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358 篇 会议
2 篇 期刊文献

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8 篇 同源性
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机构

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20 篇 中国农业科学院上...
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19 篇 军事医学科学院军...
18 篇 河南科技大学
17 篇 河南农业大学
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13 篇 吉林农业大学
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8 篇 军事医学科学院军...
8 篇 四川农业大学
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8 篇 山东农业大学
7 篇 中国畜牧兽医学会...
7 篇 河南省动物疫病预...
7 篇 广西大学

作者

17 篇 金宁一
14 篇 涂长春
13 篇 丁壮
12 篇 周恩民
11 篇 熊祺琰
11 篇 冯志新
11 篇 余祖华
11 篇 程相朝
11 篇 邵国青
10 篇 何雷
10 篇 赵雪丽
10 篇 吴志明
10 篇 刘茂军
10 篇 闫若潜
9 篇 王淑娟
9 篇 张春杰
9 篇 谢彩华
9 篇 李一权
9 篇 郁川
8 篇 刘光清

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355 篇 中文
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重组鸡白细胞介素-6/2复合蛋白对鸡T、B淋巴细胞增值活性和T淋巴细胞亚群的影响研究

重组鸡白细胞介素-6/2复合蛋白对鸡T、B淋巴细胞增值活性和T淋巴...

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李勤楠闫若潜吴志明谢彩华赵雪丽李宁李方方河南科技大学动物科技学院河南省动物疫病预防与控制中心

引言白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）具有促进Th2型细胞分化,刺激T、B淋巴细胞增殖与分化,可作为疫苗佐剂发挥其免疫增强作用;白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）可促进T细胞生长与分化,诱导CTL、NK细胞细胞分泌Th1型细胞因子,从... 详细信息

引言白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）具有促进Th2型细胞分化,刺激T、B淋巴细胞增殖与分化,可作为疫苗佐剂发挥其免疫增强作用;白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）可促进T细胞生长与分化,诱导CTL、NK细胞细胞分泌Th1型细胞因子,从而提高机体的细胞免疫能力;将IL-2与IL-6联合应用可发挥更强的协同免疫增强作用。本研究前期的研究结果已证明表达纯化的重组鸡白细胞介素-6/白细胞介素-2（重组复合蛋白,rChIL-6-Linker-ChIL-2）在体内外均具有与抗ChIL-6单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性反应的免疫原性,且均具有促鸡外周血T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖活性。本研究在此基础上进一步研究重组复合蛋白应用鸡体后对鸡淋巴细胞亚群的影响,并与重组鸡ChIL-6（rChIL-6）和ChIL-2蛋白（rChIL-2）进行比较,以揭示重组融合蛋白在鸡体内增强细胞免疫和体液免疫功能的作用机理。材料与方法重组复合蛋白、rChIL-6、rChIL-2均由河南省动物疫病预防控制中心保存;28日龄SPF鸡由乾元浩郑州生物药厂提供;流式细胞仪（FACS Calibur）为美国BD公司产品;将实验动物分为PBS组、重组复合蛋白组、单一rChIL-6组、单一rChIL-2组、rChIL-6+rChIL-2混合组,于28日龄进行蛋白注射,于接种前（0 dpi）以及接种后的不同时间（dpi）采集一次抗凝血和脾脏。采用MTS法分别测定不同时期各组鸡外周血T淋巴细胞（PBLC）和脾脏B淋巴细胞的增殖活性;采用流式细胞术对不同时期各组鸡外周血T淋巴细胞中CD3CD4、CD3CD8百分含量以及CD4/CD8比值进行检测。结果与讨论结果表明:7 dpi5 dpi,重组复合蛋白、rChIL-6、rChIL-2、rCHIL-6+rChIL-2混合蛋白均具有良好的促T、B淋巴细胞增殖活性,重组复合蛋白组和rChIL-6+rChIL-2混合蛋白组促鸡T、B淋巴细胞增殖活性显著优于单一蛋白使用组（P<0.05）,各蛋白接种组在14 dpi1 dpi期间,鸡T、B淋巴细胞的增殖活性曲线达到峰值;重组复合蛋白、rChIL-6、rChIL-2和rChIL-6+RChIL-2混合蛋白在7 dpi1 dpi期间均可显著提高鸡外周血T淋巴细胞中CD3CD4细胞百分含量、降低CD3CD8细胞的百分含量、提高CD4/CD8比值;7 dpi1 dpi期间,重组复合蛋白组鸡的CD3CD4、CD3CD8细胞含量及CD4/CD8比值与单一蛋白对照组相比差异均显著（P<0.05）;由此可见,重组融合蛋白具有良好的促进T、B淋巴细胞增殖的活性,提高外周血中CD4/CD8比值,增强机体的体液免疫和细胞免疫;重组复合蛋白对鸡淋巴细胞亚群百分含量、CD4/CD8比值影响程度和细胞免疫功能的增强作用优于单一rChIL-6蛋白或rChIL-2蛋白;重组复合蛋白在体内发挥了ChIL-6、ChIL-2对细胞免疫和体液免疫功能的协同增强作用。

