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358 篇 会议
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354 篇 农学
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主题

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机构

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20 篇 中国农业科学院上...
19 篇 江苏省农业科学院...
19 篇 军事医学科学院军...
18 篇 河南科技大学
17 篇 河南农业大学
16 篇 中国农业大学
13 篇 西北农林科技大学
13 篇 吉林农业大学
10 篇 福建省农业科学院...
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9 篇 贵州大学
8 篇 军事医学科学院军...
8 篇 四川农业大学
8 篇 扬州大学
8 篇 山东农业大学
7 篇 中国畜牧兽医学会...
7 篇 河南省动物疫病预...
7 篇 广西大学

作者

17 篇 金宁一
14 篇 涂长春
13 篇 丁壮
12 篇 周恩民
11 篇 熊祺琰
11 篇 冯志新
11 篇 余祖华
11 篇 程相朝
11 篇 邵国青
10 篇 何雷
10 篇 赵雪丽
10 篇 吴志明
10 篇 刘茂军
10 篇 闫若潜
9 篇 王淑娟
9 篇 张春杰
9 篇 谢彩华
9 篇 李一权
9 篇 郁川
8 篇 刘光清

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355 篇 中文
5 篇 英文

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副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白的筛选

副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白的筛选

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李淼宋帅杨冬霞郭海祥李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室

引言副猪嗜血杆菌（***）引起猪的革拉泽民病,是当前严重影响全世界养猪业的重要细菌性病原。由于***血清型多样性和未分型临床分离株所占比例较大,导致现有疫苗对异源血清型菌株感染缺乏有效的交叉保护。随着基因工程技术的不断发展,... 详细信息

引言副猪嗜血杆菌（***）引起猪的革拉泽民病,是当前严重影响全世界养猪业的重要细菌性病原。由于***血清型多样性和未分型临床分离株所占比例较大,导致现有疫苗对异源血清型菌株感染缺乏有效的交叉保护。随着基因工程技术的不断发展,亚单位疫苗可能成为控制***感染最为有效的手段之一。鉴定和分离致病菌关键的免疫原和毒力因子是研究细菌性亚单位疫苗的基础,目前***亚单位疫苗的发展主要是基于微生物本身的外膜蛋白或者其组成部分本文采用反向疫苗学研究策略,利用生物信息学软件分析预测***的外膜蛋白,经克隆表达和纯化后,在体外利用Western blot初步分析蛋白的免疫原性,为进一步筛选构建***亚单位疫苗的候选抗原奠定基础。材料与方法参照GenBank中登录的*** SH0165株基因序列（登录号为CP001321）,采用生物信息学方法预测***的免疫原性蛋白。从中筛选10个外膜蛋白（CsgC,YfeA,OppA,PlpA,PlpD,HAPS742,Omp26,HxuC,TblC和VacJ）进行体外克隆。首先设计合成扩增10种外膜蛋白的引物序列,经PCR扩增获得目的基因片段,将其分别用相应的酶切回收后与经同样处理的pET30a（+）载体连接并转化DH5α感受态细胞,构建重组表达质粒。将鉴定为阳性的重组表达质粒转化BL21感受态细胞,利用菌液PCR鉴定阳性重组子,按照常规方法进行原核表达及蛋白纯化,将纯化的蛋白产物分别与***康复血清进行Western blot分析。结果与讨论经鉴定10个重组表达截体全部构建成功。经体外诱导表达后,共有7个重组蛋白（5个可溶性蛋白,2个包涵体蛋白）能够在大肠杆菌中高效表达。经Western blot分析鉴定,纯化后的重组蛋白均能与康复血清产生免疫反应,为进一步在动物体内进行免疫效力评价奠定了基础。结论本研究利用生物信息学预测方法筛选了***的10种外膜蛋白作为疫苗候选抗原进行研究,获得的7种重组外膜蛋白经纯化后与*** 5型康复血清反应均具有一定的免疫反应性。

关键词：免疫原性蛋白候选抗原副猪嗜血杆菌亚单位疫苗

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巴马猪人工感染猪鼻支原体和猪滑液支原体后鼻腔粘膜中特异性sIgA抗体分泌规律研究

巴马猪人工感染猪鼻支原体和猪滑液支原体后鼻腔粘膜中特异性sIgA...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：白昀冯志新熊祺琰宋伟祥韦艳娜马庆红甘源邵国青江苏省农业科学院兽医研究所

