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358 篇 会议
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7 篇 河南省动物疫病预...
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作者

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11 篇 熊祺琰
11 篇 冯志新
11 篇 余祖华
11 篇 程相朝
11 篇 邵国青
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10 篇 赵雪丽
10 篇 吴志明
10 篇 刘茂军
10 篇 闫若潜
9 篇 王淑娟
9 篇 张春杰
9 篇 谢彩华
9 篇 李一权
9 篇 郁川
8 篇 刘光清

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355 篇 中文
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热辅快速生物发酵分解工艺无害化处理病死猪尸体效果评估

热辅快速生物发酵分解工艺无害化处理病死猪尸体效果评估

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：谢彩华闫若潜陈腾飞吴志明赵雪丽王淑娟河南省动物疫病预防控制中心

引言病死猪尸体携带有各种病原微生物,会造成重大动物疫情或人畜共患病发生,若未经有效处理,将严重威胁威胁食品卫生和公共卫生安全。作为新兴的热辅快速生物发酵分解法病死猪尸体处理技术,其处理后的生物安全效果如何,尚无科学定论,本... 详细信息

引言病死猪尸体携带有各种病原微生物,会造成重大动物疫情或人畜共患病发生,若未经有效处理,将严重威胁威胁食品卫生和公共卫生安全。作为新兴的热辅快速生物发酵分解法病死猪尸体处理技术,其处理后的生物安全效果如何,尚无科学定论,本研究旨在对此工艺的无害化处理效果进行评估,为进一步研究无害化处理工艺、提高无害化处理后的生物安全效果提供科学参考。材料与方法采集处理前的病死猪尸体胸腔积液、淋巴结等样品,热辅快速生物发酵分解工艺处理后的肥料为检测样品。采用病毒分离培养、RT-PCR和PCR等方法对样品进行病原检测,通过处理前及处理后病原微生物检出率的对比,对该工艺无害化处理病死猪尸体的生物安全效果进行评估。结果与讨论6个批次样品在未经快速生物发酵分解法处理前的样品中均检出有猪瘟病毒、猪圆环病毒,其中第一批和第三批样品中在未经快速生物发酵分解法处理前还检出了伪狂犬病毒、猪蓝耳病病毒、副猪嗜血杆菌。经热辅快速生物发酵分解法无害化处理后,分别于24h、48 h、72 h采样检测,在处理72h后,只有猪瘟病毒能够少量检出,其他病原均未检出。取4批经热辅快速生物发酵分解工艺进行无害化处理72 h后的猪瘟病毒阳性样品在PK-15细胞上进行病毒的分离培养,并利用RT-PCR方法进行了鉴定,结果表明,只有第二批的猪瘟阳性样品未分离出猪瘟病毒,其他3批阳性猪瘟样品均分离出了猪瘟病毒。热辅快速生物发酵分解工艺处理病死猪尸体基本达到无害化处理要求。本研究还发现耐高温降解菌种的选择对热辅快速生物发酵分解工艺的无害化处理效果影响较大,病原耐受力的强弱直接影响该方法无害化处理病死猪尸体的效果,主观因素对该工艺无害化处理效果也有一定的影响。本研究为热辅快速生物发酵分解工艺无害化处理病死猪尸体的生物安全效果评价提供了科学的参考价值。

关键词：无害化处理生物安全病死猪生物发酵效果评估

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牛冠状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

牛冠状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：沈付娆赵贵民朱彤程凯慧王洪梅何洪彬山东农业科学院奶牛研究中心

引言/目的牛冠状病毒（BCoV）是引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原,主要通过消化道和呼吸道传播,感染的牛长期带毒并在一定时期内持续排毒,易造成牛群的大范围感染。因此,对带毒牛的及时检出和牛场环境监测就显得尤... 详细信息

