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7 篇 广西大学

作者

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11 篇 余祖华
11 篇 程相朝
11 篇 邵国青
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10 篇 赵雪丽
10 篇 吴志明
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10 篇 闫若潜
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猪流行性腹泻病毒E和M基因的遗传变异分析

猪流行性腹泻病毒E和M基因的遗传变异分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王隆柏周伦江刘玉涛车勇良吴学敏陈如敬福建省农业科学院畜牧兽医研究所

前言猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起猪的一种接触性肠道传染病,各种年龄的猪均能感染发病,临床症状主要表现为腹泻、呕吐和脱水,其中以哺乳仔猪感染... 详细信息

前言猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起猪的一种接触性肠道传染病,各种年龄的猪均能感染发病,临床症状主要表现为腹泻、呕吐和脱水,其中以哺乳仔猪感染后的危害最为严重,病死率可高达100%。为了解流行PEDV毒株的变异情况,本研究室前期开展了PEDV的S、N和ORF3基因的变异分析,结果发现流行毒株的这3个基因片段确实存在不同程度的变异。那么对于PEDV毒株相对稳定的E和M基因,是否也出现基因变异?为此,本研究通过对2012-2014年的19份PEDV阳性病料进行了E和M基因序列测定,并分析了基因的变异情况。材料和方法（1）材料:采集2012-2014年PEDV检测为阳性规模猪场的病料,并从中选出具有代表性的19株毒株进行研究。病毒DNA/RNA提取试剂盒购置TANGEN公司,PCR扩增试剂盒购置北京全式金生物科技有限公司,其他反应试剂购自大连宝生生物工程有限公司。（1）方法:设计合成了2对扩增E基因和M基因片段的引物,通过核酸提取及RT-PCR反应,回收PCR产物连接于PMD18-T载体中,转入到DH5α菌株,重组质粒经1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,阳性质粒送至生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。利用DNAMAN软件将所测定的E基因、M基因与参考毒株进行序列比对,分析其同源性,构建遗传进化树。结果与讨论根据测序结果与CV777标准毒株相比较,2012-2014年收集的19株PEDV的E基因除了13株毒株存1个氨基酸突变外,未发现其他氨基酸突变、缺失和插入现象。18株PEDVM基因序列发生若干个氨基酸突变,未发现其他氨基酸的缺失和插入。19株PEDV E基因的核苷酸之间的同源性为97.4%00.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.4%00.0%和97.0%9.6%。18株PEDV M基因的核苷酸之间的同源性为97.4%00.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.2%9.6%和97.5%8.4%。核苷酸遗传进化树表明福建流行PEDV毒株的E基因与标准CV777毒株亲缘关系较近,而M基因与2008年泰国流行的KU05CB08毒株亲缘关系较近,是个新的基因型,可能源于泰国。登录GenBank 37个基因序列,这进一步丰富了PEDV的分子流行病学数据,更为今后研制PED的新型诊断试剂和疫苗提供理论依据。

关键词：氨基酸突变核苷酸同源性猪流行性腹泻病毒变异分析

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中山病病毒广西分离株的分离鉴定及基因组序列分析

中山病病毒广西分离株的分离鉴定及基因组序列分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王芳吴健敏林俊曹颖颖覃绍敏于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队广西兽医研究所

繁殖障碍性疾病是影响牛羊养殖业发展的重要传染病,其病因复杂众多,虫媒病毒是一类重要的病原。虫媒病毒经由媒介昆虫传播,可以感染多种动物和人类,对畜牧业生产和人类健康构成严重的威胁,同时导致动物的出口贸易受到限制。引起牛羊繁... 详细信息