目的巴马猪在分别人工感染猪鼻支原体和猪滑液支原体后,研究其鼻腔粘膜中特异性sIgA抗体分泌规律。材料与方法取猪鼻支原体(11051207株,10～9CCU/ml)和猪滑液支原体(ATCC27059株,10～8CCU/ml)培养物分别通过鼻内感染4～6周龄巴马猪,3ml/... 详细信息

目的巴马猪在分别人工感染猪鼻支原体和猪滑液支原体后,研究其鼻腔粘膜中特异性sIgA抗体分泌规律。材料与方法取猪鼻支原体(11051207株,10～9CCU/ml)和猪滑液支原体(ATCC27059株,10～8CCU/ml)培养物分别通过鼻内感染4～6周龄巴马猪,3ml/头,24h后用相同菌株相同剂量再次鼻内感染试验猪。感染前和首次感染后D2、D4、D7、D10、D14、D21、D28、D35日采集鼻拭子,分别检测猪鼻支原体和猪滑液支原体特异性的sIgA抗体,研究其鼻腔粘膜中特异性sIgA抗体的分泌规律。结果与讨论巴马猪在感染猪鼻支原体(11051207株)后D7天鼻腔粘膜sIgA抗体开始转阳(1/3),D10天sIgA抗体水平达到最高峰并全部转阳(3/3),之后抗体水平缓慢下降,至D35天已有部分(2/3)试验猪鼻腔粘膜sIgA抗体为阴性。巴马猪在感染猪滑液支原体(ATCC27059株)后D7天鼻腔粘膜sIgA抗体开始转阳(1/3),之后逐渐升高,至D21天sIgA抗体水平达到最高峰,并一直维持到D35天仍未见有明显下降趋势。结论通过鼻内感染猪鼻支原体和猪滑液支原体的方法均能成功的诱导鼻腔粘膜产生相应的特异性sIgA抗体。猪滑液支原体接种剂量显著低于猪鼻支原体,但可比猪鼻支原体感染后产生更快更持久的特异性sIgA抗体,这一方面可能是由于菌株毒力的差异,另一方面也可能是由于猪滑液支原体抗原反应性更强的结果。虽然在两菌株在感染后均可激活猪呼吸道的免疫反应,但在整个试验的过程中均未观察到各自明显的临床症状,这提示我们在研究猪肺炎支原体时要注意猪鼻支原体和猪滑液支原体对其产生的交叉影响,尤其是在临床检测猪肺炎支原体时,亦需做到与猪鼻支原体和猪滑液支原体的鉴别诊断。

关键词：猪鼻支原体滑液支原体抗体分泌人工感染鼻腔粘膜特异性巴马猪

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猪肺炎支原体脂膜蛋白LAMPs通过caspase3和MAPK途径诱导猪肺泡上皮细胞SJPL凋亡

猪肺炎支原体脂膜蛋白LAMPs通过caspase3和MAPK途径诱导猪肺泡上...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：倪博白方方韦艳娜刘茂军冯志新熊祺琰华利忠邵国青江苏省农业科学院兽医研究所

目的使用猪肺炎支原体脂膜蛋白LAMPs作用于猪肺泡上皮细胞(SJPL),检测LAMPs是否为猪肺炎支原体的致病因素。材料与方法使用KM2培养基培养猪肺炎支原体232株(ATCC 27714)。通过TBSE和Triton-114提取猪肺炎支原体的脂膜蛋白LAMPs用于研究... 详细信息

