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1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫高效IBD灭活联苗效果观察

1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫高效IBD灭活联苗效果观察

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王泽霖万博黄坤杨新潮刘玉云郦晓琼张渊魁詹先强河南农业大学禽病研究所乾元浩生物股份有限公司南京厂福州大北农生物技术有限公司

引言鸡染性法氏囊病(IBD)是雏鸡的一种急性、接触性传染病。防控该病通常采用灭活疫苗(种鸡被动免疫)和活毒疫苗。雏鸡免疫活毒苗,常受母源抗体干扰导致免疫失败,或因毒力过强造成免疫抑制。近年来河南农业大学禽病研究所对IBD病毒液培... 详细信息

引言鸡染性法氏囊病(IBD)是雏鸡的一种急性、接触性传染病。防控该病通常采用灭活疫苗(种鸡被动免疫)和活毒疫苗。雏鸡免疫活毒苗,常受母源抗体干扰导致免疫失败,或因毒力过强造成免疫抑制。近年来河南农业大学禽病研究所对IBD病毒液培养工艺进行了大量研究,改用传代细胞和生物反应器培养病毒(均已获发明专利),使灭活疫苗中抗原含量大大提高。本研究探讨1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫高效新支法三联灭活苗后3～4周IBD的抗体水平和攻毒保护,旨在为高效IBD灭活联苗的推广应用提供科学依据。材料与方法试验用疫苗:高效新-支-法三联灭活苗2014001批、2014002批、2014003批是中试产品,由乾元浩生物有限公司南京生物药厂提供。2周龄内雏鸡每只注射0.2ml。试验用鸡:1日龄SPF鸡180只,分为3大组,每大组60只再分成4小组;1日龄带有母源抗体的商品肉鸡180只,也分为3大组,每大组60只再分4小组。上述鸡均在隔离器中喂养,分别于1、5、10日龄免疫,1、2、3小组免疫3批三联苗,第4组做对照。抗体测定:定期采血测定抗体,IBD微量中和试验按常规方法进行。攻毒试验:于免疫后25天进行攻毒。攻毒时免疫组各取10只,连同对照鸡10只,经口接种IBDV BC6-85株强毒,每只0.2ml(含2×104BID50),72小时后剖杀,检查法氏囊病变,判定各组保护率。结果与讨论1、5、10日龄SPF鸡免疫3批三联苗后25天,中和抗体分别为13.6、13.9、13.2(1og2),13.9、14.6、14.2(log2),13.7、14.9、14.2(1og2),攻毒保护均为10/10,而对照鸡抗体≤3(1og2),攻毒保护0/10;1、5、10日龄商品肉鸡免疫3批联苗后25日天的抗体分别为12.3、12.9、12.5(1og2),13.1、14.0、13.8(log2),14.2、14.7、14.0(log2),攻毒保护为9/10～10/10,对照鸡抗体为8.3～6.0(log2),攻毒保护为3/10～1/10。可见SPF鸡和有母源抗体的商品肉鸡,均可在免疫后25天产生主动免疫,有效地抵抗IBD野毒。以往试验已表明用高效IBD灭活联苗免疫种鸡后可在4个月内保护子代3周龄前不感染IBD,本试验证实用三联苗主动免疫SPF雏鸡后,抗体持续上升,而免疫有母源抗体的商品肉鸡,抗体先下降而后上升,表明灭活苗免疫也受母源抗体影响,但采用新工艺制备的IBD灭活苗,因抗原含量大大提高,可迅速突破免疫空白期,在免后3～4周产生免疫保护。在当前环境污染严重,种鸡频繁免疫、母源抗体很高的背境下,通过浓缩、纯化、反应器培养等各种方法,加大灭活疫苗中的抗原含量,尽快建立主动免疫反应是控制和消灭IBD和其它疫病的重要措施。结论 1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡主动免疫高效IBD灭活联苗3～4周后可产生有效的免疫保护,较活毒苗产生抗体早、抗体水平高、维持时间长,且不会造成法氏囊损伤、免疫抑制和排毒。因此推广该苗有很大的实用价值,有望可控制和消灭鸡传染性法氏囊病。

关键词：商品肉鸡母源抗体 SPF IBD 效果观察

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猪戊型肝炎病毒抗体检测阻断ELISA方法的建立

猪戊型肝炎病毒抗体检测阻断ELISA方法的建立

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：陈宜阳赵钦刘宝元孙亚妮李慧霞王鑫杰周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是一种由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的人急性病毒性肝炎。近年来,该病已成为许多发展中国家严重的公共健康问题,而我国是HEV感染的主要流行区之一。HEV感染大多数以自限性和低致死率为特点,但已... 详细信息