关键词：复合蛋白白细胞介素重组融合蛋白淋巴细胞亚群

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β-丙内酯在H9N2禽流感灭活疫苗中的应用研究

β-丙内酯在H9N2禽流感灭活疫苗中的应用研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：黄文科陈春丽韩静芳梁桂益林绮萍严洁珍陈瑞爱广东大华农动物保健品股份有限公司

前言β-丙内酯(BPI)是一种杂环化合物,对病毒具有很强的灭活作用,并且具有极易水解成无毒无害物质的特性,目前在国外广泛应用于各种疫苗的灭活。本研究通过应用β-丙内酯作为H9N2禽流感病毒灭活剂,对病毒灭活效果、灭活剂残留量、疫苗... 详细信息

前言β-丙内酯(BPI)是一种杂环化合物,对病毒具有很强的灭活作用,并且具有极易水解成无毒无害物质的特性,目前在国外广泛应用于各种疫苗的灭活。本研究通过应用β-丙内酯作为H9N2禽流感病毒灭活剂,对病毒灭活效果、灭活剂残留量、疫苗安全性和疫苗免疫效力等多个方面进行了研究,为β-丙内酯能否代替甲醛进行禽流感病毒的灭活提供参考依据。材料与方法(1)灭活条件的优化:β-丙内酯以不同浓度、不同灭活时间、不同pH值条件下对H9N2鸡胚毒进行4℃灭活,然后37℃水解2h,最后检测灭活效果及灭活前后胚液HA效价。(2)β-丙内酯残留量检测:对灭活后鸡胚液和免疫疫苗后肌肉进行残留量检测。(2)动物免疫试验:按照优化后的灭活条件灭活H9N2的SPF鸡胚毒液和海兰鸡鸡胚毒液,用常规浓度为0.1%甲醛量灭活作对照,然后分别制备成油乳剂灭活苗免疫SPF鸡和广西土鸡,另设生理盐水、大华农商品苗免疫组作对照组,定期检测免疫鸡血清AIV-H9 HI抗体变化情况。结果与分析(1)β-丙内酯灭活条件的优化:试验结果显示β-丙内酯对禽流感H9N2病毒胚液最佳的灭活条件为β-丙内酯:胚液(v/v)比例为1:3000灭活24h或β-丙内酯:胚液(v/v)比例为1:1000灭活18h;本实验设定的三个pH值(6.5、7.0、7.5)对病毒灭活效果的影响不明显;β-丙内酯灭活后的胚液HA效价下降在1个滴度以内,甲醛对照组灭活后的胚液HA效价下降为1～2个滴度。(2)残留量检测结果:H9N2鸡胚毒液经β-丙内酯灭活和水解后,鸡胚液和SPF鸡、广西土鸡免疫疫苗肌肉中未检测到β-丙内酯残留,且免疫鸡无异常发生,说明β-丙内酯在灭活后的37℃水浴中完全水解,在疫苗中无残留,对动物机体安全性高。(3)动物免疫试验结果:SPF鸡胚毒液制备的油苗和大华农油苗免疫SPF鸡和广西土鸡后均产生了较高HI抗体,并且持续到90天时,都能维持在较高的抗体水平(SPF鸡HI抗体为91og2以上,广西土鸡HI抗体为8log2以上),其中β-丙内酯:胚液(v/v)比例为1:1000油苗组与0.1%甲醛油苗组、大华农油苗组的抗体水平差异较小,介于0～1.5log2之间,优于β-丙内酯:胚液(v/v)比例为1:3000油苗组。海兰胚毒液制备的油苗免疫SPF鸡和广西土鸡后均产生了较高的HI抗体,并且持续到90天时,都能维持在较高的抗体水平(SPF鸡HI抗体为91og2以上,广西土鸡HI抗体为7log2以上),其中β-丙内酯:胚液(v/v)比例为1:3000油苗组与0.1%甲醛油苗组、大华农油苗组的抗体水平差异较小,介于0～2 log2之间,略优于β-丙内酯:胚液(v/v)比例为1:1000油苗组。结论本研究结果显示β-丙内酯具有对H9N2灭活能力强HA效价影响小、极易水解成对机体无害产物而无残留等优点,以β-丙内酯作为灭活剂制备的H9N2灭活疫苗与甲醛作为灭活剂制备的H9N2灭活疫苗免疫SPF鸡和广西土鸡免疫效果相当,这一结果为β-丙内酯能否代替甲醛进行禽流感病毒的灭活提供了参考依据。

关键词： β-丙内酯禽流感灭活疫苗灭活剂

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H9N2亚型禽流感病毒NA基因的序列分析

H9N2亚型禽流感病毒NA基因的序列分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：黄欣梅李银赵冬敏刘宇卓杨婧韩凯凯江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言我国自1994年首次报道鸡感染H9N2亚型AIV以来,该病毒迅速传播至其它地区,目前已成为我国主要的禽流感流行毒株,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失。神经氨酸酶（NA）是流感病毒表面的一种重要糖蛋白,不仅是制备疫苗的重要抗原成分,... 详细信息