目的使用猪肺炎支原体脂膜蛋白LAMPs作用于猪肺泡上皮细胞(SJPL),检测LAMPs是否为猪肺炎支原体的致病因素。材料与方法使用KM2培养基培养猪肺炎支原体232株(ATCC 27714)。通过TBSE和Triton-114提取猪肺炎支原体的脂膜蛋白LAMPs用于研究。实验用细胞为猪气管上皮细胞SJPL,DMEM培养后接种96孔细胞板待用。研究中先使用MTT法检测不同浓度LAMPs对细胞的生长抑制作用,随后使用DAPI,AO/EB双染及末端羟基标记TUNEL法检测细胞凋亡的形态学变化。通过流式细胞仪检测LAMPs诱导细胞的凋亡率。通过caspase3,caspase8酶活性检测以及Western Blot法检测凋亡通路相关信号蛋白PARP,Bax和p38 MAPK。同时检测了炎性因子NO及超氧化物的浓度。结果与讨论经过MTT法检测IAMPs对细胞的毒性作用,选定0.2mg/mL为研究作用浓度。在LAMPs与SJPL细胞相互作用24h后出现了典型的细胞凋亡现象。细胞核出现核固缩,碎裂,皱缩为不规格的形状,并出现凋亡小体,同时由于基因组断裂而暴露的3'-OH被TUNEL标记为绿色荧光。在AO/EB双染中出现橙黄色凋亡细胞。使用流式细胞仪检测LAMPs作用于细胞24后出现36.5%±11.6%的凋亡率。在LAMPs作用于SJPL细胞6h时,caspase 3的酶活性与阴性细胞相比升高了40倍,caspase 8的酶活性提升了4倍。在凋亡通路的检测中,PARP被切割为两个较小的片段被活化,p38 MAPK被磷酸化,促凋亡蛋白Bax表达增加的同时,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调,Cyt c从线粒体释放到细胞质中被激活。此外,LAMPs还可以刺激细胞产生NO和超氧化物。结论猪肺炎支原体的脂膜蛋白LAMPs具有诱导猪肺泡上皮细胞SJPL凋亡的能力,其中激活了caspas3,caspase8,PARR,p38 MAPK,Bax及细胞色素Cytc。这项研究可以帮助我们进一步认识猪肺炎支原体的治病机制,对LAMPs诱导细胞凋亡途径更深入的研究将有助于确立猪肺炎支原体感染的治疗靶标。

关键词：猪肺炎猪肺炎支原体 caspase3 LAMPs

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猪肉生产供应链中人兽共患猪链球菌的感染风险与传播机制

猪肉生产供应链中人兽共患猪链球菌的感染风险与传播机制

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：周锐华中农业大学

引言近十年来,人兽共患猪链球菌病危害日益严重。为了评估猪和猪肉源性猪链球菌对食品安全和人类健康的潜在风险,我们与英国剑桥大学合作,比较研究了中国和英国不同饲养、屠宰和零售模式下,猪链球菌在临床健康猪群及猪肉生产供应链中的... 详细信息

引言近十年来,人兽共患猪链球菌病危害日益严重。为了评估猪和猪肉源性猪链球菌对食品安全和人类健康的潜在风险,我们与英国剑桥大学合作,比较研究了中国和英国不同饲养、屠宰和零售模式下,猪链球菌在临床健康猪群及猪肉生产供应链中的感染和污染状况以及存活和传播机制。材料与方法中方从湖北和广西选取5个规模化猪场(500-3000头母猪)、5个小型猪场(70-300头母猪),英国选取5个规模化猪场,分别采集25头5周龄的临床健康断奶仔猪和25头同群的20周龄临床健康肥猪的扁桃体拭子共750个,分离鉴定猪链球菌,进行耐药性、血清型、序列型和全基因组序列分析,同时收集猪场背景资料、免疫和用药情况。分别在夏季和冬季从屠宰场、农贸市场和大型超市采集样品包括猪肉、肝、肾、小肠等可食组织各600份,进行猪链球菌的分离鉴定和基于PCR的细菌计数分析,结合屠宰、储存、运输和零售模式,综合分析猪肉生产供应链中猪链球菌的污染状况。将含5000个突变体的猪链球菌2型转座子突变体库,分别暴露于冻肉、冷鲜肉、鲜肉、完整和划伤的猪皮肤、猪粪便等环境,回收突变菌株,进行TraDIS分析,鉴定环境适应性基因和信号通路。结果和结论(1)中英猪肉生产供应链均普遍携带猪链球菌,其多样性远高于发病猪来源的菌株,可感染人的16型在中英猪群的携带率最高,提示巨大的公共卫生风险。(2)影响猪群猪链球菌携带率的主要因素有季节、日龄和饲养模式。环境温度越高携带率越高,断奶仔猪携带率显著高于待宰肥猪,大型规模化猪场携带率高于小型猪场。(3)中英临床健康猪群携带的猪链球菌普遍存在耐药问题,发现耐药基因可以在临床健康猪群携带的猪链球菌中快速丢失和获得。(4)发现一大批猪链球菌适应猪肉生产供应链环境的基因和信号通路,揭示了部分基因调控其环境适应性的分子机制,为新的防控策略和技术研究奠定了基础。