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是一种由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的人急性病毒性肝炎。近年来,该病已成为许多发展中国家严重的公共健康问题,而我国是HEV感染的主要流行区之一。HEV感染大多数以自限性和低致死率为特点,但已有研究发现包括孕妇在内以及一些具有免疫损伤的患者(HIV和器官移植者等)都存在HEV感染高致死性或转为慢性肝炎的风险。猪HEV是第一个动物HEV分离株,虽然其感染仅引起猪的亚临床感染,但是由于其人畜共感染性,正在被引起越来越多的重视。目前普遍认为,猪是HEV主要的自然储存宿主。因此,时刻监测猪HEV在猪群中的感染情况,为防控人HEV的感染具有重要的意义。然而,目前对猪群中猪HEV抗体的检测主要是利用商品化人HEV抗体检测ELISA试剂盒,并没有针对特异性猪HEV抗体检测试剂盒。此外,比较不同的商品化人HEV抗体ELISA试剂盒检测猪血清发现,其相互之间重合率低,特异性较差,往往造成许多假阳性和假阴性的结果。因此,为了能够准确、快速了解猪HEV在猪群中的感染情况,本实验建立了一种猪血清中猪HEV抗体检测的阻断ELISA方法,从而为猪HEV跨种系感染的防控提供方法支撑。本实验以原核表达制备的基因Ⅳ型猪HEV(CHN-SD-sHEV)的ORF2蛋白C端268个氨基酸(sORF2-C)为包被抗原,以HRP标记的针对上述蛋白的单克隆抗体1E4为阻断抗体,通过优化抗原和单抗浓度、血清最佳稀释比例等条件,确定了阻断ELISA的操作程序;同时利用已知的230份猪HEV阴性血清,确定了该方法的Cut-off值(Cut-off值=230份样品PI的平均值+2或3倍的标准差);最后,对建立的阻断ELISA方法进行了敏感性,特异性和重复性的评价,同时将该方法与Western blot和商品化人HEV抗体ELISA试剂盒的检测一致性进行了分析。结果发现,当抗原浓度为8μg/mL(100μL/孔)、HRP-1E4稀释比例为1:1000(6μg/孔),血清稀释度为1:20时为阻断ELISA方法的最佳反应条件;阴性血清检测确定的Cut-off值为16.9%;利用建立的方法对6份阳性血清进行板内及板间重复性试验,其变异系数分别为4.3%和7.9%,表明该方法具有良好的重复性;应用该方法对50份阳性血清进行敏感性试验,其敏感性为96%,对50份阴性血清进行特异性试验,其特异性为100%,表明该方法具有。较高的敏感性和特异性;通过交叉反应试验揭示,本方法不与PCV,PPV和PRRSV的阳性血清发生交叉反应;同时通过对150份临床猪血清用Western blot和商品化ELISA试剂盒检测发现,该方法与二者的一致性分别为92%和95%,33份bEIISA检测为阳性的血清中,Western Blot与ELISA试剂盒检测为阳性的个数均为33份,117份bELISA检测为阴性的血清中,Western Blot与ELISA试剂盒检测同为阴性的个数分别为105和110份。综上所述,本实验建立了一种快速、准确的猪HEV抗体检测的阻断ELISA方法,该方法的建立为猪群中猪HEV感染的流行病学调查提供了一种方法支撑。

关键词： ELISA 抗体检测猪戊型肝炎病毒阳性血清 HEV

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上海地区规模化猪场中多种病毒和细菌感染状况的调查研究

上海地区规模化猪场中多种病毒和细菌感染状况的调查研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：石坤魏建超黎倩倩吴亚玲李伦峰邵东华邱亚峰马志永中国农业科学院上海兽医研究所

前言由于当前猪场存在多种病毒和细菌感染的情况,给养猪产业带来巨大经济损失。为了了解目前上海地区猪场疫病混合感染情况,我们从2014年6月到2015年1月期间,分别从上海浦东、闵行、嘉定、奉贤的所有规模化中对有呼吸症状的临床发病猪... 详细信息

