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第四届全国人畜共患病学术研讨会 2014年中国狂犬病年会中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第四次学术研讨会

作者：谢堃乔军孟庆玲彭叶龙赵海龙宋雪梅陈创夫才学鹏石河子大学动物科技学院动物疾病防控兵团重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种革兰氏阳性、兼性厌氧胞内寄生菌。该菌广泛存在于自然界中,易污染各种食品(肉、奶、海产品及蔬菜等),对环境的耐受性强,可在高盐浓度(可高达40%Na C1)以及宽泛的pH值(p H 3-12)... 详细信息

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种革兰氏阳性、兼性厌氧胞内寄生菌。该菌广泛存在于自然界中,易污染各种食品(肉、奶、海产品及蔬菜等),对环境的耐受性强,可在高盐浓度(可高达40%Na C1)以及宽泛的pH值(p H 3-12)和温度范围(0～45℃)环境中生长,是一种重要的人畜共患病原菌和四大食源性致病菌之一。最近的研究发现,非编码RNAs (non-coding RNAs, ncRNAs)对LM毒力和环境应激也发挥着重要的调控作用。为了解ncRNArli87对单核细胞增生李斯特菌环境应激的影响,本实验将rli87基因进行敲除,并利用同源重组技术构建ncRNArli87缺失株,将该缺失株在不同条件下进行培养测定其对环境适应能力。用单菌落计数的方法通过人工模拟高温、低温、高渗透压、酒精、酸碱性和氧化环境等应激反应,对比rli87缺失株与SB5野毒株活菌量。结果发现,与野毒株相比,rli87基因缺失株在低温、高温和常温的环境下OD600有上升趋势,表明rli87基因在温度应激中有着重要作用;两株菌在酸性环境下出现生长停滞;当pH=7环境下培养时,前4h缺失株的活菌量高于野毒株,6h开始野毒株活菌量明显高于缺失株;而碱性环境培养中的缺失株活菌量在整个时间段均高于野毒株,表明rli87基因在碱性环境应激中有上调的作用;根据活菌量计数,在高渗环境中野毒株与缺失株的生长差异不显著;在氧化环境下,两株菌出现生长停滞,活菌量计数随着时间的变化出现下降;3.8%ethanol环境中培养的12h内,缺失株的活菌量计数多于野毒株,前8h明显,后4h无明显差异;rsbV、rsbW、hpt、clp P、ctsR等环境应激基因转录水平均升高。本实验结果提示,rli87基因在LM对环境应激反应中有着重要的调控作用。

关键词：单核细胞增生李斯特菌同源重组 ncRNArli87基因环境应激

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牛和羊住肉孢子虫病病理学研究

牛和羊住肉孢子虫病病理学研究

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中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九次全国会员代表大会

作者：董辉陆瑶瑶党盛源杨玉荣河南农业大学牧医工程学院

研究目的:住肉孢子虫是呈世界性分布的食源性寄生虫,而人类是黄牛住肉孢子虫***和***的终末宿主,感染后可引起肠胃不适。我国黄牛和绵羊住肉孢子虫流行率在3.64%-98.1%,0.67%-100%,而河南地区牛、羊住肉孢子虫病的研究调查仅有一项膈肌... 详细信息