关键词：猪链球菌分离鉴定人兽共患供应链传播机制感染风险

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鸡传染性法氏囊病病毒Xin08株VP2高变区基因的克隆与分析

鸡传染性法氏囊病病毒Xin08株VP2高变区基因的克隆与分析

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：岳锋宁红梅银梅葛亚明朱彦彩王选年河南科技学院动物科学学院新乡学院

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(infectious bursal diseasevirus,IBDV)引起鸡的一种高度接触性、免疫抑制性传染病。IBDV基因组为双股RNA(dsRNA),由A和B两个片段组成,其中A片段包含两个部分重叠... 详细信息

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(infectious bursal diseasevirus,IBDV)引起鸡的一种高度接触性、免疫抑制性传染病。IBDV基因组为双股RNA(dsRNA),由A和B两个片段组成,其中A片段包含两个部分重叠的开放阅读框(ORFs),小ORF编码17kDa的非结构蛋白VP5,大ORF编码110kDa的多聚蛋白;而B片段编码VPl蛋白。2008年河南新乡

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒高变区 VP2 Xin08 克隆与分析

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鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的mRT-PCR检测方法的建立及应用

鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的mRT-PCR检测方法的建立及应用

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李达马萍汤德元张元鑫张华曾智勇刘霞王洪光韦冠东贵州大学动物科学学院贵州省动物疫病预防控制中心

引言猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起猪的一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病,对养猪业危害十分严重,被国际兽疫局（OIE）列为16种A类法定传染病之一,也是我国法定的... 详细信息

引言猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起猪的一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病,对养猪业危害十分严重,被国际兽疫局（OIE）列为16种A类法定传染病之一,也是我国法定的一类动物疫病。猪瘟弱毒疫苗在中国的大规模应用,使猪瘟野毒感染和疫苗接种的区分变得困难且十分必要。为建立一种能够应用于临床样本猪瘟病毒（CSFV）检测的快速、简便且标准化程度高的检测技术,以满足畜牧业生产和成功开展猪场净化的需求,本研究建立的mRT-PCR方法具有敏感性、特异性强、重复性好的特点,对养猪业的发展与猪厂净化具有十分重要的意义。材料与方法本研究根据GenBank中22个猪瘟野毒与疫苗毒及近源病毒的基因组序列对比分析,发现猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株3′NTR独立存在富含T的插入序列,根据这一特点选择特异保守区域应用DNAStar、Oligo、MPprimer and MFE primer设计多重PCR引物,并挑选最佳的2对猪瘟病毒引物,优化筛选能够鉴别猪瘟野毒与兔化弱毒疫苗的PCR退火温度,经多重试验组合建立了一套鉴别猪瘟野毒和疫苗毒的2重RT-PCR鉴别诊断方法。结果与讨论扩增反应条件的确定试验表明,退火温度为58℃特异性分析表明,从弱毒C株和石门强毒株的基因组中分别扩增出1条大小为278和641 bp的特异性片段,从强弱毒株混合物中1次扩增出2条大小为278和641 bp的特异性片段;特异性分析表明,检测不到PRV、PRRSV、SIV、PCV2的DNA/RNA;敏感性分析表明,该方法能检测出0.82pg的猪瘟病毒RNA;应用试验表明,9份疑似猪瘟病料中3份为强毒感染,1份为弱毒感染,1份为弱毒和强毒的混合感染。多重PCR反应中,引物设计至关重要,它是决定多重PCR成败的关键,充分考虑PRV G+C含量较高而PPV G+C含量较低的问题,Tm值应该控制在55℃3℃,确保在某一温度都能进行很好的PCR反应,尽量避免引物间非特异性扩增。敏感性试验结果表明,该多重PCR具有很强的敏感性,检测含量达到了pg级。

关键词：猪瘟野毒 mRT-PCR 疫苗毒弱毒疫苗猪瘟病毒检测方法

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牛病毒性腹泻病毒LJ36/14基因分型的研究

牛病毒性腹泻病毒LJ36/14基因分型的研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：朱远茂杨立新马磊任建乐薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病创新团队

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的以牛发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。BVDV与猪瘟病毒、绵羊边界病毒同属黄病毒科瘟病毒属,在血清学上有交叉反应。... 详细信息

