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巨噬细胞移动抑制因子与H5N1亚型流感病毒性肺炎的相关性研究

巨噬细胞移动抑制因子与H5N1亚型流感病毒性肺炎的相关性研究

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：侯小强冯娜夏咸柱高玉伟孙培录杨松涛军事医学科学院军事兽医研究所吉林大学畜牧兽医学院

H5N1亚型流感的频繁发生及对哺乳动物和人类的跨种间感染,已经对人类健康安全构成了极大的威胁。但目前高致病性禽流感病毒(HPAIV)的高致病性仍不是十分清楚。近些年来的研究表明:H5N1流感病毒的高致病性与细胞因子风暴有关,病毒感染诱... 详细信息

H5N1亚型流感的频繁发生及对哺乳动物和人类的跨种间感染,已经对人类健康安全构成了极大的威胁。但目前高致病性禽流感病毒(HPAIV)的高致病性仍不是十分清楚。近些年来的研究表明:H5N1流感病毒的高致病性与细胞因子风暴有关,病毒感染诱导机体免疫系统紊乱,导致细胞因子作用失衡可能是H5N1流感病毒高致病性的一个重要因素。巨噬细胞移动抑制因子(MIF)因具有抑制单核-巨噬细胞移动作用而得名。MIF能抑制巨噬细胞游走,促进巨噬细胞在炎症局部浸润、增生、激活及分泌致炎细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8等引发过激的炎症反应,损伤机体组织细胞。本研究应用建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法,对人工感染H5N1流感病毒后不同时间采集的小鼠肺脏组织样本中MIFmRNA水平进行了测定。结果表明:攻毒后6hMIFmRNA表达含量较高;24h、60h、72h时mRNA表达含量约为6h的1/2-2/3,说明MIF作为促炎症细胞因子在H5N1亚型流感病毒感染后炎症的早期发挥了重要的促炎症作用。

关键词：巨噬细胞移动抑制因子 H5N1流感病毒性肺炎实时荧光定量RT-PCR

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NA-1株鹅源新城疫病毒基因组cDNA感染性克隆的获得

NA-1株鹅源新城疫病毒基因组cDNA感染性克隆的获得

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：常爽丁壮李娜徐明吉林大学预防兽医学国家重点学科动物重要病原与疫病研究室

结合鹅源新城疫在我国许多省、市和地区的流行和发生,同时在我国还未有新城疫病毒弱毒株用于疫苗的制备等方面研究的报道。因此在研究NA-1株基因组功能的同时,研究其减毒机理,针对鹅源新城疫病毒NA-1株人工构建弱毒疫苗候选株,从而补充... 详细信息

结合鹅源新城疫在我国许多省、市和地区的流行和发生,同时在我国还未有新城疫病毒弱毒株用于疫苗的制备等方面研究的报道。因此在研究NA-1株基因组功能的同时,研究其减毒机理,针对鹅源新城疫病毒NA-1株人工构建弱毒疫苗候选株,从而补充和完善现有鹅源新城疫在预防免疫方面的缺陷,为该病的防制提供理论依据和技术支撑,以尽快控制新城疫的广泛传播与流行,促进我国养鹅业健康发展。因此本研究根据NA-1株鹅源新城疫病毒全基因组序列设计6对特异性引物,分段RT-PCR扩增出基因组各DNA片段(除基因组部分末端序列),利用基因组cDNA本身含有的酶切位点,分别将各DNA片段顺次连接到pCI-neo表达载体中,构建获得病毒基因组大部分cDNA克隆(46-15066nt)。通过利用位于病毒基因组leader和trailer序列中的Spl I位点非定向插入到经Spl I酶切消化的微型基因组microNDV,并通过PCR及测序鉴定其方向性。将获得的阳性cDNA感染性克隆与3个辅助质粒pCI-NP、pCI-P及pCI-L共转染VT7细胞(由本实验室筛选的能够稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系),经转录、复制及病毒粒子包裹过程体外获得NA-1株鹅源新城疫病毒。NA-1株鹅源新城疫病毒基因组cDNA感染性克隆的成功构建将为我们获得人工致弱的新城疫病毒rNDV打下基础。这不仅为鹅源新城疫病毒感染的发病机制研究提供理论基础,同时对开发新型的人工致弱的鹅源新城疫病毒弱毒疫苗株提供广阔的应用前景,对控制鹅副粘病毒病的流行和发生也具有重要的意义。