繁殖障碍性疾病是影响牛羊养殖业发展的重要传染病,其病因复杂众多,虫媒病毒是一类重要的病原。虫媒病毒经由媒介昆虫传播,可以感染多种动物和人类,对畜牧业生产和人类健康构成严重的威胁,同时导致动物的出口贸易受到限制。引起牛羊繁殖障碍的虫媒病毒病主要有阿卡斑病、中山病和茨城病。中山病(Chuzan disease)又称牛异常分娩病,是由中山病病毒(Chuzan virus,CHUV)引起的牛异常分娩病毒性传染病。CHUV是呼肠孤病毒科环状病毒属Palyam病毒群的成员。成年牛呈隐性感染,不表现任何临诊症状。妊娠母牛受到感染后,产出积水性无脑和脑发育不良的犊牛。主要临床表现为流产、早产、死产或畸形产。异常分娩的犊牛少数病例出现头顶部稍微突起,但体形和关节不见异常,多数表现为哺乳能力丧失(人工帮助也能吸孔)、失明和神经症状。该病是OIE于20世纪90年代规定的B类传染病,主要分布在日本、韩国和澳大利亚。在我国,这是中山病病毒的分离鉴定的首次报告。根据虫媒分布特点,虫媒病毒病的流行具有一定的周期性和地方流行性。因此,为了解我国虫媒病毒病流行情况,我们在广西马山县设立监控点,筛选血清学阴性的5只羊和10头牛建立哨兵动物群,每周采集全血、抗凝血并收集虫媒。对抗凝血样品进行病毒分离,目前已经分离获得蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血热病毒(epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)和CHUV。其中CHUV病毒是我国首次获得分离,将其命名为GX871。对GX871株进行全基因组序列测定,结果显示,基因组全长18915bp,分10个节段:S1(3930bp)、S2(3055bp)、S3(2774bp)、S4(1967bp)、S5(1764bp)、S6(1610bp)、S7(1151bp)、S8(1059bp)和S10(728bp),分别编码VP1、VP2、VP3、VP4、NS1、VP5、VP7、NS2、VP6和NS3/NS3a蛋白。对结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7的进化分析显示,与日本CHUV参考毒株K-47的核苷酸同源性分别为98.1%、97.2%、96.0%、96.6%,氨基酸同源性分别为99.0%、99.9%、99.6%、100%,与已发表的日本毒株在均同一分支。与其他毒株的序列比对发现,S1基因节段有碱基缺失和插入,导致5个氨基酸移码,S5基因节段的非编码区也出现碱基缺失和插入。以上结果表明,CHUV广西分离株GX871可能来源于日本,但编码结构蛋白S1的基因和编码非结构蛋白S5的基因存在独特的变异,说明该病毒在我国已发生长时间的演化。该毒株的致病性及其毒力,有待进一步的研究。

关键词：中山病基因组序列分析分离鉴定分离株

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基于猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的胶体金免疫层析检测方法建立

基于猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的胶体金免疫层析检测方法建立

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：魏艳秋朱卫霞袁万哲陈立功李潭清宋勤叶河北农业大学动物医学院河北省兽用生物制品工程技术研究中心

引言/目的 2010年以来,由猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异毒株引起的PED在我国广泛流行,给养猪业造成了巨大经济损失。PED的临床症状与猪传染性胃肠炎、轮状病毒感染等其他肠道传染病极易混淆,建立PEDV快速检测方法具有重要的实践意义。... 详细信息

