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牛流行热病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

牛流行热病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：侯佩莉王洪梅何洪彬山东省农业科学院奶牛研究中心

引言/目的牛流行热是由牛流行热病毒（BEFV）引起的牛的急性、热性传染病,在我国多个省市爆发流行,给养牛业造成巨大的经济损失,被农业部2014年印发的《牛羊常见疫病防控技术指导意见》列为牛重点防控的疫病。目前对该病的防治尚无特效... 详细信息

引言/目的牛流行热是由牛流行热病毒（BEFV）引起的牛的急性、热性传染病,在我国多个省市爆发流行,给养牛业造成巨大的经济损失,被农业部2014年印发的《牛羊常见疫病防控技术指导意见》列为牛重点防控的疫病。目前对该病的防治尚无特效药,只能对病牛采取对症治疗以缓解症状。因此,建立准确、灵敏、特异的检测方法是防治本病的前提条件。材料与方法根据GeneBank中牛流行热病毒G基因（GenBank:JX234571.1,）保守序列,应用PrimerPremier5.0软件设计并合成引物对RT1和RT1-R。应用病毒RNA提取试剂盒提取BEFV的RNA,并进行RT-PCR反应合成cDNA。以合成的BEFVcDNA为模板,优化反应条件,建立SYBR-GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和溶解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。应用该方法对临床采集的10份疑似牛流行热病毒感染的牛全血进行检测。结果与讨论以合成的BEFV cDNA(10TCID/mL)为模板,优化反应条件,确定最佳引物终浓度均为0.25μmol/L,最佳退火温度为65℃,扩增片段大小为163bp。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异。以建立的该方法对BVDV等病毒进行特异性试验,均未见其他病毒的扩增,具有较好的特异性。取不同稀释度病毒的cDNA为模板进行荧光定量RT-PCR扩增,可检测到1TCID。同时进行3次批内重复试验和批间重复试验,同一浓度的S型曲线相似,Ct值基本相同,重复性好。应用该方法对临床采集的10份疑似BEFV感染的牛全血进行检测,检测阳性4份,高于普通RT-PCR方法的检出率（检出阳性3份）。实时荧光定量RT-PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、荧光技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点,极大地提高了检测的敏感性和特异性。在BEFV所有基因组中,G基因高度保守,故选用G基因保守区为参考。本实验分离获得了BEFV流行毒株,通过测定病毒的TCID,对病毒直接定量,用于对临床上牛感染流行热病毒早期病毒含量较低时的诊断。结论本研究成功建立了BEFV SYBR-GreenI荧光定量RT-PCR检测方法。具有较好的灵敏度、特异性和重复性,可用于牛流行热病毒临床血液、组织等样本的检测,对牛流行热病毒的流行与传播进行实时监测,为相关的基础研究提供技术支持。

关键词：牛流行热病毒特异性初步应用溶解曲线检测方法 RT-PCR

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我国九省羊的巴贝斯虫分布状况调查

我国九省羊的巴贝斯虫分布状况调查

引用

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：杨强刘爱红刘军龙李有全殷宏罗建勋关贵全家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省寄生虫学重点实验室农业部草食动物疫病重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所

羊的巴贝斯虫病是一种经蜱传播的血液原虫病,由绵羊巴贝斯虫、莫氏巴贝斯、粗糙巴贝斯虫和未定种等引起,感染动物出现发热、黄疸、贫血、血红蛋白尿、甚至死亡。该病在热带、亚热带、温带均有流行,给世界畜牧业造成严重的危害。在我国,... 详细信息