关键词： NA-1株鹅源新城疫病毒 cDNA感染性克隆病毒拯救

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分泌抗IBDV和鸡志贺菌LPS单抗杂交瘤细胞株的建立

分泌抗IBDV和鸡志贺菌LPS单抗杂交瘤细胞株的建立

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：刘秋燕任向阳张昶王江辉杨霞陈陆刘红英王川庆河南农业大学

利用鸡传染性法氏囊病毒(IBDV,He4株)和鸡志贺菌(hn03株)LPS加入特殊免疫增强剂作为混合抗原,免疫小鼠后用一次融合、分别筛选的方法,获得了能分别稳定分泌抗2种抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。通过间接ELISA方法筛选,建立了4株抗He4IBD... 详细信息

利用鸡传染性法氏囊病毒(IBDV,He4株)和鸡志贺菌(hn03株)LPS加入特殊免疫增强剂作为混合抗原,免疫小鼠后用一次融合、分别筛选的方法,获得了能分别稳定分泌抗2种抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。通过间接ELISA方法筛选,建立了4株抗He4IBDV的杂交瘤细胞株,3株抗鸡致贺菌毒素LPS的杂交瘤细胞株,免疫球蛋白均为IgG2。分泌的抗IBDV单克隆抗体与AIV、NDV、PRV、PRRSV、LPS无交叉;分泌的抗鸡志贺菌毒素LPS单克隆抗体与AIV、NDV、PRV、PRRSV、IBDV无交叉反应;表明所选杂交瘤细胞株特异性较高。He4IBDV杂交瘤细胞的培养上清和腹水效价分别为达到1:25600、1:102400以上;LPS杂交瘤细胞培养上清和腹水效价为1:102400、1:819200以上。这两种杂交瘤细胞分泌的抗体均有良好的热稳定性。腹水经辛酸硫酸铵纯化后,蛋白含量分别为78.45mg/mL、88.65mg/mL。此两种单克隆抗体的获得为鸡传染性法氏囊病和鸡志贺氏菌病的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。与用单一纯化抗原免疫小鼠的传统方法相比,本研究建立的混合免疫、分别筛选方法,仅一次免疫、一次融合就可选出分别分泌两种抗不同抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,是一种建立杂交瘤细胞株的高效方法,不但节约实验材料、降低了成本,而且节省了时间和人力,大大提高了建立杂交瘤细胞株的工作效率。原来需要三个或更多人才能完成的工作,现在一个人就可以完成。这对杂交瘤技术的学术研究和实际应用均具有重要意义。

关键词：鸡传染性法氏囊病毒 LPS 混合免疫一次融合杂交瘤细胞单独筛选单克隆抗体

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犬细小病毒病研究进展

犬细小病毒病研究进展

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中国畜牧兽医学会养犬学分会第十二次全国养犬学术研讨会

作者：叶俊华刘清津李刚公安部南昌警犬基地江西农业大学动物科技学院中国刑警学院警犬技术系

犬细小病毒病,又称犬细小病毒性肠炎,是由犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)引起的一种高度接触性传染病。本病以剧烈呕吐、出血性肠炎、白细胞显著减少为主要特征,不同品种和年龄的犬都易感,在幼犬中的发病率和死亡率都很高,症状与... 详细信息

犬细小病毒病,又称犬细小病毒性肠炎,是由犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)引起的一种高度接触性传染病。本病以剧烈呕吐、出血性肠炎、白细胞显著减少为主要特征,不同品种和年龄的犬都易感,在幼犬中的发病率和死亡率都很高,症状与猫泛白细胞减少症相似。犬细小病毒病分布于全世界,目前广泛流行于我国华北、东北、华南、西南等地,是危害我国养犬业最主要的传染病之一。本文对近年来犬细小病毒病的病原学、特别是基因型的调查研究,新的流行病学特点及临床表现,诊断及防治方法等进行了综述。