前言由于当前猪场存在多种病毒和细菌感染的情况,给养猪产业带来巨大经济损失。为了了解目前上海地区猪场疫病混合感染情况,我们从2014年6月到2015年1月期间,分别从上海浦东、闵行、嘉定、奉贤的所有规模化中对有呼吸症状的临床发病猪进行采样。通过PCR方法检测手段,分别对圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)进行检测,同时进行细菌分离。材料与方法(1)病料处理:分别取有呼吸症状的发病猪的心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结以及肺门淋巴结,进行研磨破碎组织,反复冻融3次后贮存于-70℃。(2)引物设计:参考GenBank中已发表的基因序列,分别设计PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、PPV,这5种待检病毒的特异性引物。PCV2的特异性引物,扩增片段为1154bp;PRRSV的特异性引物扩增片段为677bp;CSFV的特异性引物扩增片段为800bp;PRV的特异性引物扩增片段为348bp;PPV的特异性引物扩增片段为472bp。引物均由上海桑尼有限公司合成。(3)病毒DNA/RNA提取:依据TaKaRa DNA MiniBEST viral RNA/DNA extraction Kit的操作说明从反复冻融3次的病料中提取病毒的DNA和RNA混合物,最后保存于-70℃。(4)RNA反转录:取1μg病毒的DNA和RNA混合物为模板,依次加入1μL 100pmol/μL 6 bp随机引物、0.5μL Oligo dT寡聚核苷酸、4μL 2.5 mmol/L dNTPs、4μL 5×First buffer、2μL 0.1mol/L DTT、1μL RNA酶抑制剂、1μLM-MLV,加DEPC水至20μL。离心后反应程序按照25℃10 min、37℃60 min、75℃15min、4℃10min进行反应。(5)PCR反应:取2μL病毒DNA和RNA的混合物为模板,分别用PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、PPV,这5种待检病毒的特异性引物进行PCR扩增,反应体系为引物各0.5μL,10×buffer 5μL,10 mmol/L dNTP 1μL,Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),加超纯水至总体积50μL。反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度依次为58℃/55℃/55℃/57℃/48℃,退火40s,72℃延伸60 s,35个循环;然后72℃再延伸7min,10℃保存。取5μLPCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。结果与讨论本次实验结果显示没有阴组织性样品,但是没有检测到CSFV、PRV。PCV2感染阳性率为64%,PPV感染阳性率为76%,PRRSV阳性率为48%,并发现所有感染PCV2的组织同时也感染PPV,感染PRRSV的组织同时感染PCV2和PPV。同时对这些收集到的病料中通过细菌分离发现化脓链球菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等细菌与这些病毒共存。通过此次实验结果发现当前猪场多种病毒共感染情况严重,同时存在病毒与细菌共感染的状况。我们这次实验选取的猪均有呼吸症状推测可能感染了能引起此症状的病毒和细菌,结果也证明了这一点。PCV2和PRRSV均能引起猪的呼吸系统疾病,副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等细菌会加重肺炎的症状。PCV2是一种猪场常在病毒,虽然上海地区的猪场均有使用PCV2的疫苗,但是PCV2的基因型变异快,不能得到有效的保护,并且PCV2具有免疫抑制,为其他病毒和细菌的入侵提供了便利条件。结论本次调查研究发现上海地区规模化猪场中存在PCV2、PPV和PRRSV共感染现象同时继发了多种细菌感染。

关键词： PRRSV PPV PCV 细菌分离副猪嗜血杆菌 PRV 细菌感染

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猪繁殖与呼吸综合征病毒重组猪瘟C株E2蛋白全长感染性克隆的构建及初步应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组猪瘟C株E2蛋白全长感染性克隆的构建...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：高飞曲泽慧姜一峰李丽薇虞凌雪周艳君童武李国新童光志中国农业科学院上海兽医研究所

介绍猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是一种重要的猪传染病病原,像其他套式病毒目成员一样,PRRSV也采用非连续性转录(discontinuous transcription)的方式转录出一系列具有5′和3′共末端的亚基因组mRNA(sg mRNA)用以翻译结构蛋白。在此过程中发挥重要调控作用的顺式作用元件(cis-acting element)是病毒的转录调控序列(Transcription Regulatory Sequence,TRS)。通过位于5′UTR中的Leader TRS和下游基因编码区中的Body TRS的互补配对,发挥其调控作用。目前,基于反向遗传操作技术,PRRSV基因组被用作外源基因表达的载体。单纯融合外源基因构建的重组病毒通常并不具备遗传稳定性,在连续的细胞传代过程中会丢失一部分外源基因的编码序列或者发生碱基突变。但是如果将外源基因置于TRS cassette控制下,使其作为一个新的亚基因组进行转录及之后的表达,以此种方法构建的突变病毒则具有遗传稳定性。另外,插入位点的选择至关重要。在2型PRRSV基因组中,ORF1b/ORF2,ORF4/ORF5这两个位点的相邻基因编码区是有间隔的,没有基因重叠区(overlapping)成为外源基因插入的较好选择。像PRRS一样,猪瘟(Classical swine fever,CSF)也是临床上严重威胁养猪业的一种严重的接触性传染病,造成的经济损失巨大。其病原CSFV的囊膜糖蛋白E2(gp55)是一种重要的保护性抗原,具有高度的免疫原性,可以诱导机体产生高水平的中和抗体。临床上,PRRSV和CSFV两种疫苗均被用于猪场中,但是由于二者免疫的相互干扰,很难获得较好的免疫反应。因此,通过反向遗传操作技术,研发一种新型基因工程重组疫苗能够同时对两种病原的产生免疫反应变得至关重要。基于以上的研究背景,本研究在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞致弱疫苗株HuN4-F112的全长感染性克隆骨架上,插入CSFV疫苗株C株的E2基因,获得能够稳定表达猪瘟C株E2蛋白的重组PRRS病毒,对其进行一系列病毒特性分析及遗传稳定性检测;并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分析,初步评估其作为疫苗候选株的可行性。材料与方法在HuN4-F112的感染性克隆基础上,通过SOE PCR的方法,在其基因组ORF1b和ORF2之间插入猪瘟C株E2蛋白,并在外源基因3′端下游插入PRRSV的转录调控序列6(TRS6),构建了嵌合突变克隆pA-C-E2,通过MARC-145细胞转染并传代,观察病毒拯救情况以判断突变体的感染性。并用IFA对PRRSVN蛋白和CSFV的E2蛋白的表达水平进行检测。接着通过病毒多步生长曲线的描绘和空斑形态学分析在病毒特性方面对突变病毒和亲本病毒进行比较分析。并对其遗传稳定性进行分析与评估。结果成功构建重组CSFV的E2蛋白的突变全长克隆pA-C-E2,并可以拯救出活病毒vA-C-E2。接着对重组突变病毒vA-C-E2进行遗传稳定性的研究,证明其至少可以在20代的传代过程中保持遗传稳定。免疫荧光(IFA)结果显示,重组病毒不仅能够表达PRRS病毒N蛋白,也可以表达相似水平的猪瘟病毒E2蛋白。接着,对该病毒在病毒学水平进行评估,发现此突变病毒与亲本病毒vHuN4-F112在病毒滴度、空斑形态、蛋白表达等方面差异不显著;多步生长曲线的结果显示重组病毒与亲本毒在病毒peak titer和病毒增殖趋势上相似,无明显差异。结论本研究中构建的重组病毒vA-C-E2为PRRSV研究提供了重要工具,突变病毒并未因为插入外源基因而产生差异,并可以同时表达PRRSV的N蛋白以及CSFV的E2蛋白。初步表明表达猪瘟C株E2蛋白的重组病毒可以作为一种能够同时为PRRSV和CSFV感染提供保护的疫苗候选株,为今后多价疫苗的研发提供了研究基础。