引言我国自1994年首次报道鸡感染H9N2亚型AIV以来,该病毒迅速传播至其它地区,目前已成为我国主要的禽流感流行毒株,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失。神经氨酸酶（NA）是流感病毒表面的一种重要糖蛋白,不仅是制备疫苗的重要抗原成分,还是流感治疗药物的作用靶点。NA具有较高的变异性,易发生抗原漂移以及产生耐神经氨酸酶抑制剂的毒株。本文分析了华东地区2008～2013年分离的H9N2亚型AIV的NA基因序列,从分子水平了解本地区H9N2亚型AIV NA基因的变异特点和耐药性情况,为H9N2亚型禽流感的防控提供一定的理论依据。材料与方法（1）病毒:11株H9N2亚型AIV毒株均由本实验室于2008～2013年从江苏、安徽、浙江等省有温和流感症状或无明显病症的家禽中分离,经鉴定为H9N2亚型。（2）引物:参考GenBank上发表的H9N2亚型AIVNA基因序列,设计流感病毒通用反转录引物Uni12和一对用以扩增NA全基因序列的特异性引物。（3）NA基因RT-PCR扩增及测定:用体液病毒DNA/RNA抽提试剂盒提取病毒RNA,以Uni12为反转录引物进行反转录获得cDNA,然后以此cDNA为模板进行PCR扩增。将获取的NA基因与pMD18-T载体连接并转化DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆菌送南京金斯瑞公司测序。（4）NA基因序列比较分析:应用DNAStar软件分析NA基因的同源性,并对唾液酸结合位点、蛋白酶活性位点、潜在糖基化位点、抗原决定簇的氨基酸差异进行分析。用MEGA5.05软件进行序列比对,绘制遗传进化树。结果与讨论（1）NA基因系统进化分析:分析结果表明,11株毒株NA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为86.2%9.5%和86.9%9.1%,均属于欧亚分支。其中9株鸡源毒株属于Y280-like亚系,在NA蛋白颈部63～65位点缺失了3个氨基酸;2株鸭源毒株属于G1-like亚系,在颈部39、40位点缺失了2个氨基酸。NA蛋白颈部长度的变化会影响神经氨酸酶的活性,引起病毒复制能力的变化,进而影响病毒的毒力。（2）NA蛋白氨基酸序列分析:11株分离株的NA蛋白在69、146、200、234位点处的N-糖基化位点比较保守,其余的糖基化位点都出现了变异。红细胞结合位点（HB）在431～433位点区域比较保守,但在366～373和399～404位点区域的氨基酸发生了明显的变异。抗原决定簇中的部分氨基酸序列变异也较为活跃,推测与使用疫苗后的抗体选择有关。NA蛋白酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变。结论研究结果表明江苏、安徽、浙江等省养殖鸡群中的H9N2亚型禽流感病毒仍以Y280-like分支较为常见,鸭群中出现G1-like分支应引起人们的注意。NA基因存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。

关键词：禽流感病毒 AIV 糖基化位点序列分析

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1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫IBD活毒疫苗效果观察

1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫IBD活毒疫苗效果观察

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：张渊魁詹先强刘玉云郦晓琼王泽霖郑鹿平福州大北农生物技术有限公司乾元浩生物股份有限公司南京厂河南农业大学禽病研究所

引言为预防鸡传染性法氏囊病通常给雏鸡免疫活毒疫苗,但活毒疫苗常受母源抗体干扰,影响病毒复制、导致免疫失败;如用毒力较强的疫苗免疫,则会引起法氏囊损伤,造成免疫抑制。本研究探讨1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫活毒疫苗后3～4周IBD... 详细信息