羊的巴贝斯虫病是一种经蜱传播的血液原虫病,由绵羊巴贝斯虫、莫氏巴贝斯、粗糙巴贝斯虫和未定种等引起,感染动物出现发热、黄疸、贫血、血红蛋白尿、甚至死亡。该病在热带、亚热带、温带均有流行,给世界畜牧业造成严重的危害。在我国,羊巴贝斯虫病最早于十九世纪八十年代在四川和黑龙江省发现并报道。中国农业科学院兰州兽医研究所虫媒病团队分离出几株羊的巴贝斯虫,并依据真核生物核糖体18S rRNA序列比对,将这些感染羊的巴贝斯虫可分为两组,即莫氏巴贝斯虫(.Babesia motasi)和巴贝斯虫未定种(Babesia ***)。2014年兰州兽医研究所虫媒病团队利用梨形虫核糖体18S rRNA基因设计了检测绵羊、山羊和传播媒介蜱体内羊巴贝斯虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法。该方法在检测牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、绵羊无浆体等均呈现阴性,而在检测莫氏巴贝斯虫临潭株、莫氏巴贝斯虫宁县株、莫氏巴贝斯虫天祝株、莫氏巴贝斯虫河北株和羊巴贝斯虫未定种新疆株中出现阳性反应。因此,该方法可以特异性检测羊巴贝斯虫的感染。本实验室利用建立的PT-PCR方法对采集于中国甘肃、内蒙古、辽宁、重庆、海南、浙江、贵州和湖北9个省382份羊血液样品,其中阳性样品132份,阳性率为34.6%。其中浙江采集的42份羊血液样品感染率最高,为69.4%。辽宁检测羊血液样品45份,阳性样品出现13份,感染率为28.9%,而重庆采集的55份血液样品感染率最低,为10.9%。可见不同省份的羊巴贝斯虫感染率差异很大。本研究首次应用实时荧光定量PCR对我国羊巴贝斯虫病的流行状况进行大范围的调查,更加准确的掌握羊巴贝斯虫病的流行情况,为进一步了解我国羊巴贝斯虫的分布情况和羊巴贝斯虫病防控策略的制定提供了可靠的流行病学信息。

关键词：羊的巴贝斯虫流行病学调查 Real-time PCR

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猪源附红细胞体二重PCR检测方法的建立及应用

猪源附红细胞体二重PCR检测方法的建立及应用

引用

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：付媛石团员徐丽华袁秀芳李军星方维焕浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江大学动物科学学院

目的:我们从前期的临床调查中发现浙江省猪群中流行三种猪源附红细胞体(Eperythrozoon简称附红体)病原,猪附红细胞体(Mycoplasmasuis MS)、小附红细胞体(Mycoplasmaparvum MP)和未定种附红细胞体(Candidate MvcoplasmaHaemosuisCMH),为了简化检测猪源附红体病原的方法,本研究建立了可以同时检测三种病原的二重PCR诊断方法并应用。方法:根据已扩增到的浙江省MS、MP和CMH的16S rRNA基因序列(序列号KC907396、JX489599和JX489601)的序列信息设计了6对引物,经过筛选,选取了2对引物MSF2(5′rAAATTAAAGGAGGCTGCCGMAAGGTG 3′)/MSR2(5′TACGCCCAATAAATCCGGATAATGCTC3′)和CMSF2(5′AAACTCTGATGGTACCTCCTGAATAAGTGA 3′)/CMSR2(5′CCTTCGCTGGGGATGTCAAACCT 3′),建立二重PCR检测方法并优化了反应条件,进行了特异性、敏感性和重复性试验。采用该法对浙江省2014年3-7月间16个猪场的80份血液样品进行了猪源附红体病原检测。结果:CMSF2/CMSR2和MSF2/MSR2两对引物置于同一个反应体系中PCR扩增,95℃预变性5min,94℃变性30sec,61.5℃退火30sec,72℃延伸30sec,共35循环,72℃后延伸5min。结果在400bp和500bp处有特异性的条带(如图1)。测序结果证实为384bp的MP和MS序列片段,以及532bp的CMH序列片段,与预期相符。特异性试验表明只有***/***和CMH模板可以扩增出特异性条带,猪丹毒杆菌、副猪嗜血杆菌、猪鼻支原体、猪滑液支原体、弓形虫等样品没有该条带。敏感性试验表明可以检测出CMH为300copy/μL,的D NA,***/***为30拷贝/μL的D NA。重复性实验结果相同,从而证明该检测方法具有很好的稳定性。用该法对2014年浙江省各地的16个猪场80份血液样品PCR检测结果显示有3个猪场为阴性,MS和MP阳性猪场12个,CMH阳性猪场为4个,总阳性率为38.3%。结论:本研究建立了同时检测三种猪源附红体的二重PCR检测方法,简化了检测步骤,该检测方法有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以应用于猪源附红体病原的临床调查研究。