关键词：犬细小病毒病原诊断防治

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猪群中戊型肝炎的流行病学调查与分析

猪群中戊型肝炎的流行病学调查与分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：张厚勇陈东升张佳思侯康伟伍宜权张瑞竹张仪刘正飞华中农业大学农业与微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院武汉 430070

(目的)调查华中地区不同猪群中戊型肝炎病毒(HEV)感染情况和流行特征,为控制HEV在人畜间的传播提供依据。(方法)随机采集4个不同养猪场血清样品80份,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗-HEV IgG抗体,用统一制定的流行病学调查表进行分... 详细信息

(目的)调查华中地区不同猪群中戊型肝炎病毒(HEV)感染情况和流行特征,为控制HEV在人畜间的传播提供依据。(方法)随机采集4个不同养猪场血清样品80份,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗-HEV IgG抗体,用统一制定的流行病学调查表进行分析。在此基础上,从2007/2010年我们收集湖北、河南、安徽及湖南四省猪临床肝脏样品及肛拭子样品共583份,应用巢式PCR(逆转录套式聚合酶链,RT-nPCR)方法进行HEV RNA检测,将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒并测序,利用生物学软件进行并对其进行遗传进化分析和绘制进化树。(结果)4个猪场80份血清中HEV阳性血清56份,抗-HEV抗体阳性高达70.0%。四个猪场阳性率分别为分别为70%,80%,70%和60%。HEVRNA总阳率为9.6%(56/583),肝脏中阳性率为15.55%(21/135),肛拭子样品中阳性率为7.81%(35/448)。13个猪场中有8个猪场同时存在HEV,猪场阳性率达61.53%,其中肛拭子HEV RNA阳性率2.0%-18.33%,肝脏中阳性率为3.84%-28.37%,表明肝脏中HEV RNA的检出率明显高于肛拭子。遗传进化分析表明:所分离毒株均属于基因4型,38株阳性毒株之间同源性为92-100%,与戊型肝炎病毒基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型同源性分别为77%、77%、87%、96%。以该核苷酸片段绘制的遗传进化树显示,从肛拭子中分离的毒株(FJ445406)均与毒株DQ279091株处在同一分支上,属于基因4型;但其中肝脏中分离的毒株(GQ202266.1)虽然处在4型分子上,但和4型人源毒株处在一个亚支,属于4型中另一亚型,提示该毒株可能是由人源毒株演化而来。结论:研究表明华中地区猪HEV在不同猪场普遍存在,但总体来讲,华中地区猪源HEV基因型相对稳定,属同一基因型,提示猪是HEV的主要传染源之一。该研究为掌握华中地区的猪HEV的流行及基因型分布奠定了基础。

关键词：戊型肝炎病毒猪群 HEV 流行病学

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鸭IFN-α成熟片段基因的原核表达及抗细胞培养中鸭瘟强毒研究

鸭IFN-α成熟片段基因的原核表达及抗细胞培养中鸭瘟强毒研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：龚永强程安春汪铭书杨梅张瑶陈斌四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川省兽医防疫总站

利用PCR从重组质粒PBV220-IFN-α中扩增鸭α干扰素(IFN-α)成熟蛋白基因并克隆到PMD18-T载体,测序鉴定后将其连接到原核表达载体pET32a+,转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得高效表达。表达的重组蛋白分子量大小约37KD,以包涵体形式存... 详细信息