引言为预防鸡传染性法氏囊病通常给雏鸡免疫活毒疫苗,但活毒疫苗常受母源抗体干扰,影响病毒复制、导致免疫失败;如用毒力较强的疫苗免疫,则会引起法氏囊损伤,造成免疫抑制。本研究探讨1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫活毒疫苗后3～4周IBD的抗体水平和攻毒保护,旨在与高效法氏囊灭活联苗进行比较,为生产上准确选用疫苗提供科学依据。材料与方法试验用疫苗:IBD中等毒力NF8活苗由乾元浩生物有限公南京厂提供,批号:20140101,有效期至2015.07.08;IBD复合冻干苗(含高毒力2512株)购自梅里亚有限公司美国精选大药厂,批号:LZ097,有效期至2014.08.06。试验用鸡:1日龄SPF鸡135只,分为3大组,每大组45只;1日龄带有母源抗体的商品肉鸡135只,也分为3大组,每大组45只。上述鸡均在各隔离器中喂养,每大组再分成3个小组,各1、2小组于1、5、10日龄分别免疫NF8和2512活毒疫苗,第3小组不免疫做对照。抗体测定:免前、免后20、25天定期采血测定抗体,IBD微量中和试验按常规方法进行。攻毒试验:免疫后25天,从各免疫组和对照组取出5只扑杀检查法氏囊病变,如未见法氏囊明显病变,则进行攻毒。攻毒时免疫组各取10只,连同的对照鸡10只,经口接种IBDVBC6-85株强毒,每只0.2ml,72小时后剖杀,检查法氏囊病变,判定各组保护率。结果与讨论1、5、10日龄SPF鸡免疫NF8活毒疫苗、复合冻干苗(2512株)后IBD中和抗体上升缓慢,免后25天NF8活毒疫苗组的中和抗体依次为6.5、6.8、7.2(1og2),复合冻干苗(2512株)组的中和抗体依次为5.8、9.5、9.9(1og2),均未达到保护临界水平。因剖解检查NF8免疫组部分鸡法氏囊已偏小,复合冻干苗(2512株)免疫组全部鸡法氏囊已高度萎缩,故未再进行攻毒。1日龄有母源抗体(11.3 log2)的商品肉鸡免疫NF8活毒疫苗、复合冻干苗(2512株)后IBD中和抗体持续下降,5、10日龄商品肉鸡免疫NF8、2512活毒苗抗体先下降,而后略有上升。免疫后25天1、5、10日龄免NF8活毒疫苗组的中和抗体依次为4.6、5.7、6.5(1og2),攻毒保护为0/10、1/10、1/10;免复合冻干苗(2512株)组的抗体依次为7.0、8.0、9.3(1og2),攻毒保护为1/10、1/10、2/10(大部分囊萎缩)。未免疫对照组抗体依次为3.9、4.0、3.91og2,毒保护为0/10、0/10、0/10。结论本实验与以往的实验一样,再次证实(1)中等毒力NF8活苗,尤其是高毒力的复合冻干苗(2512株)免疫1、5、10日龄SPF鸡后,可造成鸡法氏囊的部分/全部萎缩,且抗体上升缓慢,免后25天未能达到免疫临界水平;(2)免疫有母源抗体的商品肉鸡后,因受母源抗体干扰,1日龄免疫组抗体持续下降,5、10日龄免疫组抗体先下降而后略有上升,免后25天未能达到免疫临界水平,攻毒均不能很好保护。

关键词：商品肉鸡冻干苗法氏囊病 SPF IBD 疫苗效果

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细胞microRNA130家族抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制

细胞microRNA130家族抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李丽薇高飞姜一峰虞凌雪童光志中国农业科学院上海兽医研究所

介绍猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)可引起母猪晚期流产和仔猪呼吸疾病等临床症状。由于该病的病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有较高的变异性,且临床上可造成持续性感染和免疫抑制,因而利用疫苗免疫防控比较困难。近年来,越来越多的证... 详细信息

介绍猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)可引起母猪晚期流产和仔猪呼吸疾病等临床症状。由于该病的病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有较高的变异性,且临床上可造成持续性感染和免疫抑制,因而利用疫苗免疫防控比较困难。近年来,越来越多的证据表明宿主细胞microRNA(miRNA)是机体先天性/获得性免疫以及宿主-病原体相互作用的复杂网络中不可或缺的调节因子。通过直接结合病毒RNA抑制病毒基因的表达或间接作用于某些细胞成分进而影响细胞内通路和调节先天性免疫应答反应,miRNA在抗病毒感染和复制方面也扮演了重要的角色。细胞miRNA直接靶向病毒RNA或mRNA导致RNA降解或蛋白翻译受阻,干扰病毒感染和复制,是miRNA作用的一种重要方式。例如,丙型肝炎病毒可以利用肝细胞特异性miRNA(miR-122)介导的基因调控,结合病毒RNA的5'端非编码区,促进其复制;let-7c通过直接结合在流感病毒M1(+)基因的3'端非编码区,降解M1(+)cRNA,抑制Ⅳ复制。基于以上背景,本研究利用生物信息学软件预测分析可能与PRRSV病毒基因组有潜在结合作用的miRNA,体外合成并过表达该miRNA,研究其与PRRSV病毒复制之间关系,并证明其发挥作用的机制。材料与方法利用在线工具ViTa和RegRNA对经典毒株vAPRRS和高致病性毒株vJX143均进行预测,找到PRRSV基因组RNA上可能存在的miRNA结合位点。选取miR-130家族作为研究对象,向MARC-145细胞和PAM细胞分别体外转染miRNA模拟物或阴性对照,再感染相同剂量病毒的方法鉴定其是否对PRRSV复制产生影响,并从病毒学水平、基因组复制水平和蛋白翻译水平证明其抑制作用。随后,将PRRSV全基因组分段克隆到荧光素酶报告载体中,构建一系列质粒,与miR-130共转染BHK-21细胞,并利用荧光素酶报告试验分析miR-130作用的靶点,进一步证明其发挥作用的机制。结果预测结果显示PRRSV vJX143基因组5'末端第155-162位核苷酸与miR-130种子区以7mer-m8的结合方式完全互补配对。经序列比对分析,其保守性在21株具有代表性的北美型毒株中达100%,而在3株欧洲型毒株中却并不存在。转染miR-130家族,尤其是miR-130b可以显著抑制PRRSV在MARC-145细胞和PAM细胞上的复制,且该作用表现在多株北美型病毒,而对欧洲株无效。在一定范围内,抑制作用的强弱与miR-130b转染剂量呈正相关。荧光素酶报告试验证明,miR-130b仅可以显著降低pGL3-5UTR荧光素酶的活性。同时,miR-130b不激活PAM细胞中IFN-α和TNF-α中的表达,验证miR-130的抗PRRSV作用是直接靶向PRRSV基因组RNA特异性的结合位点,而非通过上调IFN-α和TNF-α间接实现的。结论综上所述,本研究为宿主细胞miRNA与PRRSV复制相互作用提供了试验数据,证实miR-130家族尤其是miR-130b的抗PRRSV作用及其机制,为未来临床利用miRNA抗病毒提供了可行的试验思路和基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 PAM microRNA130 PRRSV miRNA