研究目的:住肉孢子虫是呈世界性分布的食源性寄生虫,而人类是黄牛住肉孢子虫***和***的终末宿主,感染后可引起肠胃不适。我国黄牛和绵羊住肉孢子虫流行率在3.64%-98.1%,0.67%-100%,而河南地区牛、羊住肉孢子虫病的研究调查仅有一项膈肌住肉孢子虫病的报道（82.5%,33/40）,所以本研究统计分析河南地区牛羊心肌住肉孢子虫的感染率、感染密度、感染强度、炎症反应。材料和方法:运用石蜡切片H&E染色技术和PCR技术,调查分析2014～2016年牛和羊心肌（黄牛405份,绵羊311份）食源性住肉孢子虫病的流行情况和感染强度。结果:黄牛住肉孢子虫感染率为49.38%（200/405,95%CI=44.54-54.23）,感染密度为5.17～8.73个/cm2,绵羊住肉孢子虫的感染率为32.48%（101/311,95%CI=27.51-37.87）,感染密度为7.06～32.02个/cm2。其中黄牛住肉孢子虫薄壁包囊占88.00%,厚壁包囊2.00%,混合感染10.00%,而绵羊住肉孢子虫薄壁包囊、厚壁包囊、混合感染的感染率分别为38.61%,31.68%,29.71%。牛、羊心肌消化液成功扩增出DNA长度为350 bp的牛住肉孢子虫基因片段、羊住肉孢子虫600 bp的基因片段,进而验证形态学结果。讨论:国外牛、羊住肉孢子虫的流行率分别在0.23%00%和16.58%3.3%[2]。国内关于牛、羊心肌住肉孢子虫报道的调查地域只有湘西,青海省等地,而流行率分别为3.64%-98.1%和0.67%-100%。本次调查河南七个地区牛、羊住肉孢子虫感染情况,牛、羊心肌住肉孢子虫阳性率分别为49.38%和32.48%。与国内外可查报道进行比较后,发现该寄生原虫在我国分布面积广,且感染程度高,从而给防控工作带来极大的困难;住肉孢子虫可以寄生于人和多种动物的横纹肌,且分布具有选择性,结合住肉孢子虫包囊壁薄厚的形态学特点可以作为鉴别住肉孢子虫的方法,而病理组织学观察和PCR结果显示牛和羊心肌中分别存在住肉孢子虫***、***和***、***,均对牛羊存在致病性,并且危害肉品质量安全。该研究为防控牛羊住肉孢子虫病,牛、羊肉品的安全监测提供参考依据。中原地区牛、羊心肌住肉孢子虫病流行情况首次报道。

关键词：牛羊住肉孢子虫病理学心肌

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2024年家畜环境与生态学术研讨会通知

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家畜生态学报 2024年第5期45卷 23-23页

作者：《家畜生态学报》编辑部不详

近年来,我国畜牧业快速发展,并取得了长足进步,但也面临产业整合调整、成为新的投资方向的复杂局面。特别是在国家环境与生态治理大背景下,畜牧产业必须快速适应社会发展大趋势,实现绿色与健康安全、智慧养殖。因此,畜牧产业对新工艺、... 详细信息

近年来,我国畜牧业快速发展,并取得了长足进步,但也面临产业整合调整、成为新的投资方向的复杂局面。特别是在国家环境与生态治理大背景下,畜牧产业必须快速适应社会发展大趋势,实现绿色与健康安全、智慧养殖。因此,畜牧产业对新工艺、新设施、新设备和新型饲养技术,现代化智能化管理与信息处理技术的需求不断增加。为适应新形势下的技术需求,由中国畜牧兽医学会家畜环境卫生学分会、家畜生态学分会、内蒙古自治区畜牧学会、内蒙古动物健康养殖安全生产学会主办,内蒙古农业大学动物科学学院、内蒙古自治区农牧业科学院、《家畜生态学报》编辑部承办,拟于2024年8月18日-8月21日在内蒙古自治区呼和浩特市联合举办“2024家畜环境与生态学术研讨会”,研讨我国养殖业中的生态养殖技术、环境卫生与工程、健康与智慧养殖、生物安全与疫病防控等有关科技问题。

关键词：家畜生态学信息处理技术环境卫生畜牧产业内蒙古农业大学生态养殖技术智能化管理饲养技术

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快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)检测体系的改进及应用

快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)检测体系的改进及应用

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第四届全国人畜共患病学术研讨会 2014年中国狂犬病年会中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第四次学术研讨会

作者：孙思才管利东李曼宋修庆侯继峰中国食品药品检定研究院

RFFIT是WHO推荐的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法,美国疾病预防控制中心狂犬病实验室、法国巴斯德研究所狂犬病实验室等国际知名狂犬病研究机构广泛应用,作为法定的狂犬病病毒中和抗体检测法被欧洲药典和我国药典收载。RFFIT主要应... 详细信息