引言/目的 2010年以来,由猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异毒株引起的PED在我国广泛流行,给养猪业造成了巨大经济损失。PED的临床症状与猪传染性胃肠炎、轮状病毒感染等其他肠道传染病极易混淆,建立PEDV快速检测方法具有重要的实践意义。核蛋白（N蛋白）是PEDV的主要结构蛋白,保守性强,是病毒感染早期诊断和疫病监测的主要靶蛋白。本研究旨在制备N蛋白单克隆抗体（McAb）,建立基于McAb的PEDV胶体金免疫层析方法。材料与方法以重组PEDVN蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,应用ELISA筛选分泌PEDVN蛋白McAb的阳性杂交瘤细胞;通过ELISA鉴定抗体的类和亚类;应用Western blot和免疫组化鉴定分泌抗体的免疫原性和特异性。进而应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金悬液;以McAb标记胶体金颗粒,吸附于玻璃纤维素膜上,制备金标垫;以针对N蛋白不同表位的另一株McAb和羊抗鼠IgM印迹于硝酸纤维膜,分别作为检测线与质控线,组装试纸条;用该试纸条检测腹泻仔猪小肠内容物,评价其应用性。结果与讨论获得了4株分泌抗PEDVN蛋白McAb的杂交瘤细胞（A7、E10、F7、C1株）。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM类,分别识别不同抗原表位,均能够与PEDV N蛋白,或与猪小肠绒毛上皮细胞内的PEDV特异结合。连续将4株杂交瘤细胞传至30代,抗体效价稳定在1:100～1:800之间,表明杂交瘤细胞具有良好的抗体分泌稳定性。A7、E10、F7、C1株杂交瘤细胞诱导产生的腹水抗体效价分别为1:10～6、1:10～5、1:10～3和1:10～2。用McAb A7、F7和羊抗鼠IgM组装的试纸条能够特异地与PEDV阳性小肠内容物反应,与PRRSV、CSFV、PCV和PRV等病毒无非特异反应。试纸条与RT-PCR对13份腹泻仔猪小肠内容物的阳性检出率分别为38.46%和46.15%,两者的符合率为83-3%。该结果表明,利用抗PEDVN蛋白单克隆抗体建立的PEDV胶体金免疫层析试纸条能够快速、特异地检测PEDV,可用于现场诊断。结论制备了4株能够稳定分泌PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,初步成功组装了基于单克隆抗体的PEDV检测胶体金免疫层析试纸条,为PEDV胶体金试纸条的进一步研发搭建了技术平台。

关键词：胶体金免疫层析检测方法杂交瘤细胞猪流行性腹泻病毒单克隆抗体

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以CMV启动子驱动鹅源基因Ⅶ型NDV拯救与弱毒疫苗候选株的构建

以CMV启动子驱动鹅源基因Ⅶ型NDV拯救与弱毒疫苗候选株的构建

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王建忠冯娜王化磊杨松涛夏咸柱丁壮吉林大学动物医学学院军事医学科学院11所

引言新城疫（Newcastle disease,ND）是危害世界养禽业的重要传染病之一,当前在世界范围内NDV的流行以基因Ⅶ型为主,而国内外广泛使用的弱毒疫苗株均为基因Ⅱ型,由于基因型与抗原性的不匹配,当前广泛应用的弱毒疫苗株不能完全阻止病毒感... 详细信息

引言新城疫（Newcastle disease,ND）是危害世界养禽业的重要传染病之一,当前在世界范围内NDV的流行以基因Ⅶ型为主,而国内外广泛使用的弱毒疫苗株均为基因Ⅱ型,由于基因型与抗原性的不匹配,当前广泛应用的弱毒疫苗株不能完全阻止病毒感染,并且受到强毒流行株攻击后排毒现象严重。反向遗传操作技术的发展,尤其是理想的病毒拯救系统,为研发与流行毒株相一致的基因Ⅶ型NDV弱毒疫苗候选株及候选疫苗载体提供了新思路。材料与方法BHK-21细胞由本实验室保存;SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。全长转录质粒与辅助质粒构建:采用分段克隆、体外拼接的策略构建NDVNA-1株基因组全长cDNA克隆,并在两端分别引入锤头核酶和丁型肝炎病毒核酶序列,插入到载体pCI-neo的CMV启动子下游,构成全长转录质粒pCI-NA-1。将NP、P和L基因ORF克隆至载体pcDNA3.1中构建辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L。重组病毒的拯救:将转录质粒pCI-NA-1及辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L按4:2:1:1比例共转染BHK-21细胞,将转染产物接种SPF鸡胚尿,成功获得子代重组病毒rNA-1。重组病毒的鉴定:经间接免疫荧光、电镜观察、RT-PCR及测序分析对重组病毒rNA-1进行鉴定,以确定其完全来源于所构建的cDNA克隆。致弱株的构建:将NDVNA-1株天然强毒株特征的F裂解序列RRQKR↓F替换为弱毒特征基序GRQGR↓L,拯救获得突变致弱株rmNA-1。免疫原性评价:以此鹅源基因Ⅶ型NDV致弱株按2×10～6 EID/0.2mL/只的剂量通过皮下免疫4日龄雏鹅,间隔三周后,加强免疫一次,并于免疫前和免疫后每周采血一次,分离血清。结果与讨论通过血凝及血凝抑制检测证实重组病毒rNA-1拯救成功,电镜观察可见典型副黏病毒形态特征,以NDV抗血清进行免疫荧光染色在荧光显微镜可见特异的绿色荧光反应,RT-PCR鉴定结果表明重组病毒rNA-1完全由cDNA质粒拯救而来排除野毒污染。突变修饰株rmNA-1致病力显著降低,致病表型从强毒变为弱毒;以rmNA-1免疫雏鹅后,可诱导产生坚实的NDV特异中和抗体,加强免疫三周后最高抗体水平可达10.5log,并且直到免疫后12周抗体水平仍维持在6.75log2。结论成功构建由CMV启动子控制不依赖传统T7 RNA聚合酶的NDV拯救系统,并成功获得基因Ⅶ型NDV致弱株,免疫雏鹅后显示出良好的免疫原性,为新型弱毒疫苗候选株的研制奠定了基础。