关键词：猪附红细胞体病猪附红细胞体小附红细胞体二重PCR

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323株水产养殖源弧菌流行特征及耐药性分析

323株水产养殖源弧菌流行特征及耐药性分析

引用

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：刘旭马立才李健房文红中国水产科学研究院东海水产研究所农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室上海海洋大学水产与生命学院

【目的】本研究旨在了解我国重点水产养殖区水产品中弧菌的流行特征及其抗菌药物耐药现状。【方法】2012-2014年从浙江、江苏、福建和海南地区采集了南美白对虾、大菱鲆、半滑舌鳎、三疣梭子蟹样品,采用弧菌选择性培养基TCBS和Hsp60基因... 详细信息

【目的】本研究旨在了解我国重点水产养殖区水产品中弧菌的流行特征及其抗菌药物耐药现状。【方法】2012-2014年从浙江、江苏、福建和海南地区采集了南美白对虾、大菱鲆、半滑舌鳎、三疣梭子蟹样品,采用弧菌选择性培养基TCBS和Hsp60基因PCR扩增测序的方法进行了弧菌的分离与鉴定;采用CLSI推荐的琼脂稀释法测定了12种药物的敏感性;运用PCR法对相关的耐药基因进行了检测。【结果】共分离弧菌323株,其中副溶血弧菌占37.2%(120株),哈维氏弧菌占26.3%(85株),溶藻弧菌占18.0%(58株)、创伤弧菌占10.5%(34株)、鳗弧菌占4.3%(14株)、灿烂弧菌占2.2%(7株)、霍乱弧菌占1.5%(5株)。药敏结果显示,323株弧菌对氨苄西林、红霉素、庆大霉素、复方新诺明的耐药率较高,依次为64.8%、47.5%、46.7%、36.8%,其次为利福平(12.3%)、环丙沙星(11.8%)、多西环素(11.5%)、头孢曲松钠(9.6%)和氟苯尼考(4.3%),而头孢吡肟、美罗培南、氯霉素则100%敏感。在不同来源的弧菌中,分离自江苏工厂化养殖的大菱鲆和半滑舌鳎的菌株耐药情况最为严重,其中红霉素(57.1%,40/70)和复方新诺明(44.3%,31/70)显著地高于平均耐药水平(P<0.05),且该采样点分离的多重耐药菌株比例(78.6%,55/70)明显高于总体分离多耐菌株的比例(51.7%,167/323)。耐药基因检测结果显示:氨基糖苷类耐药基因(aadA:13.9%;aacA:21.1%;strB:31.9%)、磺胺类耐药基因(sul1:12.9%:sul2:30.0%)和喹诺酮类耐药基因(qnrA:13.3%;qnrVc:23.5%)的检出率相对较高,其次为四环素类耐药耐药基因(tetB:14.2%;terM:8.7%)、β-内酰胺类耐药基因(blaTEM-1:11.1%)和酰胺醇类耐药基因(floR:8.7%),而大环内酯类和碳青霉烯类耐药基因并没有检出。【结论】目前,我国部分地区水产养殖源弧菌主要以哈维氏弧菌26.3%(85/323)和副溶血弧菌37.2%(120/323)为主。此外,养殖源弧菌对一些临床上常用抗菌药物(青霉素类、大环内酯类、氨基糖苷类和磺胺类)的耐药已较为严重。因此,在水产养殖过程中应推进抗菌药物的合理使用,以控制耐药菌的产生和扩散从而提高水产品质量保证公共卫生安全。

关键词：水产养殖弧菌耐药性

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2014年春季伊犁地区蜱传性病原微生物分子流行病学调查

2014年春季伊犁地区蜱传性病原微生物分子流行病学调查

引用

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：陈秋语陈荣贵赵卫东陈泽任巧云罗金王素艳李凯刘小翠卢海燕刘光远家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所新疆伊犁州动物疾病控制与诊断中心

本实验于2014年春季对新疆伊犁地区五个县的牛、羊蜱传性疾病进行了调查,采集血样若干,提取基因组,运用PCR的方法在样品中检测包括巴贝斯虫、泰勒虫、无浆体、立克次体以及莱姆病螺旋体在内的共五类病原的感染情况,以了解我国新疆伊犁... 详细信息