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牛副流感病毒3型P蛋白磷酸化位点与功能性结构域预测分析

牛副流感病毒3型P蛋白磷酸化位点与功能性结构域预测分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：赵贵民王洪梅何洪彬山东省农业科学院奶牛研究中心

引言牛副流感病毒3型(BPIV3)是引起牛等多种动物急性呼吸道疾病的主要病原。感染BPIV3后可导致机体免疫机能和巨噬细胞功能低下,进而继发细菌或支原体感染,引起严重的肺炎,导致牛呼吸道疾病综合征(BRDC),使死亡率大大增加,严重制约我国... 详细信息

引言牛副流感病毒3型(BPIV3)是引起牛等多种动物急性呼吸道疾病的主要病原。感染BPIV3后可导致机体免疫机能和巨噬细胞功能低下,进而继发细菌或支原体感染,引起严重的肺炎,导致牛呼吸道疾病综合征(BRDC),使死亡率大大增加,严重制约我国乃至世界养牛业的健康发展。副黏病毒P蛋白中因丝氨酸和苏氯酸含量较高,常作为磷酸化位点被病毒感染的宿主细胞内蛋白激酶激活而发生磷酸化,其磷酸化对病毒转录与复制的调控作用是目前研究的热点。解析BPIV3 P蛋白磷酸化作用,可以更好地为抗病毒药物的研制提供策略。材料与方法 BPIV3分离株SD2014为本单位疾病研究室分离保存。利用生物信息学的方法首先比较了副黏病毒不同种属病毒P蛋白氨基酸序列的同源性,然后比对了23株副流感病毒3型的P蛋白序列,预测分析了BPIV3 SD2014毒株保守的磷酸化位点与功能性结构域的对应关系。结果与讨论对副黏病毒P蛋白序列进行同源性比对,发现P蛋白氨基酸从241-709不等,同一属的不同病毒氨基酸数目基本相同,但是呼吸道病毒属的副流感病毒1型P蛋白编码385aa,而3型则编码600aa,相差较大。通过分析发现BPIV3 SD2014毒株P蛋白中可能存在22个潜在的磷酸化位点,按不同蛋白激酶作用类型,将这些磷酸化位点分为PKA、PKB、PKC、cdc2、CKⅠ/CKⅡ、p38MDBK和其他蛋白激酶7个组。将SD2014 BPIV3毒株P蛋白功能结构域进行了预测,4个主要功能结构域PNT、PMD、PCT和PX分别位于1-50 aa、50-271 aa、398-479aa和551-600aa,发现PKC激酶的作用位点贯穿了全部4个功能结构域。本研究发现的磷酸化位点的具体功能还需进一步通过试验验证。副流感病毒的P蛋白对病毒RNA合成是必需的,P蛋白在病毒生长周期内与多种蛋白相互作用。宿主细胞内蛋白激酶对P蛋白的磷酸化作用是P蛋白实现其功能的前提条件,阐明作用于BPIV3 P蛋白的磷酸激酶和其发挥作用的主要磷酸化位点意义重大。结论 PKC激酶的作用位点贯穿于BPIV3 P蛋白的4个功能结构域,特别是在参与P蛋白自身四聚体形成和与L蛋白互作的区域。

关键词：磷酸化位点功能性结构域副黏病毒副流感病毒预测分析

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樱桃谷种鸭鸭1型甲肝病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

樱桃谷种鸭鸭1型甲肝病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：陈红梅陈珍程龙飞傅光华施少华万春和傅秋玲黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心

前言鸭病毒性肝炎主要是由鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus,irus,DHAV）引起的一种急性、高度致死性传染病。DHAV主要从雏鸭中分离,而从种鸭中分离的较为少见。2014年1月,从某樱桃谷种鸭场的465日龄病死樱桃谷种鸭中分离到一株病毒... 详细信息