关键词：基因Ⅶ型 NDV 疫苗候选株启动子 CMV

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西南两省鸭圆环病毒流行病学调查

西南两省鸭圆环病毒流行病学调查

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：孙文超曹慧慧韦显凯张红云郑敏苏姣秀梁晟郑列丰李军刘棋广西大学动物科技学院军事医学科学院军事兽医研究所广西动物疫病预防控制中心玉林动物疫病预防控制中心

引言鸭圆环病毒(DuCV)属于环状病毒科圆环病毒属成员,是单链环状DNA,大小约1.99 kb左右,包含三个主要开放读框(ORF),ORF1、ORF2和ORF3。鸭圆环病毒感染后鸭羽毛紊乱、机体状况差、体重减轻,并引起淋巴细胞耗竭,组织细胞增生症等,容易引... 详细信息

引言鸭圆环病毒(DuCV)属于环状病毒科圆环病毒属成员,是单链环状DNA,大小约1.99 kb左右,包含三个主要开放读框(ORF),ORF1、ORF2和ORF3。鸭圆环病毒感染后鸭羽毛紊乱、机体状况差、体重减轻,并引起淋巴细胞耗竭,组织细胞增生症等,容易引起免疫抑制作用。流行病学调查发现鸭圆环病毒在鸭群中流行率比较高,病毒可通过水平和垂直方向传播。从2007年中国首次报道该病毒感染以来,随后多个省市均报道证实鸭圆环病毒的存在,阳性率15.28%-81.63%不等。本研究目的通过调查西南两省(广西壮族自治区和云南省)鸭圆环病毒的流行情况,为进一步发现病毒遗传变异规律奠定基础。材料与方法在活禽市场分别采集来源于广西壮族自治区和云南省的鸭组织样品,包括脾脏、肝脏、心脏、肾、法氏囊等器官。提取基因组,进行PCR鉴定。PCR产物送大连宝生物工程公司进行核苷酸序列测定。使用DNAStar软件进行序列拼接并使用MEGA5.0软件构建遗传进化树,进化分析采用neighbor-ioining法。使用重组检测软件RDP4和SimPlot3.5.1对序列进行重组分析。结果与讨论本研究对2012-2013年来源于两省的200份鸭组织进行了PCR扩增和测序。共检出10份鸭圆环病毒阳性,完成其中6株全长测序。分别命名为YN24/2013、YN26/2013、YN27/2013、NN11/2012、NN12/2012、NN13/2012。经测序后拼接获得6株鸭圆环病毒全长与GenBank上德国、美国、中国台湾和中国大陆的分离株序列进行同源性分析发现同源性在82.2%-99%之间。YN26/2013,YN27/2013,NN11/2012,NN12/2012和NN13/2012与基因Ⅰ型的German(德国分离株)同源性在94.4%-97.7%之间,属于鸭圆环病毒Ⅰ型;YN24/2013与TC1/2002(台湾分离株)、GX1104(广西分离株)同源性分别为97.2%和98.3%,因此YN24/2013与TC1/2002(台湾分离株)、GX1104(广西分离株)等同为鸭圆环病毒Ⅱ型。为了能更好的揭示本研究的发现,应用RDP4和SimPlot3.5.1重组软件对序列进行重组分析。结果表明YN26/2013、YN27/2013基因间隔区(927～1159nt)存在多处基因位点的突变。该区域存在与基因Ⅱ型GX1104发生重组。基因间隔区存在重组,为我们更好的了解鸭圆环病毒不同基因型之间重组提供可靠的支持。这些结果不仅丰富了目前鸭圆环病毒的数据库,为进一步发现病毒遗传变异的规律奠定了基础。