关键词：感染性克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒重组病毒 PRRSV 初步应用

来源：评论

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一株鸭源巴泰病毒的分离鉴定

一株鸭源巴泰病毒的分离鉴定

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：章丽娇张清水傅光华王俊胡薛英黄瑜何伟勇苏敬良中国农业大学动物医学院福建省农业科学院畜牧兽医研究所华中农业大学动物医学院

引言巴泰病毒属于布尼亚病毒科布尼亚病毒属,于1955年首次从马来西亚的库蚊中分离得到。该病毒广泛分布于亚洲与欧洲,主要经库蚊与按蚊传播,许多脊椎动物、啮齿类动物以及鸟类可为其寄生宿主。该病毒主要感染哺乳动物与人类,可引起发热... 详细信息

引言巴泰病毒属于布尼亚病毒科布尼亚病毒属,于1955年首次从马来西亚的库蚊中分离得到。该病毒广泛分布于亚洲与欧洲,主要经库蚊与按蚊传播,许多脊椎动物、啮齿类动物以及鸟类可为其寄生宿主。该病毒主要感染哺乳动物与人类,可引起发热、病毒性脑炎甚至死亡。我国于1998年首次从云南按蚊中分离到1株巴泰病毒。Liu等报道于2012年从内蒙古牛体内分离到另1株巴泰病毒。2014年4月,我们从浙江某鸭场送检的成年番鸭中分离得到1株巴泰病毒,并对病毒的生物学特性与基因组结构进行了鉴定。材料与方法采集组织样本排除细菌感染后,将感染鸭肝脏、脾脏及脑组织研磨制成20%悬液,过滤除菌后接种9日龄鸭胚,收集感染胚尿囊液接种鸭胚成纤维细胞、BHK-21与Vero细胞观察记录细胞病变。对分离的病毒采用透射电镜观察以及PCR检测等方法进行鉴定。确定为巴泰病毒后,根据文献报道的3株巴泰病毒全基因组序列设计引物,同时采取5'与3'race技术扩增出该病毒的全长序列,利用DNASTAR、MEGA5等生物学软件进行核苷酸与氨基酸序列的比对及进化树分析。结果与讨论病料接种后并未致死鸭胚,收集的尿囊液接种BHK-21与Vero细胞后均于24h左右开始出现相似的细胞病变,感染细胞固缩变圆并逐渐脱落;但接种C6/36细胞后约36h才开始出现病变。而接种鸭胚成纤维细胞病变则比较轻微,感染细胞不出现明显的脱落。细胞培养繁殖动态试验结果表明病毒感染上述四种细胞系后均于24-36h达到繁殖最高峰,其在BHK-21与Vero细胞上的滴度最高,可达107pfu/mL,C6/36细胞次之,鸭胚成纤维细胞最低。感染后48h的细胞超薄切片于透射电镜下观察,于胞浆内可见60-70nm直径的有囊膜病毒粒子。全基因组序列分析表明该分离株基因组全长12253个核苷酸,由S、M、L三个片段组成。S片段长946nt,5'非编码区长176nt(病毒RNA方向),编码区含两个可读框,分别编码含233个氨基酸的核衣壳蛋白N与101个氨基酸的非结构蛋白NS,3'非编码区长68nt。M片段长4437nt,5'和3'非编码区长分别为91nt和41 nt,可读框编码1434个氨基酸的多聚前体蛋白。L片段长6870nt,5'和3'非编码区长分别为108nt和48nt,可读框编码含2237个氨基酸的RNA聚合酶。在S、M和L片段5'端与3'端各存在15～17nt的保守序列,并呈反向互补,有助于病毒的三个片段各自形成环状结构。核苷酸序列系统进化树分析结果表明,该分离株的S片段和L片段均与中国内蒙NM/12株亲缘关系最近,分离株的M片段与Chittoor/IG-20217株(印度,1957)和巴泰病毒原型株MM2222(马来西亚,1955)属同一进化树分支,但与NM/12株亲缘关系相对略远。氨基酸序列进化树分析结果表明分离株的M段与L段均与NM/12株属于同一进化分支,同时发现在氨基酸水平上亚洲地区的巴泰分离株亲缘关系相对较近。结论本研究首次报道从商品鸭中分离到一株鸭源巴泰病毒,全基因组系列分析表明该毒株与我国内蒙古牛源毒株亲缘关系最近。证明我国西南、西北和华东地区均有巴泰病毒分布,其致病性及流行病学意义有待于进一步研究。