本实验于2014年春季对新疆伊犁地区五个县的牛、羊蜱传性疾病进行了调查,采集血样若干,提取基因组,运用PCR的方法在样品中检测包括巴贝斯虫、泰勒虫、无浆体、立克次体以及莱姆病螺旋体在内的共五类病原的感染情况,以了解我国新疆伊犁地区蜱传疾病的感染率以及分布情况,为该区域蜱传性疾病的防制打下基础。在新疆伊犁地区选择了5个采样点,采集动物血液样品和蜱虫样本。采集的血样提取全血基因组,采集的蜱样鉴定种属后也提取基因组。利用经典的检测基因保守区域设计引物,运用PCR的方法检测血液基因组样品中的以上5类病原,并对检测结果进行分析。2014年在伊犁地区总共采集牛、羊血液样品共计233份,其中牛血液样品108份,羊血液样品125份。根据巴贝斯虫及泰勒虫18SrRNA序列设计通用引物,运用套式PCR的方法检测上述样品,共检出阳性123份(其中牛21份,羊102份),测序结果经比对后正确的有102份。通过序列分析,在这102份阳性样品中泰勒虫属有三种,分别是泰勒虫OT3(Theileria ***3)71份,水牛泰勒虫(Theileria buffeli)26份以及羊泰勒虫(Theileria ovis)1份;巴贝斯虫阳性样品有4份,为莫氏巴贝斯虫(Babesia motasi)。基于无浆体16S rRNA的基因序列设计引物,运用套式PCR检测上述样品,阳性结果共计122份(其中牛13份,羊109份)。通过序列分析,共有三种结果,分别是绵羊无浆体(Anaplasma ovis)68份,嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)51份以及Uncultured Anaplasma 3份。在上述血液样品中未检出莱姆病螺旋体。值得一提的是,以立克次体groEL为参照基因设计引物,在样品中扩增出了1份立克次体阳性样品,且序列分析后为正确结果。这也是迄今为止本实验室第一次从血液样品中扩增出的立克次体的阳性结果。蜱传病原对我国乃至世界家畜养殖业造成了严重的危害,因此,厘清诸如巴贝斯虫,泰勒虫以及其他蜱传性细菌病病原在家畜中的感染及流行情况,能够对这些病原的防控提供参考依据。

关键词：伊犁牛羊蜱传疾病流行病学调查

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前言

前言

引用

中国畜牧兽医学会信息技术分会2014年学术研讨会

物联网是"十二五"期间我国确定的重点战略性新兴产业。2011年11月28日,工业和信息化部依据《中华人民共和国国民经济和社会发展第十二个五年规划纲要》《国务院关于加快培育和发展战略性新兴产业的决定》,印发了《物联网"... 详细信息

物联网是"十二五"期间我国确定的重点战略性新兴产业。2011年11月28日,工业和信息化部依据《中华人民共和国国民经济和社会发展第十二个五年规划纲要》《国务院关于加快培育和发展战略性新兴产业的决定》,印发了《物联网"十二五"发展规划》。为了交流一年来我国在畜牧信息技术领域科学研究新进展,促进物联网等信息技术在畜牧业的转化与应用,中国畜牧兽医学会信息技术

关键词：《国务院关于加快培育和发展战略性新兴产业的决定》畜牧业中国畜牧兽医学会战略性新兴产业信息技术领域物联网

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牛病毒性腹泻病毒LJ36/14基因分型的研究

牛病毒性腹泻病毒LJ36/14基因分型的研究

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：朱远茂杨立新马磊任建乐薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病创新团队

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的以牛发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。BVDV与猪瘟病毒、绵羊边界病毒同属黄病毒科瘟病毒属,在血清学上有交叉反应。... 详细信息

