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胸腺素TP5-囊素样肽融合基因的克隆、表达及活性检测

胸腺素TP5-囊素样肽融合基因的克隆、表达及活性检测

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：王臣赵战勤牛明福丁轲刘一尘李银聚吴庭才张春杰程相朝河南科技大学动物传染病与微生物实验室

胸腺素TP5和囊素(BS)作为免疫活性因子,具有重要的免疫学功能,能够刺激淋巴细胞增殖、分化和成熟,在临床上具有广阔的应用前景,但两者在基因水平的联合应用尚未见报道。为了研究重组胸腺素TP5-囊素样肽的生物学活性,本研究根据大肠杆菌... 详细信息

胸腺素TP5和囊素(BS)作为免疫活性因子,具有重要的免疫学功能,能够刺激淋巴细胞增殖、分化和成熟,在临床上具有广阔的应用前景,但两者在基因水平的联合应用尚未见报道。为了研究重组胸腺素TP5-囊素样肽的生物学活性,本研究根据大肠杆菌偏嗜密码子用SOE-PCR合成重组胸腺素TP5-囊素样肽基因,扩增产物经EcoRI和XhoI双酶切后插入载体pET32a中,通过T4DNA连接酶转入大肠杆菌DH5α,构建重组质粒pET32a-TP5-BS;重组质粒转入大肠杆菌BL21,筛选阳性重组菌株经IPTG诱导分析重组胸腺素TP5-囊素样肽在大肠杆菌中的表达,同时进行诱导表达条件的优化和可溶性表达分析。表达产物经蛋白质Ni柱亲和层析纯化后,进行MTT活性检测。结果显示,SOE-PCR扩增出147bp的DNA片段,与预期设计大小完全一致;将其克隆至表达载体pET32a中,重组质粒经缺失酶鉴定和序列测定正确,表明重组质粒pET32a-TP5-BS构建成功;用IPTG诱导重组菌株,电泳结果显示诱导的重组菌在24.8KD处出现了与预期相符的明显电泳条带,表明重组胸腺素TP5-囊素样肽在大肠杆菌中获得了表达;SDS-PAGE电泳显示重组胸腺素TP5-囊素样肽能够可溶性表达;MTT试验结果表明重组的胸腺素TP5-囊素样肽具有生物学活性。细胞样肽PAGE本研究初步研究了重组胸腺素TP5-囊素样肽的免疫活性,为进一步研究其生物学功能奠定基础。

关键词：胸腺素TP5 囊素融合基因克隆表达活性检测

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百日咳杆菌粘附素中针对支气管败血波氏杆菌的保护性抗原肽的筛选

百日咳杆菌粘附素中针对支气管败血波氏杆菌的保护性抗原肽的筛选

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：赵战勤程相朝王臣丁轲张春杰李银聚刘一尘吴庭才河南科技大学动物科技学院动物病原微生物实验室

本研究通过百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的分段克隆表达及其在BALB/c小鼠的主动和被动免疫保护试验筛选PRN中的保护性抗原肽。利用大肠杆菌进行PRN的完整蛋白、N端和C端多肽及其RI和RII区域多肽(双拷贝)的表达,命名为GST-PRN、GST-PN、GST... 详细信息

本研究通过百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的分段克隆表达及其在BALB/c小鼠的主动和被动免疫保护试验筛选PRN中的保护性抗原肽。利用大肠杆菌进行PRN的完整蛋白、N端和C端多肽及其RI和RII区域多肽(双拷贝)的表达,命名为GST-PRN、GST-PN、GST-PC、GST-2PRI和GST-2PRII。通过SDS-PAGE分析,发现经大肠杆菌BL21表达的各重组蛋白分子量分别为96、66、57、50和51kDa,是PRN及其各片段与GST的融合蛋白。经Bio-RadQuantityOneprogram分析,各重组蛋白和GST载体蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的61.4%、69.2%、59.3%、44.7%、61.3%和32.8%,提取后的纯度分别为92.4%、95.2%、94.4%、88.3%、84.7%和91.5%。Westernblot检测证实5种表达产物均具有良好的反应原性。在主动免疫保护试验中,5种表达产物均能诱导小鼠产生较高的PRN抗体水平;当使用3LD50的支气管败血波氏杆菌(Bb)强毒株HH0809进行鼻腔攻击后,GST-2PRI的保护率为66.7%(6/9),其余4者的保护率均为100%(9/9);当使用10LD50的HH0809攻击时,其保护率分别为77.8%(7/9)、33.3%(3/9)、66.7%(6/9)、10%(1/10)和60%(6/10)。在被动免疫保护试验中,当使用10LD50的HH0809进行腹腔攻击时,GST-2PRI抗血清对小鼠的保护率为20%(2/10),其余4者的保护率均为100%(10/10);但经天然PRN吸附后的5种兔抗血清均无任何保护力(0/5)。本研究表明PRN的N端和C端表达多肽均具有较强的针对Bb的保护力,且C端强于N端;而C端RII区域的保护力也显著强于N端RI区域。