关键词：巴泰病毒内蒙古亲缘关系细胞病变分离鉴定

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Seven major genomic deletions of vaccinia virus Tiantan (VTT) is sufficient to decreased Pathogenicity

Seven major genomic deletions of vaccinia virus Tiantan (VTT...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者： LI Yi-quan LI Xiao JIN Ning-yi College of Animal Science and Technology Jilin Agriculture University Institute of Veterinary Science The Academy of Military Medical Sciences

Objective Attenuated strain TTVAC7 is a multi-gene-deleted vaccinia virus Tiantan strain constructed by knocking out parts of non-essential genes related to the virulence,host range and immunomodulatory of vaccinia virus Tiantan strain（VTT）,and combining the double markers screening and exogenous selectable marker knockout *** In this study,shuttle vector plasmids pTC-EGFP,pTA35-EGFP,pTA66-EGFP,pTE-EGFP,pTB-EGFP,pTI-EGFP and pTJ-EGFP were constructed,which contained seven pairs of recombinant arms,and bound to early and late strong composed promoter pE/L,and to enhanced green fluorescent protein（EGFP） as an exogenous selectable *** cells were co-transfected/infected successively with the above plasmids and VTT or gene-deleted VTT,and homologous recombination and fluorescence plaque screening methods were used to knock out the gene fragments（TC:TC7LK2L;TA35:TA35L;TA66:TA66R;TE:TE3L;TB:TB13RB14R;TI:TI4L;TJ:TJ2R）.Cre / Loxp system was applied to knock out the exogenous selectable marker.A series of in vivo and in vitro experiments were used to detect virulence of *** Ultimately,a gene-deleted attenuated strain TTVAC7 was obtained and A series of in vivo and in vitro experiments demonstrated that not only the host range of TTVAC7 could be narrowed and its toxicity might be weakened significantly,but also its high immunogenicity was maintained at the same *** TTVAC7 shows a more excellent safety and immunogenicity than the wild virus,and a potential to be developed into a new virus vector vaccine for the prevention or treatment of diseases caused by different pathogens.

关键词： Attenuated vaccinia virus vector Virulence Immunogenicity Tian Tan strain

来源：评论

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两株PCV2a-Cap蛋白和两株PCV2b-Cap蛋白免疫保护作用的比较性研究

两株PCV2a-Cap蛋白和两株PCV2b-Cap蛋白免疫保护作用的比较性研究

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：黄立平危艳武王一平刘丹陈冬杰孙建慧杜文娟夏得利吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

引言猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。PCV2 Cap蛋白是主要免疫原性蛋白,是研制PCV2基因工程疫苗的理想靶抗原。PCV2分为多种基因型:包括PCV2a、PCV2b和PCV2c等,其中PCV2b为当前主要流行毒株,然而... 详细信息