引言/目的牛冠状病毒（BCoV）是引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原,主要通过消化道和呼吸道传播,感染的牛长期带毒并在一定时期内持续排毒,易造成牛群的大范围感染。因此,对带毒牛的及时检出和牛场环境监测就显得尤为重要。因此,本研究建立了SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法并初步应用于临床样本的检测,为BCoV的临床诊断提供了技术保障。材料与方法根据BCoV Mebus株N基因的保守区,合成、筛选出最佳引物对。以BCoV的cDNA为模板进行PCR扩增,克隆、测序,获得质粒标准品。以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板,进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度检测。以牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒等病毒的cDNA/DNA为模板,进行特异性检测:以7.8×10copies/μL进行重复检测。结果与讨论采用最大二阶导数法绘制标准曲线,回归线误差值为0.0742,扩增效率为1.663。通过对溶解曲线分析,发现BCoV样品为单峰,而阴性对照及其它病毒没有出现熔点峰,表明该方法特异性好。SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法最低检出限为7.8拷贝/μL,而RT-PCR为7.8×10～2拷贝/μL,具有较高的灵敏性。通过对39份腹泻样本检测,本方法检测出BCoV阳性20份,阳性率为51.28%,而RT-PCR仅检出阳性16份,阳性率为41.03%。目前,BCoV的核酸检测主要有RT-PCR、巢式PCR、TaqMan荧光定量RT-PCR方法方法。RT-PCR、巢式PCR灵敏度较低,而TaqMan荧光定量RT-PCR方法存在探针设计复杂、淬灭不彻底、成本高等不足。本方法以价格低廉的SYBRGreenⅠ染料代替探针,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可以用于牛冠状病毒病的实验室早期诊断。结论本研究建立的牛冠状病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法特异、敏感、高效,且每次反应可同时进行96个样本的检测,可对大规模爆发的疫情做出快速、准确的诊断。

关键词：牛冠状病毒实时荧光定量初步应用检测方法 RT-PCR

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伪狂犬病毒变异株发病的诊断和防控

伪狂犬病毒变异株发病的诊断和防控

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：黄元陈晶向华赵翠玲陈锦良陈远媚黄忠广东省农业科学院动物卫生研究所广东省兽医公共卫生公共实验室

前言自2012年以来,由伪狂犬病毒变异株引发猪伪狂犬病在华中、东北再次爆发,继而蔓延到全国大多数省份。发病的特点是各种年龄的猪可感染,只是不同年龄段表现的症状和死亡率有所区别,怀孕母猪发生死产、死胎、木乃伊胎等;哺乳仔猪通常... 详细信息

前言自2012年以来,由伪狂犬病毒变异株引发猪伪狂犬病在华中、东北再次爆发,继而蔓延到全国大多数省份。发病的特点是各种年龄的猪可感染,只是不同年龄段表现的症状和死亡率有所区别,怀孕母猪发生死产、死胎、木乃伊胎等;哺乳仔猪通常会伴有典型的神经症状、腹泻等;成年猪症状常不明显。广东北部某猪场在引进种猪1个月后,约15%的母猪在不同妊娠阶段出现流产,母猪出现流产半个月后,初产仔猪开始发病,弱仔增多,7天左右的仔猪出现神经症状,腹泻等。根据发病特点、剖检等初步判断为伪狂犬病。为此希望通过对该病检测、鉴定和疫苗的选择,从而找到伪狂犬病(变异株)的防控方法。材料与方法首先应用ELISA试剂盒检测流产及未流产母猪的伪狂犬病gE和gB抗体。其次使用PCR反应体系检测发病仔猪的脑等组织,并对初步确定伪狂犬病毒核酸阳性样品进行伪狂犬病毒gB基因N端序列测定。最后用ELISA和中和试验检测母猪免疫伪狂犬变异株灭活中试苗前后的血清抗体。结果与讨论流产母猪血清PRV-gE抗体都是阳性;未流产的经产母猪3头有2头临界值上,初产的母猪为阴性。流产母猪的PRV-gB抗体S/P值达到4.0左右,未流产经产母猪S/P值为3.70稍高于初产母猪的2.86。PCR检测3头病仔猪脑等组织,电泳的结果为在300至400bp之间出现单一条带,与阳性对照一致。并对部分核酸序进行列测定,得到该病毒gB基因5'端片段的序列与GD2013流行毒株和BJ-Y-T-2012株相似性为100%;与HB98株相似性为99.8%;与经典疫苗株Batha-K61相似性为94.8%。通过以上试验确定该病为伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。用ELISA和中和试验检测母猪免疫伪狂犬变异株灭活中试苗前后的血清抗体。结果为免疫前PRV-gB抗体的S/P值为1.60,接种疫苗4周后S/P值升高到2.88,免疫十周稍微升到2.99,且个体间抗体水平更加均衡。中和试验测结果为免疫前中和抗体效价为1:24,免疫4周后升高到1:213.33。这与免疫疫苗后1周母猪流产开始减少,2周后母猪少见流产的结果吻合。结论伪狂犬病毒经典株疫苗产生的PRV-gB抗体对变异株的保护作用不佳,而变异株疫苗的保护效果显著。