前言鸭病毒性肝炎主要是由鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus,irus,DHAV）引起的一种急性、高度致死性传染病。DHAV主要从雏鸭中分离,而从种鸭中分离的较为少见。2014年1月,从某樱桃谷种鸭场的465日龄病死樱桃谷种鸭中分离到一株病毒（命名为HeN1403）,经过RT-PCR检测与遗传进化分析,确定该分离毒株为鸭1型甲肝病毒。材料与方法（1）主要试剂（略）。（2）试验胚与试验动物（略）。（3）临床样品的采集、处理和病毒的分离（略）。（4）尿囊液毒的PCR检测（略）。（5）衣壳蛋白基因的克隆与序列分析（略）。（6）雏番鸭人工感染试验（略）。结果与讨论（1）病毒的分离:无菌条件下收集死亡番鸭胚的尿囊液毒（暂定名为HeN1403）。血凝试验结果显示,三代HeN1403株病毒都不凝集鸡的红细胞和鸭（番鸭）的红细胞,可排除有血凝活性的病毒。（2）分离毒株的PCR鉴定:PCR检测结果显示,扩增到鸭甲肝病毒约200bp的片段,即为DHAV阳性,其余病毒检测为阴性。将测序结果至Genbank中比对后,得出该序列与DHAV-1的同源性最高。（3）衣壳蛋白基因的序列测定与分析:通过衣壳蛋白基因特异性引物扩增得到700 bp左右的条带,测序结果得知,HeN1403株衣壳蛋白基因序列为714 bp,编码238个氨基酸。使用Lasergene V 7.1 DNAStar软件对HeN1403株病毒VP1基因序列与GenBank上发表的12株不同基因型DHAV的VP1基因序列进行核苷酸序列的同源性比对。结果表明,HeN1403株病毒的VP1基因核苷酸序列与DHAV-1的同源型很高,为90.7%7.2%,而与DHAV-2和DHAV-3的同源性很低,仅为64.9%6.5%;从遗传进化图上可清楚地看到两大分支,其中DHAV-1毒株形成一大分支,DHAV-2与DHAV-3各自独立联合形成另一支,显然地,HeN1403株病毒与DHAV-1的遗传关系很近,而与DHAV-2与DHAV-3遗传关系较远,由此可进一步推断出:所分离的HeN1403株为DHAV-1。（4）雏番鸭人工感染试验结果:经过两周的观察,试验组共死亡5只番鸭,死亡率为33.3%,而对照组雏番鸭均健康。采集病死鸭的肝脏,接种10日龄番鸭胚,回收到病毒,经鸭1型甲肝病毒特异性引物扩增能检测到目的条带。可见HeN1403分离分离株为鸭1型甲肝病毒。讨论众所周知,鸭1型甲肝病毒主要侵害3周龄以内的雏鸭,尤其是一周龄内的雏鸭,成年鸭可感染但不发病。2014年1月,从某樱桃谷鸭场的病死樱桃谷种鸭中分离得到1株病毒,经过RT-PCR检测方法鉴定为鸭1型甲肝病毒。通过动物的回归试验,雏番鸭的死亡率为33.3%并能重新从死亡的雏鸭肝脏分离到该病毒,动物试验表明分离株对雏番鸭具有一定的致病性。鸭甲肝病毒有三种功能性结构蛋白,分别是VP0、VP1和VP3,其中VP1蛋白位于病毒衣壳表面,编码主要的抗原位点,是个高度可变的区域,因此扩增与分析VP1基因对于DHAV的遗传变异研究提供了理论基础。经过对HeN1403株的VP1基因序列与GenBank上发表的12株不同基因型DHAV的VP1基因序列进行核苷酸序列的同源性比对,结果表明,HeN1403株病毒的VP1基因核苷酸序列与DHAV-1的同源型最高,由此可证明HeN1403分离株属于鸭1型甲肝病毒。

关键词：樱桃谷种鸭核苷酸序列人工感染试验雏番鸭 VP1 同源性比对甲肝病毒序列分析分离鉴定

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17株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传分析

17株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：黄欣梅李银刘宇卓赵冬敏杨婧韩凯凯江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言禽流感（Avian Influenza,AI）是由正黏病毒科,流感病毒属的A型流感病毒引起的以禽类呼吸系统和全身败血为特征的禽类传染病。H9N2亚型禽流感病毒（AIV）虽然属于低致病性AIV,但是因为分布广泛,能造成宿主的免疫抑制,并能引起人类感... 详细信息