引言猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。PCV2 Cap蛋白是主要免疫原性蛋白,是研制PCV2基因工程疫苗的理想靶抗原。PCV2分为多种基因型:包括PCV2a、PCV2b和PCV2c等,其中PCV2b为当前主要流行毒株,然而国际上现有的PCV2疫苗以PCV2a居多,虽然PCV2各基因型之间可以提供交叉保护,但是PCV2基因型之间是否存在免疫原性差异的研究鲜有报道。本研究分别选取两株PCV2a和两株PCV2b毒株,通过免疫攻毒实验综合评价这些蛋白的免疫保护作用。方法采用杆状病毒表达分别系统表达PCV2a/LG-Cap、PCV2a/CL-Cap、PCV2b/JF-Cap和PCV2b/YJ-Cap蛋白,制备四种PCV2亚单位疫苗,并经猪体免疫攻毒实验评价其免疫保护作用,同设商品化PCV2亚单位疫苗和PCV2灭活疫苗对照组、攻毒对照组及健康对照组。采用IPMA方法测定试验猪PCV2特异性抗体;通过常规PCR和定量PCR检测PCV2病毒血症和腹股沟淋巴结中的病毒载量,并采用免疫荧光和HE染色方法检测腹股沟淋巴结中PCV2抗原和微观病理变化。结果成功表达了PCV2a/LG-Cap、PCV2a/CL-Cap、PCV2b/JF-Cap和PCV2b/YJ-Cap蛋白并制备了4种PCV2-Cap亚单位疫苗:PCV2a/LG-Cap疫苗、PCV2a/CL-Cap疫苗、PCV2b/JF-Cap疫苗和PCV2b/YJ-Cap疫苗,同时经猪体试验证实:四种亚单位疫苗均可以诱导猪体产生PCV2特异性抗体,但是PCV2a/LG-Cap疫苗和PCV2a/CL-Cap疫苗免疫猪在二免后两周(攻毒时)PCV2抗体效价均大于1000倍,明显高于PCV2b/JF-Cap疫苗(533倍)和PCV2b/YJ-Cap疫苗免疫组(266倍);攻毒后两组商品化疫苗对照组未检测到病毒血症,PCV2a/LG-Cap疫苗和PCV2a/CL-Cap疫苗免疫组病毒血症检出率明显低于PCV2b/JF-Cap疫苗和PCV2b/YJ-Cap疫苗组,分别为0%、20%、40%和60%;两组PCV2b-Cap蛋白亚单位疫苗免疫组腹股沟淋巴结中PCV2载量明显高于两组PCV2a-Cap蛋白疫苗组和商品化疫苗组,并显著低于攻毒对照组;相同组织的免疫荧光结果显示,PCV2抗原在攻毒对照组中最多,其次是PCV2b/YJ和JF疫苗组,而在两种PCV2a疫苗组和商品化疫苗对照组中未检测到PCV2抗原;腹股沟淋巴结的微观病理学变化显示,攻毒对照组中淋巴细胞严重减少,同时出现多核巨细胞;两种PCV2b疫苗免疫组淋巴细胞有坏死和缺失,而在其他疫苗免疫组未出现这种病理变化。结论本实验所选取的两株PCV2a-Cap蛋白的免疫保护作用优于两种PCV2b-Cap蛋白,由此可以推测临床中流行的PCV2b毒株的免疫原性也许比PCV2a毒株的免疫原性差,而病毒的免疫原性差可能与病毒的致病性紧密相关,正由于一些PCV2b毒株免疫原性差、致病性强,所以导致PCV2b毒株在猪群中循环存在,高于PCV2a检出率。

关键词： PCV2b-Cap 攻毒实验免疫原性疫苗免疫病毒血症免疫保护作用比较性研究

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1日龄商品肉鸡免疫IBD灭活苗与囊胚宝、威力克、亚单位苗效果比较

1日龄商品肉鸡免疫IBD灭活苗与囊胚宝、威力克、亚单位苗效果比较

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：杨保收王寿山王泽霖万博骆志恒天津瑞普生物股份有限公司河南农业大学禽病研究所

引言近年来专用于1日龄雏鸡免疫的进口囊胚宝(2512株抗原抗体复合物苗)、威力克(基因工程表达苗)在国内很多养鸡场使用。以往的研究已证实囊胚宝仍有很强毒性,可在母源抗体消退时迅速造成法氏囊萎缩,且能排毒、污染环境。本研究再次比较... 详细信息