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的以牛发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。BVDV与猪瘟病毒、绵羊边界病毒同属黄病毒科瘟病毒属,在血清学上有交叉反应。北欧一些国家通过严格检疫和扑杀措施已根除了牛病毒性腹泻,我国尚未开展BVDV的根除计划。BVDV目前仍然是我国养牛业面临一个重要病原,同时也是国内外组织培养用牛血清中一个主要外源病毒,对生物制品的生产和使用具有较大的潜在危害。2014年从黑龙江省发生呼吸道传染病的肉牛群采集了40份鼻腔棉拭子,经接种MDBK细胞后分离到一株BVDV,命名为LJ36/14。对该分离株的5‘端非编码区的RT-PCR产物进行了基因序列测定,BLAST结果表明该毒株与BVDV1型的BJ09 26和JS12/02毒株的部分序列同源性为99%以上。随后对其N基因的部分序列进行了测定,用MEGA5软件构建进化树,结果表明该毒株为一新的未知亚型,暂定为BVDV1v亚型。国外学者最早开启了BVDV基因分型的研究,至2005年已确定了BVDV1型有12个亚型（1a-11）。我国学者于2016年确定了猪源BVDV的ZM-95株为1m亚型。2008年日本学者确定了BVDV1型的1n和1o亚型。我们于2006年开展了BVDV诊断及流行病学调查研究,进行了BVDV基因分型的研究,初步确定了国内牛的BVDV主要流行毒株为BVDV1m亚型,其次为BVDV1b和BVDV1p亚型,其中BVDV1p亚型为一新基因亚型。而2015年国内的一篇研究报告亦表明BVDV1m亚型为主要流行毒株,其次为BVDV1b和BVDV1u亚型,其中BVDV1u亚型为国内首次确定的一个新亚型。到目前为止,BVDV1型已被分为22个基因亚型,其中亚洲流行主要有1m、1n、1o、1p、1 q、1u和1v等7个亚型。这些研究为我国BVDV诊断、分子流行病学调查及疫苗研发提供了有力的技术支持。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 LJ36/14 基因分型

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NDV对雏鸵鸟HPA轴的影响研究

NDV对雏鸵鸟HPA轴的影响研究

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第五次会员代表大会暨第十六次学术研讨会

作者：唐丽彭克美四川农业大学动物医学院华中农业大学动物医学院

新城疫(ND)是鸵鸟养殖业中最主要的传染病之一,ND作为应激原,进入机体后可引起一系列病理变化,使机体HPA轴处于过度激活或失活状态,进一步加重内环境紊乱,引起病情加重。鉴于此,本研究以雏鸵鸟为试验动物,分正常组(0d、45d和90d)和攻毒... 详细信息

新城疫(ND)是鸵鸟养殖业中最主要的传染病之一,ND作为应激原,进入机体后可引起一系列病理变化,使机体HPA轴处于过度激活或失活状态,进一步加重内环境紊乱,引起病情加重。鉴于此,本研究以雏鸵鸟为试验动物,分正常组(0d、45d和90d)和攻毒组(45d,皮下注射鸡新城疫标准毒株F48E9),利用RIA技术和TUNEL技术,研究NDV对雏鸵鸟HPA轴的影响。结果表明:雏鸵鸟感染NDV,HPA轴内细胞凋亡数量在病毒感染期间明显高于对照组,提示NDV能诱导雏鸵鸟HPA轴系统发生细胞凋亡;在病毒接种后1d,肾上腺内可检测到大量凋亡细胞,接种5d后凋亡数量显著增加(P<0.01),之后凋亡呈下降趋势,肾上腺内细胞凋亡的动态变化反映了雏鸵鸟HPA轴对ND病变的适应和调节。雏鸵鸟感染NDV,血清ACTH水平于NDV病毒接种后第1d开始上升,至第5d达峰值(P<0.01),之后有所下降,渐趋于正常;St清Cor水平于病毒接种后第1d开始下降,至第7d有所回升,第9d渐趋于正常水平,表明NDV接种后雏鸵鸟血清ACTH和Cor水平的变化与其HPA轴功能的损伤及恢复密切相关。

关键词：雏鸵鸟下丘脑-垂体-肾上腺轴新城疫

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传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达

传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘莎莎贾艳艳张春杰余祖华何雷李蒙河南科技大学动物疫病与公共安全重点实验室