关键词：鸭圆环病毒同源性分离株流行病学调查

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肥大细胞对重组口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式识别效应

肥大细胞对重组口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式识别效应

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王燕张莎莎张义明李丽敏王家鑫河北农业大学动物医学院免疫学实验室

引言口蹄疫是口蹄疫病毒(FMDV)感染偶蹄动物引起的一种急性接触性传染病,目前仍无有效的预防措施。FMDV的结构蛋白VP1不仅可刺激机体产生中和抗体,而且所诱导的细胞免疫应答可对抗7种血清型FMDV的攻击,VP4含有T细胞表位,并可被牛的多种... 详细信息

引言口蹄疫是口蹄疫病毒(FMDV)感染偶蹄动物引起的一种急性接触性传染病,目前仍无有效的预防措施。FMDV的结构蛋白VP1不仅可刺激机体产生中和抗体,而且所诱导的细胞免疫应答可对抗7种血清型FMDV的攻击,VP4含有T细胞表位,并可被牛的多种单体型MHC分子识别。肥大细胞(MC)一直被认为是超敏反应的效应细胞,但最近发现,病原体可刺激MC脱颗粒释放组胺和细胞因子,藉此启动固有免疫和适应性免疫。由于MC表达Toll样受体(TLR)、甘露糖受体(MR)和清道夫受体(SR),故本实验用重组FMDV VP1-VP4蛋白分别负载经上述受体抑制剂处理的小鼠MC,观察其在不同时间的脱颗粒现象,检测其分泌的TNF-α,以揭示MC对FMDV结构蛋白的模式识别作用。方法按本室报道方法制备重组VP1-VP4蛋白,用TLR2/TLR4抑制剂、MR抑制剂、SR抑制剂分别处理小鼠MC,然后负载VP1-VP4蛋白,分别记为TLR组、MR组和SR组;VP1-VP4蛋白负载的正常MC和未做任何处理的正常MC作为对照,分别记为MC+VP1-VP4组和MC组。分别于15、30、45、60 min时观察其脱颗粒,并在0.5、1、6、12、24 h时收集上清液,用ELISA检测其TNF-α含量。结果与讨论以脱颗粒MC数为指标,SR组在负载VP1-VP4蛋白15 min时显著低于MC+VP1-VP4组(P<0.01),其他组虽然有所减少,但与MC+VP1-VP4组差异不显著,这表明MC在受到VP1-VP4刺激后发生脱颗粒主要是由SR介导的。检测上清液中肝α含量的结果显示,在0.5 h、1 h、6 h和12 h,各抑制剂组与MC+VP1-VP4组及MC组相比差异不显著。但是24 h时各抑制剂组的TNF-α含量均显著低于MC+VP1-VP4组(P<0.01),其中MR组最低,几乎与MC组相同。这表明MC可通过MR、TLR2/TLR4和SR识别VP1-VP4,从而引起MC分泌TNF-α,其中以MR介导作用最强。这表明MC主要通过SR和MR识别重组FMDVVP1-VP4蛋白,其中SR主要介导MC脱颗粒,MR则主要介导MC分泌TNF-α,但启动MC分泌TNF-α的时间却晚于其它病原体对MC的刺激。由于TNF-α可促进树突状细胞的成熟,增强其抗原提呈功能,所以FMDV结构蛋白延迟MC分泌TNF-α的现象可能是灭活FMDV疫苗免疫保护诱导期长的原因之一。

关键词：口蹄疫病毒抑制剂 VP1-VP4 结构蛋白肥大细胞模式识别

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RHDV VP60蛋白与受体HBGAs结合位点的初步分析