引言近年来专用于1日龄雏鸡免疫的进口囊胚宝(2512株抗原抗体复合物苗)、威力克(基因工程表达苗)在国内很多养鸡场使用。以往的研究已证实囊胚宝仍有很强毒性,可在母源抗体消退时迅速造成法氏囊萎缩,且能排毒、污染环境。本研究再次比较1日龄商品肉鸡免疫灭活疫苗和囊胚宝、威力克、亚单位苗、活毒苗的实际效果,旨在为生产上正确选择疫苗,更有效地控制和消灭IBD提供科学依据。材料与方法试验用疫苗:新法二联灭活苗2014001批为中试产品疫苗,由辽宁益康生物股份有限公司提供,有效期至2015年2月;囊胚宝(2512株抗原抗体复合物苗)购自匈牙利诗华-费拉西亚兽医生物制品有限公司,批号3810B4LKA,有效期至20151020;威力克-鸡传染性法氏囊病病毒火鸡疱疹病毒载体活疫苗(vHVT-013-69株)由梅里亚动物保健有限公司生产,批号1V1060,有效期至2016.10;鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗,青岛易邦生物工程公司生产,生产批号2013012,有效期至20141008;锐必法-鸡传染性法氏囊耐热保护剂活疫苗(B87株),瑞普(保定)生物药业有限公司生产,有效期至20151127。试验用鸡:1日龄商品肉鸡200只,分为5个大组,在同一动物房不同隔离器中喂养。每大组40只再分成2小组:1-1、2-1、3-1、4-1、5-1各30只,分别于1日龄免疫锐必法、囊胚宝、威力克、亚单位苗、新法二联苗;1-2、2-2、3-2、4-2、5-2各10只,不免疫为同居组。另有30只,作对照,另一隔离器中喂养。抗体测定:1、15、30、45日龄采血测定ELISA抗体,按idexx试剂盒操作说明进行。囊/体比测定:免疫后30天、45天从各免疫组和同居组中取出5只,扑杀、观察法氏囊病理变化,并照相、称重,计算各免疫组与同居组的囊/体比(g/kg)。结果与讨论带有较高IBD母源抗体的(ELISA抗体为12.6 1og2)1日龄肉鸡,免疫上述苗后15天,免疫组、同居组及对照组抗体均下降至9.1～10.0 log2;免后30天,除新法二联上升至11.1 log2外,锐必法、囊胚宝、威力克、亚单位苗依次继续下降至9.1、8.4、8.6、7.4 log2;各同居组均与对照组相似,抗体在7.6～8.5 log2。30天解剖,仅见囊胚宝免疫组与同居组各有1只法氏囊肿大(1/5),且有黄色胶冻样浸润,其余各免疫组、同居组均无明显变化。囊/体比(g/kg)对照组为1.786,其它各组为1.556～2.108。显示除囊胚宝免疫与同居组外,其它各组尚未感染或尚未引起法氏囊病变。45天剖解和检测显示,囊胚宝免疫组和同居组法氏囊全部(5/5)高度萎缩,囊/体比为0.560、0.573,且出现了较高感染抗体(ELISA抗体为12.4、12.5 log2);在同一动物房其它隔离器中喂养的各组也出现了不同程度感染:未免对照组、锐必法免疫组和同居组均5/5高度萎缩,囊/体比为0.509、0.605、0.600,感染抗体为11.9、12.3、12.3 log2;其余各组除灭活苗免疫组未见法氏囊萎缩(0/5、囊/体比1.773,抗体11.7 log2)外,威力克免疫组1/5、同居组5/5、亚单位苗1/5、同居组0/5、灭活苗同居组1/5法氏囊明显萎缩,囊/体比依次为1.232、0.505、1.348、1.529、1.349,ELISA抗体依次为11.2、12.4、8.2、7.5、10.0 log2。结论免疫有母原抗体的商品肉鸡,上述疫苗均存在免疫空白期,仍有亚临床感染风险,但高效灭活苗产生抗体最快、最高;囊胚宝本质是2512,在母原抗体消退的瞬间(本试验中为28日龄)可造成免疫鸡的亚临床感染、法氏囊的迅速萎缩;囊胚有很强的排毒能力,污染环境,可引起同居组和同房内其它隔离器内试验鸡的感染(已经多次实验证实)。

关键词：商品肉鸡抗原抗体复合物灭活苗法氏囊母源抗体 IBD 效果比较

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犬细小病毒SH14株的分离鉴定及其VP2基因序列分析

犬细小病毒SH14株的分离鉴定及其VP2基因序列分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：唐井玉李传峰陈宗艳孟春春王权刘光清中国农业科学院上海兽医研究所安徽农业大学动物科技学院

引言犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）是感染犬的重要病原之一,主要危害幼犬,特别是2月龄至6月龄幼犬。主要表现为急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎。CPV传染性强,发病率和病死率高,给我国养犬业带来了严重的威胁。CPV为单股、负... 详细信息