关键词：变异株 ELISA 伪狂犬病毒中和试验

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表达山羊副流感病毒3型F蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

表达山羊副流感病毒3型F蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李文良徐艳毛立郝飞杨蕾蕾张纹纹江杰元江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言副流感病毒3型属副黏病毒科呼吸道病毒属,是人和动物呼吸道重要病原。其中年副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)是引起牛呼吸道疾病的主要病原,危害巨大。2013年底本实验室首次从江苏、安徽多地患呼吸道疾病... 详细信息

引言副流感病毒3型属副黏病毒科呼吸道病毒属,是人和动物呼吸道重要病原。其中年副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)是引起牛呼吸道疾病的主要病原,危害巨大。2013年底本实验室首次从江苏、安徽多地患呼吸道疾病的山羊中分离鉴定出山羊PIV3,成为该病毒属的新成员。HN、F、M、N是病毒的主要结构蛋白,其中糖蛋白F是由F1、F2组成的异源二聚体,包括糖基和脂肪酸,分子量在60-65ku之间,起着融合细胞的作用,也是主要保护性抗原。本研究克隆JS2013分离株F基因,构建重组杆状病毒,获得重组蛋白,为病毒F蛋白的功能研究以及疫苗和检测方法的建立提供有力工具。材料方法根据病毒基因组序列设计引物通过RT-PCR扩增F蛋白基因,克隆入Bac-to-Bac表达系统质粒pFastBacHT B中,经PCR、酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒转化DH10Bac,经两次蓝白菌落筛选,挑取白色菌落提取Bacmid,将PCR鉴定正确重组的Bacmid(rBac-F)转染Sf9昆虫细胞,连续传代观察细胞病变情况并采用PCR鉴定目的基因的存在,从而获得重组杆状病毒。进一步使用His标签单抗和原核表达F蛋白制备的小鼠多抗通过Westemblot和IFA鉴定重组蛋白的表达情况。结果 RT-PCR成功扩增出F基因序列,克隆入pFastBacHTB中,挑取菌落经PCR、酶切鉴定为阳性的质粒进一步经测序鉴定序列正确无误,符合阅读框。经两次蓝白菌落筛选,挑取白色菌落提取Bacmid,正确重组的Bacmid经M13引物扩增获得约4100bp的条带。转染Sf9细胞后连续传代观察,至第3代接种后3天开始出现细胞病变,细胞变大变圆、脱落,证明获得重组病毒,并将其继续传代扩增。提取病毒DNA,通过F基因的引物进行PCR检测获得1640bp的目的条带。两种抗体进行Westem blot检测均可显示63ku的重组蛋白条带,IFA检测均可见特异的荧光分布于Sf9细胞内,说明目的蛋白获得正确的表达,具有良好的抗原性。讨论成功构建表达CPIV3 F蛋白的重组杆状病毒,蛋白获得正确表达,这将为进一步研究该病毒F蛋白的功能及CPIV3疫苗和诊断方法的研究提供基础和材料。