RFFIT是WHO推荐的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法,美国疾病预防控制中心狂犬病实验室、法国巴斯德研究所狂犬病实验室等国际知名狂犬病研究机构广泛应用,作为法定的狂犬病病毒中和抗体检测法被欧洲药典和我国药典收载。RFFIT主要应用于狂犬病疫苗的免疫学效果评估,是狂犬病疫苗及中和抗体诊断试剂评价的关键技术。狂犬病病毒中和抗体效价是狂犬病人免疫球蛋白的关键指标,属于确认实验。在应用药典法检测狂犬病人免疫球蛋白狂犬病病毒中和抗体效价时发现:该法准确度及精密度不高,且人为因素影响大。我们参考我国药典及美国疾病预防控制中心和法国巴斯德研究所的实验方案,建立了准确度及精密度均较高的RFFIT检测体系,为准确测定狂犬病病毒中和抗体效价提供了可靠的技术支持。目的:建立准确度、精密度及灵敏度高的狂犬病病毒中和抗体效价的快速荧光灶抑制试验(RFFIT),并用于人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)中和抗体效价的测定(确认)。方法:将待测血清及标准品分别进行2、3及5倍系列稀释,攻击毒分别选择100、50、25及12.5FFD50。将各稀释度样品分别转移至96孔板,每稀释度4孔平行,加入等量攻击病毒混合后,37℃体外中和1h,接种BSR细胞,培养20小时后2-8℃固定,各孔加入荧光标记抗体染色,荧光显微镜以4×10倍下照相,并将照片平均分为40个格,计数阳性格数并计数百分比,格内含有1个或1个以上荧光灶为阳性格。结果:(1)以不同攻击毒分别以2、3及5倍系列稀释测定样品效价分别为:23.81、25.70及26.34IU/ml,2倍稀释为低,以2倍稀释12.5FFD50攻击毒最低为21.19IU/ml,以2倍稀释12.5FFD50攻击毒检测抗体效价其灵敏度可达6m IU/ml;(2)分别以100、50、25及12.5FFD50攻击毒测定样品效价分别为:28.92、25.91、23.71和22.57IU/ml,以12.5FFD50攻击毒为最低;(3)选择2倍孔外稀释、8孔平行以12.5FFD50攻击毒检测体系其CV%为批内3.61%、批间4.58%,而药典法为19.95%和23.97%;(4)操作中固定后干燥不宜控制,荧光不均匀且亮度低,而加水保湿荧光亮度强且均匀。结论:RFFIT采用2倍孔外稀释、以12.5FFD50攻击毒体系,每稀释度不少于4孔平行,用4×10倍下照相,并将照片平均分为40个格计数阳性格数,检测样品狂犬病病毒中和抗体效价准确度及精密度均较高,灵敏度可达6m IU/ml,结果客观准确,人为因素影响小,原始资料可永久保存,便于回顾性研究,可作为狂犬病病毒中和抗体效价的确认方法实验成立的条件为病毒回滴8-20FFD50范围内。

关键词：中和抗体效价狂犬病人免疫球蛋白精密度狂犬病病毒 RFFIT 免疫荧光美国疾病预防控制中心 FFD 稀释度抑制试验

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辣蓼黄酮正丁醇部位对伪狂犬病毒感染的猪脾淋巴细胞氧化应激调控作用及转录组学分析

辣蓼黄酮正丁醇部位对伪狂犬病毒感染的猪脾淋巴细胞氧化应激调控...

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十三次全国会员代表大会暨第十七次学术研讨会

作者：陈家骥赵怡胡庭俊广西大学动物科学技术学院

[目的]本研究旨在通过RNA-seq技术探究辣蓼黄酮正丁醇部位（N-butanol fraction of Polygonum hydropiper flavonoids,FNB）对伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）体外感染猪脾淋巴细胞氧化应激相关基因的调控作用。[方法] CCK-8法筛... 详细信息