引言犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）是感染犬的重要病原之一,主要危害幼犬,特别是2月龄至6月龄幼犬。主要表现为急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎。CPV传染性强,发病率和病死率高,给我国养犬业带来了严重的威胁。CPV为单股、负链线性DNA病毒,基因组全长5.3kb,包含两个大的开放阅读框ORF1（编码结构蛋白VP1和VP2）和ORF2（编码非结构蛋白NS1和NS2）。犬细小病毒最显著的生物学特性就是VP2基因具有较高的进化速率(2×10次/位点.年),已达到某些RNA病毒的进化速率。由于犬细小进化变异较快,犬细小病毒疫苗已经不能很好的防治犬感染该病,免疫失败现象常有发生。所以分离鉴定犬细小病毒的流行株,是了解和掌握犬细小病毒流行病学及其变异趋势的重要手段,有利于进一步研究犬细小病毒进化和变异规律,并为研发新型疫苗奠定基础。材料与方法猫肾细胞（CRFK）由中国农业科学院上海兽医研究所保存;DMEM细胞培养液、胎牛血清、胰酶购自Hyclone公司;各种酶和PMD-19T载体购自TaKaRa公司;DNA提取试剂盒购自OMEGA公司;胶回收试剂盒购自Axygen公司。病料采集于上海维康宠物医院上海维康宠物医院。病犬临床表现为病犬消瘦、眼窝深陷、被毛凌乱、精神抑郁,腹泻并伴有恶臭。本研究用疑似犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染的病犬肠组织研磨液接种猫肾细胞（CPFK）,进行病毒分离,并利用病理组织学、分子生物学、电镜以对分离的病毒进行鉴定,并对VP2基因序列进行比对分析。结果与讨论病死犬剖解后发现,空肠浆膜呈明显的弥漫性出血,空肠组织病理切片在显微镜下可观察到肠绒毛粘膜上皮细胞坏死、脱落,肠绒毛脱落游离于肠腔,固有层裸露并有数量不等的炎性细胞浸润,肌层大量肌纤维溶解、断裂。SH14在接种至第2代病毒的细胞,在72h左右开始出现明显的细胞病变,细胞逐渐圆缩,脱落。收获病毒传至第6代,细胞特征性病变依然存在。分离的CPV病毒株第4代细胞培养物按Reed-Muench法计算病毒的TCID50为10-4.9/0.1m1。在培养72h的病毒培养物负染电镜中,可见到直径大约为20nm、呈圆形的细小病毒粒子。分析VP2测序结果,与CPV SH-2/2011株相近,核苷酸同源性达99.83%,氨基酸同源性达100%。SH14株与各参考毒株VP2基因系统进化关系如图6所示,CPV在不断的进化过程中形成2个不同的亚群SubgroulⅠ和SubgroupⅡ。本分离株处在CPV的Subgroup 1分支上。对VP2中关键氨基酸进行分析SH14株426位氨基酸为N,297位氨基酸有S替换成A,因此本研究分离出的CPV属于NewCPV-2a型。CPV从出现到现在30多年的时间里,不断变化,至今已发现CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c（a）、CPV-2c（b）和CPV-2c等基因型。目前我国流行的毒株多属于New CPV-2a和New CPV-2b。CPV可以在中间传播流行并不断进化。随着我国养犬业和宠物行业的不断发展,国内犬的数量不断增长,CPV具有较高的发病率和病死率,严重阻碍了我国养犬业的健康发展。因此对CPV进行分子流行病学调查,了解其抗原变异和流行情况十分必要。本研究通过分离近期上海的流行毒株并进行一系列鉴定分析,丰富了我国CPV的流行病学资料,也为以后CPV的研究奠定了基础。

关键词：犬细小病毒基因序列分析 VP2 分离鉴定

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Expression of Raf kinase inhibitor protein is downregulated in response to Newcastle disease virus infection to promote viral replication

Expression of Raf kinase inhibitor protein is downregulated ...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者： Renfu Yin Xinxin Liu Yuhai Bi Guangyao Xie Pingze Zhang Xin Meng Lili Ai Rongyi Xu Yuzhang Sun Tobias Stoeger Zhuang Ding Department of Veterinary Preventive Medicine College of Veterinary MedicineJilin University College of Quartermaster Technology Science Jilin University CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology Institute of MicrobiologyChinese Academy of Sciences China Animal Health and Epidemiology Center

Newcastle Disease virus(NDV) causes a severe and economically significant disease affecting almost the entire poultry industry ***,factors that affect NDV replication in host cells are poorly *** kinase inhibitory protein(RKIP) is a physiologic inhibitor of c-RAF kinase and NF-κB signaling known for their functions in the control of immune response as well as tumor invasion and *** the present study we investigated the consequences of overexpression of host RKIP during viral *** demonstrate that NDV infection represses RKIP expression thereby promoting virus *** upregulation of RKIP in turn acts as a potential antiviral defense mechanism in host cells that restricts NDV replication by repressing the activation of Raf/MEK/ERK and IκBα/NF-κB signaling *** results not only extend the concept of linking NDV-host interactions,but even reveal RKIP as a new class of protein-kinase-inhibitor proteins that affects NDV replication with therapeutic *** In summary,we show that NDV infection represses host RKIP expression,which subsequently results in enhanced Raf/MEK/ERK signaling and IκBα/NF-κB pathway activation,since this pathway is usually inhibited by RKIP activity(Fig.3E).NDV replication however requires Raf/MEK/ERK and IκBα/NF-κB signaling,and virus propagation is therefore less efficient if these pathways are obstructed(Fig.3F).Targeted overexpression of RKIP therefore can be exploited as an antiviral defense mechanism and the results of this study could help not only to improve our understanding of NDV host interactions but even more suggests an new avenue for the development of novel antiviral strategies.

关键词： NDV Expression of Raf kinase inhibitor protein is downregulated in response to Newcastle disease virus infection to promote viral replication Raf

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