关键词：重组杆状病毒细胞病变副流感病毒

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一株猪流行性腹泻病毒毒株M、N基因的分子进化特征分析

一株猪流行性腹泻病毒毒株M、N基因的分子进化特征分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：董波杨小燕戴爱玲李晓华洪文静苏冰倩陈晶曹雪珍龙岩学院生命科学学院

引言猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪流行性腹泻的致病原,主要感染哺乳仔猪,感染率和病死率极高,已引起养猪业的高度重视。在国内,由PEDV引发的猪流行性腹泻最早于1976年就有报道,之后,在我国的多个省市均有该病的发生,给养猪业造成了... 详细信息

引言猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪流行性腹泻的致病原,主要感染哺乳仔猪,感染率和病死率极高,已引起养猪业的高度重视。在国内,由PEDV引发的猪流行性腹泻最早于1976年就有报道,之后,在我国的多个省市均有该病的发生,给养猪业造成了不小的经济损失。因此,了解PEDV的流行特点是必要的,对于疫情的防控具有重要意义。本研究从发生猪流行性腹泻的猪场分离到一株PEDV,对其M基因和N基因进行了序列测定和遗传进化分析,为了解PEDV福建闽西地区流行毒株的特点,阐明福建闽西地区流行毒株的遗传变异规律,分析我国PEDV地方毒株的遗传演化提供基础资料。材料与方法从福建闽西地区某猪场的腹泻症状死亡病猪小肠及内容物中分离出猪流行性腹泻病毒。参考GenBank上已发表的PEDV M基因和N基因序列,分别设计特异性引物,扩增PEDV M基因和N基因,克隆至pUM-19T Cloning Vector,进行序列测定。应用DNAman、DNAstar、MEGA5.2分子生物学软件,分别对M基因和N基因进行同源性分析,阐明分离毒株的遗传变异规律。结果与讨论将分离毒株M基因与其它代表性毒株M基因进行氨基酸同源性比较后发现,分离毒株与2012年广东分离毒株GD-B的同源性为100%,与经典毒株CV777、LCZ以及韩国毒株DR13 M基因的同源性分别为:96.9%、97.8%和97.8%。与2010年以后中国分离毒株的同源性均在99%以上,与2013年美国毒株的同源性也均在99%以上。遗传进化分析表明,分离毒株与2012年广东分离毒株GD-B的亲缘性较高,与经典毒株CV777、LCZ以及韩国毒株DR13的亲缘性较远。与2012年以后在中国分离毒株的亲缘性较高,与2013年美国毒株亲缘性也较高。将分离毒株N基因与国内外已报道的代表毒株N基因进行氨基酸同源性比较和遗传进化分析,分离毒株N基因与经典毒株CV777、LCZ以及韩国毒株DR13 M基因的同源性分别为:95.7%、95.2%和96.1%,与2012年中国分离毒株BJ-2011-1的同源性最高,为98.6%。分离毒株与2012年中国分离毒株BJ-2011-1的亲缘性较近,而与经典毒株CV777、LZC以及韩国毒株DR13的亲缘性较远,与2012年以后中国分离毒株以及2013年美国毒株亲缘性均较高。以上结果表明,闽西地区分离毒株与2010年以后国内分离出的PEDV变异毒株的亲缘性较近,属于2010年后国内分离变异毒株。

关键词：亲缘性闽西地区变异规律猪流行性腹泻病毒氨基酸同源性分子进化特征分析

来源：评论

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猪流行性腹泻病毒CHHeN-ZZ株培养特性研究

猪流行性腹泻病毒CHHeN-ZZ株培养特性研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李勤楠周兵强吴志明闫若潜赵雪丽谢彩华王淑娟马震原曹伟伟王东方李宁河南科技大学河南省动物疫病预防控制中心