[目的]本研究旨在通过RNA-seq技术探究辣蓼黄酮正丁醇部位（N-butanol fraction of Polygonum hydropiper flavonoids,FNB）对伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）体外感染猪脾淋巴细胞氧化应激相关基因的调控作用。[方法] CCK-8法筛选FNB（0,12.5,25,50,100,200,400μg/mL）安全浓度后,采用荧光探针法测定FNB对PRV感染猪脾淋巴细胞8 h、12 h、24 h、48 h时ROS水平以及ELISA、RT-qPCR法检测Nrf2、HO-1、iNOS转录和表达水平影响,获得药物最佳浓度及作用时间进行测序,对差异基因进行生物信息学功能分析。[结果]结果发现,各FNB处理组在8 h和12 h时与细胞对照组比较活性均无显著变化（P>0.05）,作用24 h时100μg/mL以下FNB处理对细胞活性无显著影响（P>0.05）,故选取25、50、100μg/mL FNB处理组进行后续试验;12-24 h时各FNB处理组与PRV组比较均能极显著降低ROS水平（P<0.01）;ELISA、RT-qPCR结果显示,12h时50μg/mL FNB处理组与PRV组比较能够显著下调iNOS、HO-1酶活性（P <0.05）,显著上调Nrf2酶活性（P <0.05）。选取50μg/mL FNB作用细胞12 h进行测序并进行生物信息学分析,结果表明,与细胞组相比,PRV感染后得到5482条差异基因,有3997个基因表达上调,1485个基因表达下调。GO富集分析显示差异基因（DEGs）主要富集于分子互作以及对病毒的防御反应、免疫应答等过程。KEGG富集分析显示DEGs主要富集于疾病和免疫通路以及程序性死亡通路;与PRV组相比,FNB处理后得到406条差异基因,有168个基因表达上调,238个基因表达下调。GO富集分析显示DEGs主要富集于细胞信号转导功能以及炎症反应、中性粒细胞趋化性等免疫功能。KEGG富集分析显示DEGs主要富集在IL-17信号通路、Toll样受体信号通路等免疫和炎症相关通路。[结论] FNB对病毒感染诱发的猪脾淋巴细胞的氧化应激具有调控作用。FNB处理后能够降低ROS水平,上调Nrf2同时下调iNOS和HO-1的转录和表达水平。FNB处理后引起免疫功能相关基因及信号通路（IL-17、Toll样受体信号通路）差异表达。FNB能干预PRV感染诱发的炎症反应。

关键词：辣蓼黄酮伪狂犬病毒氧化应激差异转录组

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广东地区狂犬疫苗接种效果评价

广东地区狂犬疫苗接种效果评价

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第四届全国人畜共患病学术研讨会 2014年中国狂犬病年会中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第四次学术研讨会

作者：张玲翁云层李婷婷王文敬张云 Jean-Pierre Allain 黎诚耀南方医科大学生物技术学院剑桥大学血液系

目的:评价广东地区人和犬狂犬疫苗接种效果,分析可能影响疫苗效果的因素,对接种者中和抗体水平进行评价,据结果判断后续是否需补打疫苗,也可作为狂犬病诊断的辅助检查指标。方法:用一次性采血针和含促分离胶的真空负压管采集待检者和犬... 详细信息