RHDV VP60蛋白与受体HBGAs结合位点的初步分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李珊珊胡波宋艳华范志宇魏后军王芳江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言兔出血症是由免出血症病毒(RHDV)引起的高度致死性传染病。VP60是RHDV的主要结构蛋白,真核表达VP60能够形成与天然病毒类似的病毒样颗粒(VLPs),可作为研究该病毒的模型。组织血型抗原(HBGAs)是由O-或N-末端连接到蛋白或糖脂上的多糖... 详细信息

引言兔出血症是由免出血症病毒(RHDV)引起的高度致死性传染病。VP60是RHDV的主要结构蛋白,真核表达VP60能够形成与天然病毒类似的病毒样颗粒(VLPs),可作为研究该病毒的模型。组织血型抗原(HBGAs)是由O-或N-末端连接到蛋白或糖脂上的多糖,研究证实RHDV侵染机体时能够特异性识别HBGAs受体。本文通过VP60截短蛋白与HBGAs结合试验,分析受体的结合位点。材料与方法(1)蛋白样品:杆状病毒表达的VP60蛋白、大肠杆菌表达的VP60截短蛋白P250-350、P330-440、P470-579、P330-350和P559-579,均由本实验室表达。(2)H型HBGAs的检测:采集O型血志愿者的唾液并进行处理。利用血凝抑制试验筛选含H型HBGAs个体的唾液样品。(3)VP60与HBGAs结合试验:筛选最佳唾液包被浓度、VP60蛋白浓度、mAbs稀释度及酶标二抗稀释度。结合试验步骤:PBS稀释的唾液包被于酶标板上;封闭后加入VP60,mAbs 3D11为一抗;HRP标记羊抗鼠IgG为二抗;TMB显色,测定OD450nn。(4)截短蛋白与HBGAs结合试验:将VP60和截短蛋白进行SDS-PAGE,转印于NC膜上,以3D11为一抗,HRP标记羊抗鼠IgG为二抗,ECL显色。HBGAs结合试验:将VP60及截短蛋白分别按终浓度10μg/mL4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL稀释。HBGAs结合试验步骤按2.3操作。结果与讨论(1)唾液中HBGAs的测定:采集的O型人唾液原液能够完全抑制红细胞与抗H试剂的凝集,表明唾液样品为分泌O型。(2)SDS-PAGE和Westem-blot:VP60及截短蛋白SDS-PAGE电泳显示,在60ku、30ku、28ku左右处有明显条带,与预期大小一致。Westem-blot表明,VP60及截短蛋白均与相应的mAbs有特异性反应。(3)HBGAs结合试验:试验显示,VP60、截短蛋白P250-350、P330-440、P330-350与HBGAs结合反应均为阳性,且随蛋白浓度升高结合值升高;而P470-579、P559-579与HBGAs结合的值与空白对照无差异,说明不与HBGAs结合。结论本研究成功建立了VP60与唾液中HBGAs受体结合的方法,并对VP60截短蛋白进行分析,最终获得330-350aa是VP60与HBGAs受体结合的关键区域之一。该研究有助于了解病毒与宿主相互作用的机制,为病毒的吸附、感染及抗病毒药物的研究奠定基础。

关键词： RHDV VP60 HBGAs 受体结合结合位点初步分析

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猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：华耀王玮李郁孙裴魏建忠安徽农业大学动物科技学院

引言猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的高度接触性肠道传染病。自2010年10月以来,PED在我国... 详细信息