利用PCR从重组质粒PBV220-IFN-α中扩增鸭α干扰素(IFN-α)成熟蛋白基因并克隆到PMD18-T载体,测序鉴定后将其连接到原核表达载体pET32a+,转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得高效表达。表达的重组蛋白分子量大小约37KD,以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30%。利用镍金属螯合介质填料对表达产物进行纯化,经过复性后加入长成单层的鸭胚成纤维细胞(DEF)作用l8h,接种100PFU鸭瘟病毒(DPV)强毒后,利用实时定量PCR检测1h、4h、9h、15h、23h、31h、39h、47h、55h、63h DPV的数量变化。结果:在DPV感染后15h内,重组鸭IFN-α抗DPV组的病毒核酸拷贝数与不加鸭IFN-α的阳性对照组之间差异不显著(P>0.05);从23h开始鸭IFN-α保护组的核酸拷贝数低于阳性对照组并在感染后47h-55h其拷贝数差异达到最大,差异显著(P<0.05);与阳性对照组的DPV拷贝数相比,鸭IFN-α保护组在55h时能减少病毒108.83个核酸拷贝数,相对抑制率为80%。表明重组鸭IFN-α能明显抑制对数期的DPV复制,具有进一步临床应用的潜力。

关键词：鸭IFN-α成熟基因原核表达稀释复性抗DPV强毒

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传染性法氏囊病病毒多表位模拟肽串联基因的表达与免疫原性分析

传染性法氏囊病病毒多表位模拟肽串联基因的表达与免疫原性分析

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：王永山范红结张晓民李银肖焕娟南京军区军事医学研究所南京军区疾病预防控制中心江苏省农业科学院兽医研究所南京农业大学动物医学院

用5株传染性法氏囊病病毒(IBDV)单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上,将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后,构建原核表达质粒pET-5epis,在大... 详细信息

用5株传染性法氏囊病病毒(IBDV)单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上,将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后,构建原核表达质粒pET-5epis,在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r5EPIS,经SDS-PAGE分析,r5EPIS占菌体总蛋白的15%、分子量10kDa。用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体对r5EPIS进行免疫印迹对比分析,结果表明,r5EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r5EPIS经皮下注射免疫兔,400μg/只/次,免疫2次,间隔7d,用IBDV间接ELISA检测血清抗体,第一次免疫7d后抗体效价为1:4000,第二次免疫14d后抗体效价升高到1:256000,说明r5EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r5EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡,50μg/只/次,免疫2次后,血清抗体效价可达到1:12800,用200个ELD50IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡,r5EPIS免疫组全部存活,而对照组的死亡率为93.3%(14/15),证明r5EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答,预示构建的5epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。

关键词：传染性法氏囊病病毒抗原表位表达免疫原性

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鉴别诊断禽流感野毒感染与疫苗接种的ELISA方法的建立

鉴别诊断禽流感野毒感染与疫苗接种的ELISA方法的建立

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：贺番曹瑞兵王涛梁成珠陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室

根据GenBank公布的禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV))序列设计引物,用PCR方法扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的非结构基因-NS1基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中,获得了重组表达质粒PET-NS1。阳性质粒转化宿主菌BL2... 详细信息

根据GenBank公布的禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV))序列设计引物,用PCR方法扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的非结构基因-NS1基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中,获得了重组表达质粒PET-NS1。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,高效表达了NS1蛋白,目的蛋白以包涵体的形式存在。确定了工程菌的最佳诱导条件:IPT G终浓度为0.7mmo1/L,诱导时间为5h。Western-blot分析表明重组AIV NS1蛋白具有良好的抗原性,NS1融合蛋白经His-bind柱子纯化后获得纯度较高的NS1蛋白。并以此作为诊断抗原包被酶标板,建立了检测AIV NS1蛋白抗体的间接ELISA方法。该ELISA能区分禽流感病毒感染鸡和禽流感灭活疫苗接种鸡的血清样品,但不能区分感染禽流感的亚型。进一步试验确定了重组抗原最佳包被浓度为1.5μg/mL,血清的最佳稀释倍数为1:40,酶标二抗的最佳工作稀释度为1:2000。初步确定阳性判定标准为,待检血清OD490>0.3,且待检血清OD490/阴性血清OD490>2.1。因此,本研究应用AIV NS1蛋白初步建立区分禽流感野毒感染和灭活疫苗免疫鸡血清样品的ELISA,为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了一种特异、敏感的方法。

关键词：禽流感 NS1蛋白原核表达间接ELISA 鉴别诊断

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SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立及应用

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立及应用

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：黄国君汤承杨发龙兰道亮岳华西南民族大学生命科学与技术学院