引言 2010年冬季以来,由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）在全国范围内爆发,对哺乳仔猪具有很高的致死率,造成哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水、最后衰竭而死,... 详细信息

引言 2010年冬季以来,由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）在全国范围内爆发,对哺乳仔猪具有很高的致死率,造成哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水、最后衰竭而死,给养猪业造成了巨大经济损失。本研究通过将河南PEDV流行毒株在Vero细胞上传代培养,成功分离出适应细胞的PEDV CHHeN-ZZ毒株,并对该分离株的培养特性及与不同背景的临床血清的交叉保护性进行研究,为后期开展PEDV变异株与疫苗株之间交叉保护性研究奠定基础。材料与方法将鉴定为PEDV阳性的仔猪肠内容物处理之后,接种于Vero细胞上,在不含血清的病毒维持液中加入终浓度为10μg/mL的胰酶,进行传代培养。对细胞培养物进行RT-PCR、细胞免疫荧光（IFA）鉴定和基因序列测定;对PEDV分离株的细胞培养,增殖规律及稳定传代等培养特性进行研究;采用固定病毒-稀释血清的方法,对不同临床背景血清进行抗体中和试验。结果与讨论结果显示:将病毒接种Vero细胞盲传至第7代,出现细胞病变（CPE）,随着代次增加,CPE出现时间变短,呈现规律性变化,RT-PCR鉴定为阳性,IFA检测可见特异性荧光,Sl、M、ORF3基因测序结果为PEDV对应基因片段,确认分离到一株PEDV（CHHeN-ZZ）。通过FQ-PCR,绘制胞内、胞外病毒一步生长曲线,胞内病毒含量0 h2 h逐步上升,12 h达到峰值,之后逐渐下降,48 h下降幅度突然增大;胞外病毒24 h2 h出现快速增加,72 h左右达到峰值,之后开始逐步下降。PEDV从第20代到第50代,TCID50稳定在100/0.1mL之间,现已传至50代,TCID50值为10/0.1mL;对不同代次分离毒株的M基因和S1基因进行序列分析,第7代与第50代之间的核苷酸同源性分别为99.6%9.9%、99.8%9.9%;分离毒株S1基因与CV777疫苗株同属于基因Ⅰ群,利用分离毒株进行抗体中和试验显示:临床上未曾免疫但感染过基因Ⅲ群PEDV的猪场血清中和抗体效价滴度几乎为零,而疫苗免疫猪场血清中和抗体效价在54.1～74.9。本研究成功分离一株PEDV毒株,生长特性良好,能在细胞上稳定传代培养。抗体中和试验证明CV777疫苗株所在基因Ⅰ群毒株与基因Ⅲ群流行毒株之间的免疫交叉性差。本研究为进一步研究PEDV的免疫原性及交叉保护性提供了参考。

关键词：猪流行性腹泻病毒 CHHeN-ZZ 中和抗体效价培养特性

来源：评论

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重组NDVHN基因减毒鸡白痢沙门菌的构建及其特性研究

重组NDVHN基因减毒鸡白痢沙门菌的构建及其特性研究

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：尚珂余祖华程相朝张春杰郁川廖成水何雷贾艳艳陈桂华河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室

研究目的利用平衡致死系统构建表达鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）的减毒鸡白痢沙门菌（Salmonella enteria serovarPullorum,***）活载体疫苗株,并进一步研究该菌株的生物学及免疫学特性,为筛选... 详细信息