引言猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的高度接触性肠道传染病。自2010年10月以来,PED在我国的流行广泛并呈现新的特点,感染PEDV后,哺乳仔猪死亡率达80%00%,而繁殖母猪和公猪则很少表现出临床症状。建立快速、可靠的PEDV抗体检测方法,进行PED流行病学的监测以及猪群免疫过PED疫苗后抗体水平的检测,对于本病的预防具有重要意义。PEDVS蛋白是病毒主要的结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体,且产生的抗体水平持续时间长,因此S蛋白可作为可靠的检测抗原。本研究以表达的S蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法,为PEDV抗体检测试剂盒的研发和应用奠定基础。材料与方法利用生物学软件对PEDV S蛋白进行抗原位点分析,选择S蛋白的主要抗原表位区,利用RT-PCR扩增S基因,然后重组至表达载体pET-32a（+）中,构建重组pET（+）-32a-S原核表达质粒,进行S蛋白的诱导表达和纯化并采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组S蛋白作为包被抗原,摸索间接ELISA检测方法的抗原包被浓度、一抗的稀释倍数、一抗的作用时间、封闭液的种类、二抗的稀释倍数、二抗的作用时间及显色时间。并通过特异性试验、重复性试验以及与商品化PEDV抗体检测试剂盒和Western-blot对比试验进一步确定所建立间接ELISA检测方法的可行性。结果与讨论成功表达了重组S蛋白,重组的S蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应,并成功建立一种基于重组S蛋白的间接ELISA检测方法,优化的反应条件为:蛋白包被浓度为8mg/L,一抗的稀释倍数为1:40,一抗的作用时间是30min,最佳的封闭液时2%BSA,二抗的最佳稀释度为1:1500,的作用时间是45 min,显色时间是10 min。组内及组间变异系数均小于10%,重复性较好。建立的间接ELISA方法与商品化的ELISA抗体检测盒对比试验显示两者符合率为86.67%,敏感性为89.83%,特异性为82.62%;建立的间接ELISA方法Western-blot对比试验显示两者符合率为88.89%,敏感性为90.20%,特异性为83.33%。本研究的建立基于PEDV S蛋白的间接ELISA方法,具有良好的重复性,特异性,敏感性,并可能在临床上成为检测猪群中PEDV抗体水平及监测PED流行情况的有效方法。

关键词：主要抗原表位区猪流行性腹泻病毒 ELISA 原核表达检测方法

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2012-2014年河南省猪流行性腹泻病毒主要基因遗传变异分析

2012-2014年河南省猪流行性腹泻病毒主要基因遗传变异分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：赵雪丽吴志明闫若潜周兵强谢彩华王淑娟马震原曹伟伟河南省动物疫病预防控制中心河南科技大学

引言猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viruses,PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病,相继在欧洲和亚洲的多个国家爆发... 详细信息

引言猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viruses,PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病,相继在欧洲和亚洲的多个国家爆发。自2010年冬季以来,由PEDV引起的猪流行性腹泻疫病在我国大部分养猪省份暴发和流行,给养猪业造成了巨大经济损失。为分析河南省PEDV的遗传变异情况,本研究对2012-2014年检测出的具有代表性的16个PEDV阳性样品的S1、M和ORF3基因进行序列测定和遗传进化分析。材料与方法 16个PEDV阳性样品分别来至2012-2014年河南省不同地区不同饲养管理和免疫背景猪场的样品。反复比对GenBank中登陆的PEDV S1、M和ORF3基因序列分别设计合成3对特异性引物对,分别进行三段基因的RT-PCR扩增,克隆至Peasy-T Vector,进行序列测定。应用DNAStar、ClustalX、MEGA6.0等生物学软件进行基因序列拼接、比对和进化树分析。结果与讨论S1基因系统进化树分析表明,16株PEDV河南株的S1基因的变异情况基本一致,同属于基因Ⅲ群,与2012～2013年国内多数省份以及省内不同地区之间的PEDV流行毒株相比同源性高,没有发生大的变异;与2011年国内基因Ⅰ群流行株相比亲缘关系较远(同源性90%左右),与韩国PEDV代表株的S1基因亲缘关系较近(同源性为94%左右),与日本PEDV代表株的S1基因相比亲缘关系较远(同源性为91%左右),与经典毒株CV777的相比,在不同位点存在核苷酸的缺失与插入,其同源性为92%左右,与我国现用的CV777疫苗株同源性为91%左右,亲缘关系较远。M和ORF3基因的进化树分析显示,M基因可分为4个群,河南PEDV流行毒株主要以基因3群为主,其中CHHeN ZZ-2012毒株属于基因2群;ORF3基因分为3个群,CHHeN DF2-2012毒株和CHHeN ZZ-2012毒株分布于基因2群,其余毒株属于基因3群。表明当前河南主要流行的PEDV毒株M基因和ORF3基因与2010年以后国内流行的大多数毒株同源性较高,与韩国毒株亲缘关系较近;与经典毒株和疫苗株相比,其M基因和ORF3基因发生了变异,且临床出现或与疫苗株相似或与变异株相似的流行毒株,这些毒株S1、M和ORF3基因变异的生物学意义有待于进一步深入研究。