目的:评价广东地区人和犬狂犬疫苗接种效果,分析可能影响疫苗效果的因素,对接种者中和抗体水平进行评价,据结果判断后续是否需补打疫苗,也可作为狂犬病诊断的辅助检查指标。方法:用一次性采血针和含促分离胶的真空负压管采集待检者和犬全血,置于4℃冰箱1小时后,分离出血清,采用世界卫生组织(WHO)和国际兽医组织(OIE)标准,使用病毒荧光抗体中和方法(FAVN)测定人或犬狂犬疫苗接种完成后,半月-1月内的血清中和抗体效价。共采集人血清样品187人份,犬血清3份。结果:WHO和OIE狂犬病专家委员会认为血清抗体水平≥0.5IU/ml,可以抵抗狂犬病毒的感染。187人份血清样品中,11人份血清中和抗体水平<0.5 IU/ml,176人份血清中和抗体水平≥0.5IU/ml。3份犬血清,其中1份检测为0 IU/ml,另外2份结果>0.5 IU/ml。对11人份血清对应检测者既往身体状况分析,其中1人为狼疮性肾炎患者,其他10人既往体健,无服用免疫抑制类药物史。这10人中,青壮年8名,年龄介于17-42岁之间,抗体水平介于0.22 IU/ml～0.38 IU/ml之间。另有2名抗体水平未达到保护作用的分别是1名老年人(71岁)和1名幼儿(2岁零10个月),结果均为0.22 IU/ml。有3人份血清为同一个体(51岁),分别检测的是接种最后一针后17天,25天和45天的血清中和抗体量,分别为5.92IU/ml,4.5IU/ml,1.5IU/ml。另有2人份血清来自同一个体(17岁),第一次接种完成后,抗体水平为0.06IU/ml,按照我们建议,补打疫苗后,抗体水平达到4.5 IU/ml。还有1例特殊病人,青年(21岁),被野狗咬伤拇指后,未注射疫苗,狂犬中和抗体检测达到0.66 IU/ml。分析:一般接种狂犬疫苗后15～20天左右产生抗体,1个月左右抗体水平达到高峰,此后抗体水平缓慢下降,一般半年左右检测不到,但接种狂犬疫苗后,调动机体免疫记忆细胞,中和抗体很快就能上升到保护水平。判断接种的疫苗是否生效,可在全程疫苗接种完后半个月左右检查血清抗狂犬病毒抗体水平。检测结果为0 IU/ml者,可能与其患有自身免疫系统疾病,一直服用免疫抑制药物,抑制了机体正常的免疫反应有关,狂犬疫苗注射后未刺激机体免疫系统产生抗体;老年人和幼儿未达到保护水平,可能与老年人机体免疫系统退化,而幼儿机体免疫系统尚未发育成熟有关。对于另外8名青壮年,按疗程接种完疫苗后,抗体水平在0.22IU/ml～0.38IU/ml之间,这可能与个体自身差异有关,对于这些人群,我们建议继续补打狂犬疫苗两针。2人份血清待检者属于这种情况,在补打疫苗后抗体水平能够达到抵抗狂犬病毒感染的水平。1例特殊病人为某医院神经内科送检血清,他被野狗咬伤拇指后,未清理伤口也未注射狂犬疫苗,但抗体水平达0.66 IU/ml,为狂犬病毒刺激机体免疫系统产生的抗体,综合患者临床表现及该项指标,医生最终确诊为狂犬病人,病人最后经抢救无效死亡。同一血清三人份者,因其被狗咬后,精神高度紧张,待检者自身要求采集不同时间点的三次血清进行检测,结果显示抗体水平是达到国际标准的,但随着时间不断下降,下降的快慢因人而异。因为该抗体不是终生免疫抗体,抗体在体内是缓慢下降的,一般半年左右检测不到,因此一旦被狗咬后,还是要注射狂犬疫苗。其余175人份(去除狂犬病人)血清中和抗体≥0.5IU/ml,提示即使体内有狂犬病毒,该中和抗体也可以抵抗狂犬病毒的感染,从而解除人们精神上长期对狂犬病毒感染的担忧。三份犬血清,其中结果为0 IU/ml的,只是半年前注射过1次狂犬疫苗,另外两只犬,每年都注射狂犬疫苗,抗体水平能达到OIE标准。综上所述,狂犬疫苗接种有效率达94%(175+2/189),广东地区人和犬狂犬疫苗接种效果良好。影响接种效果的因素可能有年龄、身体状况、是否应用免疫抑制剂等有关,对于青壮年按规定接种完疗程后,未达到国际标准,可能是存在个体的差异,一般可通过补打疫苗的方式解决。