研究目的利用平衡致死系统构建表达鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）的减毒鸡白痢沙门菌（Salmonella enteria serovarPullorum,***）活载体疫苗株,并进一步研究该菌株的生物学及免疫学特性,为筛选合适的重组减毒沙门菌作为疫苗候选株提供一定依据。材料方法本试验将PCR扩增出的HN基因片段克隆至无抗性原核表达载体pYA3493,得到重组表达质粒pYA-HN,进而将经PCR及酶切鉴定正确的重组质粒电转至C79-13ΔcrpΔasd构建重组菌株C79-13ΔcrpΔasd（pYA-HN）,并对重组菌的生化特性、生长特性、遗传稳定性、安毒力及侵袭力进行测定,通过SDS-PAGE和Western blot对该菌表达的HN蛋白进行分析;通过双抗体夹心法、间接ELISA、红细胞血凝抑制试验（HI）及淋巴细胞增殖试验对免疫动物黏膜、体液及细胞免疫应答水平进行检测。结果与讨论该菌株的生化特性与生长特性与C79-13ΔcrpΔasd基本保持一致;NDVHN基因能够在体外稳定遗传;SDS-PAGE结果显示HN基因在重组菌中得到了表达,Western blot结果表明表达蛋白具有良好的免疫原性;重组菌毒力较野生株C79-13降低约3.4×10～4倍且具有较高的侵袭力。该菌株对鸡体重的增加与对照组相比差异不显著（P>0.05）,能显著刺激鸡体免疫器官指数的增加（P<0.05）;HI抗体水平于免疫后21 d时达到最大值（log=5.3）;重组菌免疫后第21 d免疫血清中沙门菌IgG抗体水平显著高于对照组（P<0.05）;在重组菌株免疫鸡肠道冲洗液中检测到较PBS组高水平的分泌型IgA（log=3.56）;免疫组所分离的淋巴细胞经体外刺激后其SI在免疫第21 d达到最大值,即1.698,与PBS组相比差异显著（P<0.05）;免疫保护试验结果显示,重组菌免疫组可能100%抵抗沙门菌野生株的感染,对NDV FE的攻击的保护率达60%。结论本试验成功构建的表达NDV HN的重组*** C79-13ΔcrpΔasd（pYA-HN）,该菌株与其亲本缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd相比具有相似的生物学特性;重组菌免疫后在一定时期内能够刺激机体产生有效的体液、黏膜和细胞免疫应答反应,且具有良好的保护率,为进一步开发不携带抗性标记的NDV基因工程疫苗奠定了良好的基础。

关键词：鸡白痢沙门菌重组菌 NDVHN 野生株特性研究

来源：评论

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坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白抑制病毒感染的研究

坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白抑制病毒感染的研究

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：赵冬敏黄欣梅刘宇卓韩凯凯杨婧谢星星刘晓燕李银江苏省农业科学院兽医研究所国家兽用生物制品工程技术研究中心农业部兽用生物制品工程技术重点实验室

引言鹅坦布苏病毒(GTMUV)属于黄病毒科、黄病毒属,给我国鸭鹅养殖业造成了重大经济损失。病毒囊膜蛋白E(E蛋白)是黄病毒属病毒表面最重要的结构蛋白,在空间上形成3个不同的结构域(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。E蛋白在吸附宿主、与宿主细胞膜融合及病... 详细信息