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的以牛发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。BVDV与猪瘟病毒、绵羊边界病毒同属黄病毒科瘟病毒属,在血清学上有交叉反应。北欧一些国家通过严格检疫和扑杀措施已根除了牛病毒性腹泻,我国尚未开展BVDV的根除计划。BVDV目前仍然是我国养牛业面临一个重要病原,同时也是国内外组织培养用牛血清中一个主要外源病毒,对生物制品的生产和使用具有较大的潜在危害。2014年从黑龙江省发生呼吸道传染病的肉牛群采集了40份鼻腔棉拭子,经接种MDBK细胞后分离到一株BVDV,命名为LJ36/14。对该分离株的5‘端非编码区的RT-PCR产物进行了基因序列测定,BLAST结果表明该毒株与BVDV1型的BJ09 26和JS12/02毒株的部分序列同源性为99%以上。随后对其N基因的部分序列进行了测定,用MEGA5软件构建进化树,结果表明该毒株为一新的未知亚型,暂定为BVDV1v亚型。国外学者最早开启了BVDV基因分型的研究,至2005年已确定了BVDV1型有12个亚型（1a-11）。我国学者于2016年确定了猪源BVDV的ZM-95株为1m亚型。2008年日本学者确定了BVDV1型的1n和1o亚型。我们于2006年开展了BVDV诊断及流行病学调查研究,进行了BVDV基因分型的研究,初步确定了国内牛的BVDV主要流行毒株为BVDV1m亚型,其次为BVDV1b和BVDV1p亚型,其中BVDV1p亚型为一新基因亚型。而2015年国内的一篇研究报告亦表明BVDV1m亚型为主要流行毒株,其次为BVDV1b和BVDV1u亚型,其中BVDV1u亚型为国内首次确定的一个新亚型。到目前为止,BVDV1型已被分为22个基因亚型,其中亚洲流行主要有1m、1n、1o、1p、1 q、1u和1v等7个亚型。这些研究为我国BVDV诊断、分子流行病学调查及疫苗研发提供了有力的技术支持。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 LJ36/14 基因分型

来源：评论

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PRRSV HB-AG的ORF5与NSP2基因遗传变异分析

PRRSV HB-AG的ORF5与NSP2基因遗传变异分析

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：左奕袁万哲孙继国河北农业大学动物医学院河北省兽医生物技术工程技术研究中心

引言由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)已成为危害全球养猪业的重要经济性传染病之一。自2006年以来,高致病性PRRSV的流行和疫情爆发,给我国养猪业造成了巨大经济损失。且国内不断有PRRSV的变异分离株的报... 详细信息

引言由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)已成为危害全球养猪业的重要经济性传染病之一。自2006年以来,高致病性PRRSV的流行和疫情爆发,给我国养猪业造成了巨大经济损失。且国内不断有PRRSV的变异分离株的报道,表明变异毒株适应能力在不断增强,在我国境内流行也逐渐复杂化、扩大化。因此,及时掌握当地PRRSV流行变异情况,对于当地PRRSV的防控有着重要意义。而对ORF5和NSP2基因的遗传变异分析可以一定程度上反应整个病毒基因组的变异情况。本研究以我国分离到的一株高致病性PRRSV为材料,深入研究其ORF5和NSP2基因的遗传变异情况,旨在为今后PRRS的防控提供理论依据。材料与方法用于分析的毒株—PRRSV HB-AG于2014年分离自河北安国地区发生PRRS猪场的病猪脏器样本。根据GenBank已收录的PRRSV VR2333、HB-1a、CH-1a和JXA1等毒株核苷酸序列,通过DNAstar软件分析比较,运用Primer Permier 5软件设计引物,进行基因PCR鉴定以及ORF5、NSP2基因的扩增和序列测定分析。结果与结论本研究通过对分离的HB-AG毒株NSP2和ORF5基因的核苷酸序列进行遗传进化分析,结果表明PRRSV HB-AG株Nsp2编码区存在30个不连续氨基酸的缺失,且其ORF5第137位氨基酸为丝氨酸(S),第13、151位氨基酸为精氨酸(R),因此,本研究分离的毒株为具有强毒特性的高致病性野毒株。其Nsp2编码区和ORF5编码的氨基酸序列存在多处变异,表明该分离株与国内其他地区流行毒株并不一致,而且在本地区产生了新的变异。HB-AG的N-糖基化位点分别位于氨基酸序列的第30、34、44和51位,且其第33位突变为D,与疫苗株JXA1-R一致;此外,其第58、61、104和114位都存在碱基突变,而这些碱基的突变与致病性的关系,目前尚未有报道。HB-AG株属于最新分离,能在一定程度上反应当地最近的流行情况。PRRSVHB-AG与疫苗株JXA1-R同源性高达98%,且其33位的与疫苗株JXA1-R一致,所以该毒株可能是与疫苗毒株发生重组的新毒株。

