺癌中的活性并不是很高,因此我们认为仍可能存在其他转录调控元件(Transcriptionalregulatoryelements,TREs)增强子协同调控启动子活性。鉴于目前涉及DKK1增强子等调控元件的研究较少,主要集中在DKK1启动子片段上,筛选鉴定DKK1增强子片段可用于进一步的DKK1调控机制研究。参与基因转录调控的这些转录调控元件主要包括启动子、增强子、绝缘子等,与启动子元件一般位于调控基因的5,端不同,增强子等调控元件在散布在基因组中,位置并不固定。本研究的关键难点在于对DKK1基因增强子等转录调控元件在基因组中预测及定位。研究通过UCSC人类基因组浏览器获取A549细胞中DKK1基因位点的DNase I超敏性、组蛋白修饰等表观遗传信息,对这些信息进行分析,得到12条候选增强子元件序列,用于下一步高活性增强子片段筛选。鉴于DKK1启动子全长片段较大,因此需要筛选一段具有较高活性且片段较小的近端启动子片段。首先本文先将四段不同长度的DKK1启动子片段构建到pGL3-basic载体中,选择其中一段作为DKK1基因近端启动子片段。将构建得到的重组载体转染A549、H460、H446、Eca-109、Changliver和HEK293细胞,并通过双荧光素酶报告基因系统检测不同长度DKK1启动子片段活性,最终我们确定DKK1-5片段活性较好,可作为DKK1基因近端启动子片段。最后我们将这12条候选片段分别插入到DKK1-5近端启动子上游,成功构建重组质粒,并通过双荧光素酶报告基因检测系统检验相关候选元件的增强子活性。本文在细胞水平得到六段候选元件:在A549细胞中TRE3、TRE4、TRE6、TRE7、TRE8、TRE12对DKK1启动子具有显著增强作用。TRE3、TR4、TRE12在H460中具有显著增强作用。而且TRE3、TRE4、TRE7、TRE8对DKK1启动子的增强作用具有非小细胞肺癌特异性。

关键词： DKK1 增强子元件双荧光素酶报告基因检测系统

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代谢木糖的酿酒酵母重组菌株的初步构建

代谢木糖的酿酒酵母重组菌株的初步构建

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中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会

作者：施欣驰陈勇邹亚男应汉杰南京工业大学生物与制药工程学院南京工业大学国家生化工程技术研究中心

在我国,木质纤维素类可再生资源丰富,仅农作物秸杆年产就多达6亿多吨。这些纤维素类资源除部分用于造纸、建筑、纺织等行业外,大部分未能被有效利用,有些还被直接焚烧,造成了严重的环境污染。若能采用适宜的技术将这些废物加以转化利用... 详细信息

在我国,木质纤维素类可再生资源丰富,仅农作物秸杆年产就多达6亿多吨。这些纤维素类资源除部分用于造纸、建筑、纺织等行业外,大部分未能被有效利用,有些还被直接焚烧,造成了严重的环境污染。若能采用适宜的技术将这些废物加以转化利用,不仅能够节粮、代粮,缓解能源紧缺,还可以减少废物、消除公害、保护环境,对我国经济的可持续发展将产生深远的影响。木糖是半纤维素的主要组成部分,在植物纤维材料水解液中占30%左右,是自然界中含量仅次于葡萄糖的第二丰富的糖类,因此木糖的利用是开发利用半纤维素的关键。酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）具有兼性厌氧、耗糖快、耐抑制物强、耐高糖、安全等优良性能,一直以来广泛应用于工业化生产,但它不具备木糖代谢能力。热带假丝酵母（Candida tropicalis）能够利用木糖,但是与酿酒酵母相比其在工业发酵上的不足也非常明显。本研究以酿酒酵母BY4741为宿主菌株,以酿酒酵母多拷贝表达载体pYX212为载体,过表达热带假丝酵母木糖代谢途径关键酶:木糖还原酶（XR）、木糖醇脱氢酶（XDH）、木酮糖激酶（XK）、转醛醇酶（TAL）;以及来自大肠杆菌（Escherichiacoli）的转氢酶（pntA和sthA）。实验结果表明,只表达XR和XDH时,酿酒酵母依然无法利用木糖。当以葡萄糖、木糖共利用发酵时,葡萄糖消耗完后仍无法利用木糖,出现菌体OD下降,发酵液乙醇含量降低的现象。分析原因应该是XR和XDH所利用的辅因子不平衡,故替换pYX212载体的抗性后,在过表达XR和XDH的酿酒酵母BY4741中分别继续表达两种转氢酶。效果依然不明显。转醛醇酶（TAL）是PP途径中的关键酶,有研究表明在酿酒酵母中过表达树干毕赤酵母的TAL能提高木糖的利用效率。本研究在过表达XR和XDH的酿酒酵母中继续表达来自热带假丝酵母的TAL,筛选出的阳性转化子能够在以木糖为碳源的平板上生长,且生长能力较强。以不同条件的接种量和发酵培养基碳源种类为考察对象的发酵实验表明,将生长20h的种子液以10%（v/v）的接种量接种的效果比离心收集整瓶种子液的菌体接种的发酵效果好;以葡萄糖、木糖为混合碳源的效果比以木糖为唯一碳源的效果好。实验表明发酵初期的菌体量并非越多越好,初始OD600维持在2左右较适宜。因为木糖的消耗速率较低,含少量葡萄糖的发酵培养基有利于在发酵初期快速长菌,从而进一步加快后期木糖的消耗速率。但是过表达XR、XDH、TAL（启动子均为TEF1）的酿酒酵母菌株虽然能够以木糖为唯一碳源生长,乙醇产量却大大降低,主要积累木糖醇。对XR和XDH的酶活进行检测发现XR的酶活是XDH的近5倍。因此后期研究可主要集中在XDH活性的增强上,比如将TEF1替换成更强的启动子PGK,过表达NADH氧化酶和XDH形成NADH/NAD的微循环等。

关键词：酿酒酵母木糖发酵木糖还原酶木糖醇脱氢酶转醛醇酶

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