引言鹅坦布苏病毒(GTMUV)属于黄病毒科、黄病毒属,给我国鸭鹅养殖业造成了重大经济损失。病毒囊膜蛋白E(E蛋白)是黄病毒属病毒表面最重要的结构蛋白,在空间上形成3个不同的结构域(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。E蛋白在吸附宿主、与宿主细胞膜融合及病毒组装过程中发挥重要作用。因此,开展有关GTMUVE蛋白结构域的研究,对揭示黄病毒属病毒的致病机理及制定疫病防控措施具有重要意义。材料与方法利用PCR方法扩增得到目的片段并引入FLAG标签序列(DYKDDDDK),构建重组表达质粒pET28a-E-Ⅰ/Ⅱ。转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达目的蛋白并进行SDS-PAGE分析和western-blot鉴定。将不同浓度的E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ来源重组蛋白与BHK-21细胞孵育后接种GTMUV,进行荧光定量RT-PCR检测病毒核酸含量。将E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ来源重组蛋白与BHK-21细胞孵育,以重组蛋白免疫小鼠制备的阳性血清为一抗,以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,间接免疫荧光检测重组蛋白是否与细胞结合。将E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ来源重组蛋白与细胞后,检测重组蛋白是否对细胞产生毒性利用CCK-8试剂盒检测细胞线粒体还原酶活性。结果与讨论扩增坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ的基因并引入FLAG标签,构建原核表达载体pET28a-Ⅰ/Ⅱ,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导获得目的蛋白,分别利用FLAG单克隆抗体和E蛋白单克隆抗体,进行Western blot鉴定,结果表明其具有良好的免疫反应性。病毒感染抑制试验结果显示,重组蛋白孵育后可显著抑制病毒感染,并且抑制作用与蛋白浓度成正比,重组蛋白浓度为50μg/mL时对病毒感染的抑制率可达60%。间接免疫荧光检测结果显示,重组蛋白可与BHK-21细胞结合,因此可竞争性阻止病毒吸附细胞从而抑制病毒感染。细胞毒性试验结果显示,重组蛋白孵育后细胞活性与对照组相比无显著差异,说明重组蛋白不会对BHK-21细胞产生毒性。结论本研究成功表达GTMUVE蛋白结构域Ⅰ和Ⅱ,纯化的重组E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白可抑制病毒感染BHK-21细胞,并且此重组蛋白可与BHK-21细胞结合,竞争性阻止病毒吸附细胞从而抑制病毒感染。

关键词：重组蛋白坦布苏病毒病毒吸附结构域间接免疫荧光检测病毒感染

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猪圆环病毒2型感染细胞的内质网应激-自噬-凋亡:独立事件还是因果关系?

猪圆环病毒2型感染细胞的内质网应激-自噬-凋亡:独立事件还是因果...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：周莹珊谷元兴齐宝珠朱炳林方维焕浙江大学动物预防医学研究所

猪圆环病毒2型(PCV2)可以引起淋巴结肿大、淋巴细胞减少等病变,使感染猪处于免疫抑制状态,与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的发生密切相关。PCV2有3个ORFs,新近报道表明该病毒可能编码ORF4、ORF5等。ORF1编码复制蛋白Rep,ORF2编码衣... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)可以引起淋巴结肿大、淋巴细胞减少等病变,使感染猪处于免疫抑制状态,与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的发生密切相关。PCV2有3个ORFs,新近报道表明该病毒可能编码ORF4、ORF5等。ORF1编码复制蛋白Rep,ORF2编码衣壳蛋白Cap,ORF3编码蛋白可诱导凋亡。尽管PCV2感染后淋巴细胞减少的机制尚有争论,但研究表明淋巴样组织被组织细胞取代可能与PCV2诱导凋亡有关。病原感染除了诱导宿主细胞凋亡,还可能出现内质网应激(ERS)和自噬,宿主细胞对不同病原感染诱导的此类反应,可能是独立的,也可能相互关联。PCV2与宿主细胞互作的机制尚有很多问题待解,如:PCV2感染除了诱导细胞凋亡,是否引起自噬?是否通过未折叠蛋白反应(UPR)引起ERS?自噬或凋亡是PCV2感染的直接作用还是通过ERS间接导致?PCV2感染过程中自噬与凋亡之间是否存在联系?这些细胞反应是否影响病毒的复制?我们通过对PCV2感染细胞中ERS、自噬和凋亡相关关键分子的特异性抑制和基因沉默,结合免疫印迹、免疫荧光等技术,发现:(1)PCV2感染诱导PK-15细胞自噬,且Cap蛋白的90-233位氨基酸是诱导自噬的关键区域;(2)PCV2可通过CaMKKβ/AMPK/ERK/TSC2/mTOR信号途径激活自噬;(3)PCV2感染或Cap蛋白表达可以上调细胞浆中的钙离子,由此激活CaMKKβ及其下游分子,并诱导自噬,这一过程受IP3受体(IP3R)抑制剂的作用显著下调;(4)PCV2感染选择性激活PERK/eIF2α通路激活ERS,不影响ATF6和IRE1/XBP1途径的ERS通路;(5)PCV2持续感染可以通过PERK/eIF2α途径进一步激活ATF4和CHOP,而CHOP是内质网应激介导凋亡的重要分子,表明PCV2除了ORF3诱导自噬,还可能通过UPR/ERS介导凋亡;(6)IP3R抑制剂处理PCV2感染细胞,不影响PERK/eIF2α通路的活化,初步表明PCV2感染介导的UPR/ERS和自噬是相对独立的过程;(7)细胞的UPR和自噬过程均有利于PCV2复制。上述结果表明,PCV2可以诱导内质网应激、自噬和凋亡,可能是病毒感染不同阶段对宿主细胞的不同影响,其间存在因果关系,特别是UPR和自噬促进PCV2复制,使感染细胞凋亡成为必然的结局。