引言禽流感（Avian Influenza,AI）是由正黏病毒科,流感病毒属的A型流感病毒引起的以禽类呼吸系统和全身败血为特征的禽类传染病。H9N2亚型禽流感病毒（AIV）虽然属于低致病性AIV,但是因为分布广泛,能造成宿主的免疫抑制,并能引起人类感染,其危害性不容忽视。血凝素（hemagglutinin,HA）是流感病毒表面主要的囊膜糖蛋白,变异频率高,同时也是AIV抗原性、致病性的主要决定因素。本研究对江苏、安徽、浙江等地2008～2013年分离的17株H9N2亚型AIV的HA基因进行了遗传分析,从而了解各毒株间的遗传差异和变异规律,为H9N2亚型禽流感的防控提供参考依据。材料与方法（1）病毒:17株H9N2亚型AIV毒株均由本实验室于2008年至2013年间从江苏、安徽、浙江等地的家禽中分离,经鉴定为H9N2亚型。（2）引物:参考H9亚型AIV HA基因序列,设计流感病毒通用反转录引物Uni12和一对用以扩增HA全基因序列的特异性引物。（3）HA基因RT-PCR扩增及测定:按照体液病毒RNA抽提试剂盒说明书,从含病毒尿囊液中提取病毒RNA,以Unil2为反转录引物进行反转录获得cDNA,然后以此cDNA为模板进行PCR扩增。将获取的HA基因与pMD18-T载体连接并转入DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆菌送南京金斯瑞公司测序。（4）HA基因序列比较分析:应用DNAStar软件对获得的HA基因核苷酸和推导的氨基酸序列进行同源性比对,并对HA裂解位点,受体结合位点以及潜在的糖基化位点进行分析。用MEGA5.05软件进行序列比对,绘制遗传进化树。结果与讨论（1）HA基因系统进化分析:测序结果表明,17株H9N2亚型AIV的HA基因序列均长1742 bp,编码560个氨基酸。HA基因核苷酸序列同源性为84.6%9.3%,推导的氨基酸同源性为86.0%9.5%。17株分离毒株均属于欧亚分支,其中2株鸭源毒株属于G1-like亚系,其余15株鸡源病毒属于Y280-like亚系。G1-like亚系的毒株被认为可能对哺乳动物具有潜在致病性。此次从鸭体内分离到该亚系毒株,说明G1-like亚系毒株已在水禽中流行,鉴于该亚系病毒的公共卫生意义,应加强对该类病毒的监测。（2）HA蛋白氨基酸序列分析:本研究毒株中的HA裂解位点处氨基酸残基均为非连续碱性氨基酸,符合低致病性AIV的特征。对17株病毒的受体结合位点及其左右侧缘序列进行分析,发现198位氨基酸存在较大差异,受体结合部的右侧缘序列较为保守。有1株鸡源病毒和2株鸭源病毒在234位为Q,其余14株病毒均为L,表现出人流感病毒受体结合特性。在本研究中,HA蛋白的糖基化位点具有较明显的差异,7株病毒有7个糖基化位点,10株病毒有8个糖基化位点。结论本研究证实了H9N2亚型AIV在江苏、安徽、浙江等地区家禽中持续流行感染,鸭源病毒与鸡源病毒存在较大差异。本地区鸡群中的H9N2亚型AIV随着时间推移,其遗传关系与疫苗株愈来愈远,在今后的防控工作中应考虑现行流行毒株与疫苗株之间的基因差异。

关键词：禽流感病毒糖基化位点 AIV

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猪IFN-γ、IL-2及GM-CSF对猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白亚单位疫苗的免疫增强作用

猪IFN-γ、IL-2及GM-CSF对猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白亚单位疫苗...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王一平刘丹郭龙军危艳武吴洪丽刘建波李胜斌黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

引言猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,该病原现已在世界各地广泛流行,给养猪业造成巨大经济损失。PCV2 Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能诱导产生PCV2特异性中和抗体和保护性免疫力,是研制PCV2... 详细信息

引言猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,该病原现已在世界各地广泛流行,给养猪业造成巨大经济损失。PCV2 Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能诱导产生PCV2特异性中和抗体和保护性免疫力,是研制PCV2基因工程疫苗的理想靶抗原。研究表明,IFN-γ、IL-2和GM-CSF等细胞因子佐剂对疫苗具有免疫增强作用,可显著增强疫苗的免疫保护效力。本研究采用细胞因子佐剂与PCV2-Cap蛋白组合的策略来研制预防PCV2感染的新型基因工程亚单位疫苗,目的是验证猪源IFN-γ(PoIFN-γ)、IL-2(PoIL-2)和GM-CSF(PoGM-CSF)这3种细胞因子能否增强PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫效力。方法采用杆状病毒表达系统表达PCV2-Cap蛋白、PoIFN-γPoIL-2、PoGM-CSF及这3种细胞因子与PCV2-Cap蛋白的融合蛋白Cap-PoIFN-γ、Cap-PoIL-2和Cap-PoGM-CSF,制备几种不同形式的PCV2亚单位疫苗,并经鼠体模型鉴定其免疫原性;采用IPMA和阻断ELISA方法测定免疫及攻毒后PCV2特异性抗体滴度,通过监测淋巴细胞增殖反应和细胞因子分泌水平评价细胞免疫应答;采用常规PCR检测PCV2病毒血症,并经定量PCR检测攻毒后鼠肺脏中PCV2病毒载量。结果采用杆状病毒表达系统成功地表达了PCV2-Cap蛋白、PoIFN--γ及Cap-PoIFN-γ融合蛋白,制备了3种PCV2亚单位疫苗:Cap-poIFN-γ疫苗、PCV2-Cap+PoIFN-γ疫苗及PCV2-Cap疫苗,并经鼠体试验证实,PCV2-Cap+PoIFN-γ疫苗能诱导产生更高水平的PCV2特异性IPMA抗体和中和抗体滴度,明显提高T淋巴细胞的增殖能力,并显著降低攻毒后鼠肺脏中PCV2病毒核酸载量。以杆状病毒表达系统成功地表达了PoIL-2、PoGM-CSF、Cap-PoIL-2融合蛋白及Cap-PoGM-CSF融合蛋白,制备了5种PCV2亚单位疫苗:Cap-PoIL-2疫苗、PCV2-Cap+PoIL-2疫苗、Cap-PoGM-CSF疫苗、PCV2-Cap+PoGM-CSF疫苗及PCV2-Cap疫苗,并经鼠体试验证实,PCV2-Cap+PoIL-2疫苗、Cap-PoGM-CSF疫苗和PCV2-Cap+PoGM-CSF疫苗均可明显提高T淋巴细胞的增殖能力,刺激淋巴细胞分泌更高水平的IFN-γ和IL-2,并显著降低攻毒后鼠肺脏中PCV2病毒核酸载量。结论研究表明,用PoIFN-γ与PCV2-Cap蛋白混合免疫时,PoIFN-γ能显著增强PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫保护效力,但以Cap-PoIFN-γ融合蛋白免疫时,PoIFN-γ对PCV2-Cap蛋白无免疫增强作用;用PoIL-2或PoGM-CSF与PCV2-Cap蛋白混合免疫或以Cap-PoGM-CSF融合蛋白免疫时,PoIL-2和PoGM-CSF对PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的抗体应答均无增强作用,但可促进免疫应答向Th1型免疫应答转变,从而增强疫苗的免疫保护效力,然而以Cap-PoIL-2融合蛋白免疫时,PoIL-2对PCV2-Cap蛋白无免疫增强作用。