根据GeneBank发表的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成一对引物,建立了基于SYBR GreenⅠ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR),用于CDV的定量检测。以含有87bp扩增产物的pGM-T载体质粒为阳性对照,构建了标准曲线,并对... 详细信息

根据GeneBank发表的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成一对引物,建立了基于SYBR GreenⅠ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR),用于CDV的定量检测。以含有87bp扩增产物的pGM-T载体质粒为阳性对照,构建了标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行了评价,及与常规RT-PCR及胶体金免疫检测技术(GIA)进行比较研究。结果表明,该方法具有良好的特异性,只能从CDV阳性样本检出阳性信号,PCR产物经凝胶电泳、克隆、测序,证实为CDV的特异片断;检测的线性范围广,在5.2×102～5.2×107拷贝之间有良好的线性关系,相关系数为0.9998;敏感度高,最低检测限为52拷贝,比常规RT-PCR高103倍,比GIA高105倍;重复性好,组内变异系数为0.51～1.90%,再现性好,组间变异系数为1.96～2.63%。用建立的RRT-PCR检测11例犬瘟热临床疑似病例,阳性率为11/11,随机抽取3份阳性样本的扩增产物测序,证明为CDV的特异序列,而GIA检测的阳性率为10/11;用建立的RRT-PCR对犬二联、四联、五联、六联弱毒活疫苗中的CDV进行定量,其含量在1.24×105～4.88×105拷贝/头份之间。本研究为CDV临床样本提供了快速、特异、敏感的检测手段,也为CDV的定量研究奠定了基础。

关键词：犬瘟热病毒 SYBR GreenⅠ 实时荧光定量RT-PCR

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间接ELISA鉴别诊断自然感染与免疫接种鸡群禽流感病毒抗体

间接ELISA鉴别诊断自然感染与免疫接种鸡群禽流感病毒抗体

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：王琰孙建和陆承平严亚贤刘佩红王建周锦萍上海交通大学农业与生物学院南京农业大学动物医学院上海市畜牧兽医站

【目的】通过间接ELISA,在群体水平上,鉴别诊断自然感染与免疫接种鸡群禽流感病毒抗体。【方法】通过套式RT-PCR扩增,获得H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的编码DNA。将所得的编码DNA插入pET-32a(+),构建出能够表达NS1蛋白的重组表达载体。将... 详细信息

【目的】通过间接ELISA,在群体水平上,鉴别诊断自然感染与免疫接种鸡群禽流感病毒抗体。【方法】通过套式RT-PCR扩增,获得H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的编码DNA。将所得的编码DNA插入pET-32a(+),构建出能够表达NS1蛋白的重组表达载体。将该载体导入到大肠杆菌BL21细胞中,在适当温度和IPTG诱导下表达,采用SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定所表达的蛋白,并对重组蛋白进行纯化。利用纯化的重组禽流感NS1蛋白作为抗原建立间接ELISA,测定反应的最佳条件。用已建立的间接ELISA,检测禽流感H9N2活毒感染、灭活疫苗免疫的鸡群中的NS1抗体水平,确定ELISA阴、阳性临界值,以及鸡群的最少检测样本数,以鉴别诊断整个鸡群是否感染禽流感野毒。【结果】试验所得重组表达产物为46000的禽流感病毒NS1融合蛋白。表达产物经纯化后,获得1-3mg/mL禽流感病毒NS1融合蛋白。所建立的ELISA,NS1抗原的最佳包被浓度为40μg/mL,抗体的最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗的最佳稀释倍数是1:10000,抗原抗体最佳反应时间均为1h,ELISA检测结果经统计学分析,H9N2灭活疫苗接种组与非免疫鸡的自然阴性血清、禽流感H9N2病毒感染组血清p<0.05,差异显著,确定ELISA阴阳性判定的OD临界值为0.5;检测鸡群血清样本数至少为30份。【结论】本方法可用于鉴别禽流感野毒感染。

关键词：禽流感病毒 NS1蛋白重组表达间接ELISA 鉴别诊断

来源：评论

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