关键词：猪圆环病毒宿主细胞 PCV ORF 感染细胞内质网应激因果关系

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血清5型、13型副猪嗜血杆菌二价灭活苗研究

血清5型、13型副猪嗜血杆菌二价灭活苗研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：范小兵代军周鹏黄毅谭晓婷文心田文翼平曹三杰黄小波伍锐四川农业大学人兽共患病与猪病防治研究中心

引言副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病,由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）所引起猪的浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的内源性继发感染性疾病。近些年,随着全球养猪业的发展,该病在猪病的发生中起着越来越重要的作用,给养殖户带来... 详细信息

引言副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病,由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）所引起猪的浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的内源性继发感染性疾病。近些年,随着全球养猪业的发展,该病在猪病的发生中起着越来越重要的作用,给养殖户带来巨大的经济损失。本课题对近两年从四川地区所分离的HPS菌株,进行了HPS疫苗用菌株的筛选、疫苗用菌株的生长特性和HPS二价灭活苗的研究,为四川地区副猪嗜血杆菌病的基础研究、预防和控制奠定基础。材料与方法选择四川HPS流行优势血清型5型、13型分离株,作为HPS疫苗用筛选菌株。然后通过测定毒力与免疫原性,从中分别选出MC-203株（血清5型）和XJ-103株（血清13型）。将两菌株划线接种于TSA上并连续传代三次后,挑取单菌落于TSB中,置于37℃,220r/min的空气摇床中培养12h左右,收集菌液。将收集的两种菌液用0.2%的甲醛灭活20h,分别用PBS洗涤并浓缩为1.0×10个/ml,将两菌株和佐剂（铝胶）按1:1:2的比例混合均匀,即成血清5型、13型HPS二价灭活苗。用已制备的HPS二价灭活苗分别免疫14日龄哺乳仔猪和30-35日龄断奶仔猪5头,每头猪注射2ml,同时设立未免对照组。通过观察其接种后的精神状态、呼吸和食欲等,评价所制的二价灭活苗的安全性。结果与讨论根据临床生产实践,用HPS灭活来预防和控制副猪嗜血杆菌病,主要是免疫接种30-35日龄断奶仔猪,其次是接种14日左右的哺乳仔猪,因此需要检验其接种14日龄左右的仔猪和30-35日龄的仔猪的安全性。用所制备并保存的血清5型、13型HPS二价灭活苗,分别免疫14日龄的哺乳仔猪和30-35日龄的断奶仔猪,观察接种后猪只的精神状态、接种部位的变化、呼吸和食欲等临床指标。在细菌灭活苗的生产实践中,菌种中细菌含量的高低与免疫效果呈正相关,细菌含量高可诱发较好的免疫效果,同时也可能会产生副作用。本研究的检测结果表明所制备的HPS二价灭活苗免疫后不会引起猪的不适,是安全可用的。

关键词：灭活苗 HPS 副猪嗜血杆菌副猪嗜血杆菌病

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