引言/目的鸡传染性法氏囊病（IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种高度接触性传染病,能破坏雏鸡法氏囊淋巴细胞而引起严重的免疫抑制,并可诱发多种疾病或使多种疫苗免疫失败。VP2是IBDV的主要结构蛋白,是主要的宿主保护性... 详细信息

引言/目的鸡传染性法氏囊病（IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种高度接触性传染病,能破坏雏鸡法氏囊淋巴细胞而引起严重的免疫抑制,并可诱发多种疾病或使多种疫苗免疫失败。VP2是IBDV的主要结构蛋白,是主要的宿主保护性抗原,含有能诱导中和抗体的抗原决定簇,其诱导机体产生的中和抗体能被动地保护宿主免受IBDV的感染。鉴于此,我们应用RT-PCR技术从洛阳一鸡场分离的IBDV毒株（LY）中克隆VP2基因并进行序列分析,并将VP2基因亚克隆于原核表达载体PET-32a,经鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE与Western blot分析。为洛阳地区IBD的防控提供一定的理论指导及VP2蛋白功能的进一步研究奠定一定的基础。材料与方法 IBDV毒株分离于洛阳某鸡场,大肠杆菌BL21、原核表达载体PET-32a由本实验室保存。本实验利用RT-PCR扩增出VP2基因,并与PMD-19T连接,鉴定正确后测序、序列分析,并用限制性内切酶EcoR I和Sal I对已构建的重组质粒PMD-19T-VP2和原核表达载体PET-32a分别进行双酶切,将所得目的片段进行连接,转化大肠杆菌感受态细胞BL21中。应用PCR和酶切技术对重组质粒PET-32a-VP2进行鉴定,然后利用IPTG对含原核表达载体的宿主菌BL21进行诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析。结果与讨论RT-PCR成功扩增出VP2基因,PCR、酶切及测序结果表明,重组质粒PMD-19T-VP2构建成功。序列分析结果表明LY分离株的同源性与参考毒株中的弱毒株同源性最高,同源性约为95%9.1%;并且该分离株VP2基因高变区氨基酸分子特征为48H、74N和79T,其七肽区发生了一个丝氨酸（S）的替换S-W-S-A-R-G-S,具有典型的弱毒株的分子特征;遗传进化分析结果表明,LY分离株与弱毒株Cu-1进化关系最近,其进化分支位于弱毒株群内,以上结果提示LY分离株为IBDV弱毒株。PCR、酶切结果表明重组质粒PET-32a-VP2构建成功。在37℃1mM IPTG诱导下,SDS-PAGE及Western可见约65kDa蛋白条带。为IBD诊断抗原的研究、基因工程疫苗的研制奠定基础。

关键词：弱毒株分离株传染性法氏囊病毒序列分析 VP2

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8种猪病病原体GeXP检测方法的建立

8种猪病病原体GeXP检测方法的建立

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：张民秀谢芝勋邓显文谢志勤谢丽基黄莉黄娇玲广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室

引言猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome disease,PRRS),猪瘟(classical swine fever,CSF),猪圆环病毒病(porcine circovirus disease,PCVD),猪流感(swine influenza,SI),猪细小病毒病(porcine parvovirus disease,PPVD),猪伪狂犬病(pseudorabies virus disease,PR)和猪日本乙型脑炎病毒病(Japanese encephalitis,JE)是给养猪业造成巨大经济损失的8种病原体。其中,PRRS,CSF,PCVD,PPVD,PR和JE可导致母猪繁殖障碍,而PRRS,PCVD和SI能引起呼吸道系统疾病。由于这些疾病的临床表现非常相似,临床诊断容易引起混淆,因此建立一种能同时鉴别这些猪呼吸道与繁殖障碍传染病病原体的高通量快速检测方法对这些传染病的有效控制具有重要意义。材料与方法根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物,在每对特异性引物的5'端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法和GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板和阳性cDNA/DNA混合模板验证引物的可行性和GeXP多重检测体系的特异性和准确性;并对该方法进行了单一病原体灵敏度和同时检测8种病原体的灵敏度分析。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。结果与讨论基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10～1拷贝/μL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10～3拷贝/μL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。本研究成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪病病原体,该方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪传染性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。

关键词：临床样品灵敏度分析多重检测特异性引物病原体检测方法

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