关键词： CSF 亚单位疫苗 PCV2)Cap 猪圆环病毒免疫增强作用 IFN GM-CSF

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伪狂犬病病毒(PRV)UL42蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

伪狂犬病病毒(PRV)UL42蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：杜文娟王一平黄立平危艳武陈冬杰孙建慧吴洪丽冯力刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

引言伪狂犬病病毒（PRV）是引起伪狂犬病的主要病原。伪狂犬病广泛存在于世界范围内的猪场中,给养猪业造成巨大的经济损失,不同年龄段的感染猪临床症状不同。PRV UL42蛋白,又被称为DNA的辅助性亚基,由PRV的UL42基因编码,在RRV的复制过... 详细信息

引言伪狂犬病病毒（PRV）是引起伪狂犬病的主要病原。伪狂犬病广泛存在于世界范围内的猪场中,给养猪业造成巨大的经济损失,不同年龄段的感染猪临床症状不同。PRV UL42蛋白,又被称为DNA的辅助性亚基,由PRV的UL42基因编码,在RRV的复制过程中发挥重要的作用。关于UL42蛋白的体外作用,在1995年已经有所报道。而到目前为止,关于PRV UL42蛋白的B细胞的抗原表位仍未见有报道。在本研究中,我们制备了6株针对PRV UL42蛋白的单抗,利用这些单抗,希望能对UL42蛋白在PRV复制过程中的亚细胞定位进行描述并能从感染PRV的PK-15细胞中将UL42蛋白沉淀出来以方便研究与UL42相互作用的蛋白。从而达到利于UL42功能研究的目的。方法利用原核表达系统表达了UL42蛋白,将其免疫6周龄的BALB/c小鼠,经过细胞融合和亚克隆,成功的筛选到6株能够稳定分泌UL42抗体的杂交瘤细胞。利用这些单抗,通过Western Blotting和间接ELISA方法,鉴定出了三个不同的抗原表位。利用DNA star软件对所鉴定的三个不同的抗原表位的保守性和特异性进行分析。通过间接免疫荧光方法对UL42蛋白的亚细胞定位进行描述,利用免疫共沉淀将UL42蛋白从感染PRV的PK-15细胞中沉淀出来,利用IPMA建立了一种新的测定PRV梯度的方法。结果 SDS-PAGE和Western Blotting结果表明UL42蛋白获得了正确表达。将切胶纯化的蛋白免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,成功筛选到6株UL42的单抗。通过Western Blotting和间接ELISA方法,鉴定出了UL42蛋白的三个不同的线性抗原表位,其中SGGVLDALK位于UL42的N端,KRPAAPR和RMYTPIAAK位于UL42的C端。序列比对发现,三个抗原表位在不同的PRV毒株间具有很高的保守性,而在疱疹病毒属的其它成员所对应的部分中有较高的特异性。间接免疫荧光表明UL42蛋白在PRV的复制中定位于细胞核中。免疫共沉淀表明这些单抗能够将UL42从感染PRV的PK-15细胞中沉淀出来。所建立的检测PRV梯度的IPMA方法比传统的只观察细胞病变的方法有更高的敏感性且更容易观察。结论所鉴定的三个不同的抗原表位中,其中一个位于UL42蛋白的N端,另两个位于UL42蛋白的C端,这种现象和同属于疱疹病毒属的人的单纯疱疹病毒1型的UL42蛋白的抗原表位相似。而序列比对发现这些抗原表位在不同的PRV毒株间保守性很高,这将有利于建立以抗原表位为基础的PRV的诊断方法。这些单抗能够被应用于UL42蛋白功能的研究中,比如对UL42蛋白的核定位,发现UL42定位于细胞核中,这从侧面反映了UL42蛋白作为DNA聚合酶的辅助因子的作用。此外我们还可以利用这些单抗将UL42蛋白从感染了PRV的细胞中沉淀出来,这对于研究与UL42蛋白相互作用的蛋白打下了基础。所建立的用于测定PRV病毒梯度的IPMA方法比传统的只看细胞病变的方法具有更高的敏感性和较易观察。这些单抗在PRV UL42蛋白的功能研究中将会是非常有用的工具。

关键词： PRV)UL42 保守性抗原表位伪狂犬病病毒单克隆抗体制备

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