关键词： ORF 疫苗株猪流行性腹泻病毒变异分析基因遗传河南省

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广西鸭源禽痘病毒的分离与鉴定

广西鸭源禽痘病毒的分离与鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：曹慧慧孙文超郑敏韦显凯苏姣秀梁晟郑列丰李军刘棋广西大学广西动物疫病预防控制中心

引言禽痘(Avian pox)是由禽痘病毒(Avian poxvirus,APV)引起家禽、观赏鸟和野生鸟类的一种急性接触性传染病,目前已经发现其可自然感染大约9000种野禽和家禽中的232种。其典型临床特征是在禽无毛或少毛的皮肤上发生痘疹(皮肤型);或在禽... 详细信息

引言禽痘(Avian pox)是由禽痘病毒(Avian poxvirus,APV)引起家禽、观赏鸟和野生鸟类的一种急性接触性传染病,目前已经发现其可自然感染大约9000种野禽和家禽中的232种。其典型临床特征是在禽无毛或少毛的皮肤上发生痘疹(皮肤型);或在禽口腔、咽喉部粘膜形成纤维素性坏死性痂膜(粘膜型),即所谓的"白喉"。与鸡、鸽、火鸡、麻雀等陆禽相比,鸭和鹅等水禽极少发生禽痘,鸭痘曾经在法国、荷兰、意大利、印度和加拿大的家鸭和德国番鸭发生过。目前主要在北美地区的麻鸭(mallard duck)、黑嘴天鹅(trumpeter swan)、北美斑鸭(mottled duck)、赤头鸭(red head duck)和蓝翅鸭(bhe-winged teal)等野生水禽中被发现,而整个东亚地区,包括东南亚和东北亚从未有从家鸭或者野生水禽分离到禽痘病毒的报道。2013年10月,我们首次从广西大新、田东和西林等3'县分离到同一种鸭源禽痘病毒(暂命名为MDUPV/(GX),并进行病毒的鉴定,为防控禽痘病毒在我国的流行传播提供理论依据。材料与方法采集发病鸭眼痘组织样品,经细菌学和真菌培养排除细菌感染后,通过电镜和病理组织学检查鉴定病毒。同时根据文献分别合成禽痘病毒P4b基因(fpv167)和DNA聚合酶基因(fpv094)特异性引物,分别扩增田东、大新和西林毒株的P4b基因和DNA聚合酶基因部分序列,用MEGA遗传进化分析软件绘制基于P4b基因部分序列(426bp)和DNA聚合酶基因部分序列(555bp)的遗传进化树。将皮肤痘疹病料研磨,按1:5制成悬液,经双抗处理后,采用人工气室法接种于11日龄SPF麻鸭胚绒毛尿囊膜。结果与讨论皮肤痘疹组织,研磨后取少量上清,经磷钨酸负染,在透射电镜下观察,可见330×280×200nm呈砖形的病毒粒子,且表面有不规则的管状结构,符合禽痘病毒粒子形态特征。进一步制备超薄切片在电镜下观察,可见典型的病毒包涵体。取皮肤痘疹组织制备组织切片,经HE染色,在显微镜下观察,发现病变部位有大量角质(棘)细胞增生、水肿、坏死和局部炎性细胞浸润,在许多病变细胞的胞浆中可见巨大、嗜酸性的、呈环状的胞浆包涵体(Bollinger氏小体),符合痘病毒感染的病理学特征。遗传进化结果表明,广西麻鸭毒株与北美野生水禽源禽痘病毒最为接近,属于A5亚群的一个独立新分支。鸭胚分离结果显示,部分鸭胚在接种部位附近的绒毛尿囊膜有灰白色的水肿隆起,且PCR检测病毒P4b基因为阳性。初步证实MDUPV/GX可以在麻鸭胚中增殖,但让需要继续传代使其充分适应。

关键词：禽痘病毒绒毛尿囊膜分离与鉴定

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