关键词： PRRSV HB-AG 变异分析基因遗传

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表达小反刍兽疫病毒流行株H蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

表达小反刍兽疫病毒流行株H蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：杨蕾蕾李文良毛立郝飞张纹纹江杰元江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副黏病毒科、麻疹病毒属的成员,因主要感染小反刍动物而得名,特别是山羊高度易感。国际动物卫生组织(OIE)将PPRV感染列为必须上报的A类疾病,我国也将其列为一类动物疫病。2... 详细信息

引言小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副黏病毒科、麻疹病毒属的成员,因主要感染小反刍动物而得名,特别是山羊高度易感。国际动物卫生组织(OIE)将PPRV感染列为必须上报的A类疾病,我国也将其列为一类动物疫病。2007年西藏自治区首次报道该病疫情。2013年底开始PPRV再次传入我国并迅速传播至全国二十多个省区,造成巨大经济损失,严重威胁我国畜牧业的健康发展。PPRV H基因全长1852bp,开放阅读框大小为1830bp,编码的糖蛋白H有609个氨基酸,H糖蛋白具有神经氨酸酶活性和血凝素活性,且含有T细胞决定簇,在病毒与细胞膜结合过程中作为受体,是重要的保护性抗原。因此,利用H蛋白研制基因工程疫苗将在控制小反刍兽疫中发挥重要的作用。此次新传入的毒株与先前流行毒株相比,出现一定程度的变异,本研究克隆该流行株H基因,构建重组杆状病毒,获得重组蛋白,为后续研究提供有力工具。材料方法根据Genbank中上传的病毒基因组序列合成H蛋白基因序列,3'末端引入HA标签序列,克隆入Bac-to-Bac表达系统质粒pFastBacHT B中,经PCR、酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒转化DH10Bac,经两次蓝白菌落筛选,挑取白色菌落提取Bacmid,将PCR鉴定正确重组的Bacmid(rBac-H)转染Sf9昆虫细胞,连续传代观察细胞病变情况并采用PCR鉴定目的基因的存在,从而获得重组杆状病毒。进一步使用His和HA标签单抗进行Western blot试验鉴定重组蛋白的表达情况。结果讨论合成H基因,成功克隆入pFastBacHT B中,转化DH5t后,挑取菌落经PCR、酶切鉴定为阳性的质粒进一步经测序鉴定序列正确无误,符合阅读框。经两次蓝白菌落筛选,挑取白色菌落提取Bacmid,正确重组的Baemid经M13引物扩增获得约4300bp的条带。转染Sf9细胞后连续传代观察,至第3代接种后4天开始出现细胞病变,细胞变大变圆、脱落,证明获得重组病毒,并将其继续传代扩增,细胞病变产生加快加剧。提取病毒DNA,通过H基因的引物进行PCR检测获得1830bp的目的条带。使用His标签单抗进行Westernblot检测可显示68ku的重组蛋白条带,但HA单抗未检出目的条带,原因有待进一步探究。说明目的蛋白获得正确的表达,具有良好的抗原性。结论成功构建表达2014年PPRV流行毒株H蛋白的重组杆状病毒,蛋白获得正确表达,这将为进一步研究该病毒H蛋白的功能及PPRV疫苗和诊断方法的研究提供基础和材料。

关键词：重组杆状病毒流行毒株小反刍兽疫病毒流行株

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广西黄曲霉、烟曲霉遗传多态性分析

广西黄曲霉、烟曲霉遗传多态性分析

引用

第四届人畜共患病学术研讨会、2014年中国狂犬病年会、中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第四次学术研讨会

作者：王冬英黄维义 Jacques GUILLOT 广西大学动物科学技术学院广西530004 Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort Université Paris Est CréteilAgence Nationale de Sécurité SanitaireUMR BiparDynamycUniversité Paris Est94000 CréteilFrance

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