关键词：狂犬疫苗接种中和抗体抗体水平狂犬病毒广东地区

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天然黄酮类化合物抗犬骨肉瘤细胞活性筛选及先导化合物新藤黄酸抗瘤机制的研究

天然黄酮类化合物抗犬骨肉瘤细胞活性筛选及先导化合物新藤黄酸抗...

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中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十一次会员代表大会暨第26次学术研讨会

作者：杨天元范宏刚东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物比较医学重点实验室

犬骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一种常见的发生于犬骨组织的恶性肿瘤,因其具有生长速度快,转移性强,化疗易产生耐药性等特性,在兽医领域OS是一种极难于诊疗的恶性肿瘤。犬OS在犬骨类肿瘤中占比高达80%以上,并多发于罗威纳犬、金毛寻回猎... 详细信息

犬骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一种常见的发生于犬骨组织的恶性肿瘤,因其具有生长速度快,转移性强,化疗易产生耐药性等特性,在兽医领域OS是一种极难于诊疗的恶性肿瘤。犬OS在犬骨类肿瘤中占比高达80%以上,并多发于罗威纳犬、金毛寻回猎犬和拉布拉多犬等中、大型犬。OS患犬高预后不良及诊疗困难,给饲养家庭和基地带来沉重的经济和精神压力。探寻动物OS有效治疗药物及先进诊疗技术始终是兽医肿瘤性疾病防治领域的研究热点与难点。近年来发现部分黄酮类化合物具有高效且特异的抗瘤功效,使得这类化合物在多领域内研究不断深入。尽管当前用于犬OS诊疗的药物及技术手段众多,但整体疗效不尽人意,且现今常用的化药毒副作用和耐药现象较为明显,仍需对新型、低毒、有效药物进行系统科学地挖掘,同时揭示其深在作用机制,以便更为精准使用。内源竞争RNA机制(Competing endogenous RNAs,ceRNA)的阐明是肿瘤明确病因、准确诊断,以及科学治疗中重要的研究环节,基于此网络构建及试验验证可全面挖掘与显现肿瘤特异性编码及非编码RNA作为诊疗干预靶点的潜力。综上所述,本研究首先选用犬OS细胞系McKinley细胞,通过天然黄酮类小分子化合物库进行高通量药物筛选,并进行体内、外安全性评估及化合物抗瘤效用验证,确定抗犬OS有效的先导黄酮类化合物;然后通过高通量全转录组学测序、基因预测网络构建,以及双荧光素酶基因报告检测等生物及信息技术手段阐明先导黄酮类化合物对犬OS细胞的抗瘤机制。本试验选择使用犬OS细胞系,选择包含339种天然黄酮类化合物的小分子筛选库,使用30μM、10μM,以及5μM梯度孵育细胞基于对犬OS细胞毒性作用进行筛选,选择抑制率均高于50%的药物进行细胞毒性筛选及药物抗瘤曲线摸索,明确最低浓度药物。应用原代成骨细胞、犬肾细胞,以及裸鼠皮下移植瘤手段,从体内、外对先导化合物的抗瘤效用及安全性进行评估。体外应用先导化合物干预犬OS细胞恶性生物学行为明确其抗瘤效应,并建立差异细胞系进行全转录组学测序,筛选差异编码及非编码RNA,完成富集分析和ceRNA预测互作网络的构建,使用miRNA mimics和inhibitor、过表达质粒及siRNA对先导化合物抗犬OS细胞恶性生物学行为进行干预,完成预测机制的验证。通过双荧光素酶基因报告明确编码RNA与非编码RNA之间的靶向效果,最终阐明先导化合物抗瘤作用机制。(1)天然黄酮类化合物抗犬OS先导化合物的筛选及抗瘤作用的验证1)应用天然黄酮类化合物库中339个化合物以30 nM浓度孵育犬OS细胞48 h,抑制率高于50%的化合物共72个;10 nM浓度孵育犬OS细胞48 h,抑制率高于50%化合物共29个;5 nM浓度孵育犬OS细胞48 h,抑制率高于50%化合物共10个。通过较大剂量范围初步拟合计算各有效化合物对犬OS细胞抑制率接近50%的浓度,分别约为补骨脂查耳酮(4.05 hM)、p-倒捻子素(3 hM)、光甘草醇(4.3 hM)、苦参醇A (4.77 nM)、桑根皮素(4.47HM)、山竹子素(2.5nM)、新藤黄酸(Gambogenicacid,GNA)(0.4nM)、异银杏素(2.75HM)、银杏黄素(1.2nM)、紫花杜荆素(1.51 nM),其中有效浓度最低的为新藤黄酸,有效浓度最高的为苦参醇A。2)通过多层级梯度浓度干预,准确绘制GNA抑制犬OS细胞曲线,明确GNA对犬OS准确IC50值为280nM。提取犬原代成骨细胞通过ALP、OCN、OPN,以及RUNX2免疫荧光染色成功鉴定并应用于GNA安全性评估。GNA浓度为360 nM对犬OS细胞抑制率接近100%,但对犬原代成骨细胞及犬肾细胞的抑制率均低于50%。选择GNA对犬OS细胞抑制率约为30%、50%,以及70%的3个剂量240 nM、280 nM,以及320 nM干预48 h后发现,GNA能够显著抑制犬OS细胞增殖水平、平板克隆形成作用、细胞划痕愈合能力、Transwell小室迁移及侵袭能力,并促进OS细胞凋亡、阻滞细胞周期处于G0/G1期,GNA对上述恶性生物学行为的抑制作用均体现出剂量依赖性。在体外研宄中表明,GNA能够显著抑制犬OS细胞的恶性生物学行为,并且对犬成骨细胞及犬肾细胞具有较低毒性作用。3)对Balb/c-nude裸鼠进行皮下注射犬OS细胞制造56d裸鼠皮下移植瘤模型,GNA(4 mg/kg)隔1 d进行腹腔注射。结果显示相比于control组,GNA组裸鼠成瘤的生长趋势、瘤体的体积及重量均显著受到抑制。在病理结构上观察犬OS细胞在56 d裸鼠成瘤模型构建后没有产生显著的器官迁移现象,并且GNA对心脏、肝脏、脾脏、肾脏,以及肺脏的病理结构没有显著影响。表明GNA在体内能够显著抑制犬OS细胞成瘤效应,并且具备脏器

关键词：犬骨肉瘤新藤黄酸 miRNA-138a 天然化合物库 McKinley细胞

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