关键词：支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素保护性抗原

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传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：欧阳伟王永山周宇张海彬唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

将近期引起IBD免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-... 详细信息

将近期引起IBD免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-VP2。对重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用IBDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应,抗原效价达到1.6×103;用Western blotting分析,在53kDa处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组Vp2蛋白能够自组装成病毒样颗粒,在感染细胞中发现了"包涵体样"结构。用HisTrap HP亲和层析柱纯化的重组Vp2蛋白作为包被抗原,建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物,免疫2周龄SPF鸡,一次免疫14d后,ELISA检测抗体效价为8×102,中和抗体效价为1106,攻毒实验的存活率为30%;二次免疫14d后,ELISA抗体效价为3.2×103,中和抗体效价为2536,存活率为100%。在实验观察7d内,重组Vp2蛋白免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化,法氏囊/体重比高于对照组(P<0.05)。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和检测试剂方面显示出了应用前景。

关键词：传染性法氏囊病病毒 Vp2基因病毒样颗粒包涵体样结构间接ELISA 免疫实验

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表达T+Pm保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及其生物学特性

表达T+Pm保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及其生物学...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：赵战勤王臣丁轲张春杰李银聚刘一尘吴庭才程相朝河南科技大学动物科技学院动物病原微生物学实验室

粘膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的重要方向,以细菌为载体的重组活疫苗是其最有发展前景的研究领域之一。本研究利用Asd+平衡致死系统构建表达巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)的重组猪霍乱沙门氏菌株,并对重组... 详细信息

粘膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的重要方向,以细菌为载体的重组活疫苗是其最有发展前景的研究领域之一。本研究利用Asd+平衡致死系统构建表达巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)的重组猪霍乱沙门氏菌株,并对重组菌株的生物学特性进行比较研究。通过基因克隆的方法构建表达PMT的重组质粒pYA-PmtC,再将其电转化减毒猪霍乱沙门氏菌C500的asd基因缺失株C501,构建口服活疫苗菌株C501(pYA-PmtC)。生化鉴定结果表明,重组菌株C501(pYA-PmtC)与载体菌株C501(pYA3493)不能利用乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖醇和尿素作为唯一碳源,但能利用一些其他糖类作为唯一碳源,这些生化指标与亲本菌株C500相同。同时发现重组菌株C501(pYA-PmtC)的血清型和生长速度与亲本菌株C500一致;在没有选择压力的条件下,C501(pYA-PmtC)能够稳定遗传重组质粒及其外源基因片段,并能稳定、高效、分泌性表达30.5kDa的外源保护性抗原rPmtC。通过生物学软件Bio-RadQuantityOne对SDS-PAGE结果进行分析,发现重组蛋白rPmtC的总表达量约占菌体总蛋白的3.3%。其中,在菌体中的表达量约占总表达量的69.6%,分泌到上清液中的表达量(分泌性表达)占31.4%。C501(pYA-PmtC)腹腔感染BALB/c小鼠的LD50为8.5×106CFU,毒力稍低于C500(LD50为4.4×106CFU);口服接种C501(pYA-PmtC)和C500的所有仔猪未见任何发病症状,两者没有显著差别。本研究利用Asd+平衡致死系统的原理构建表达T+Pm保护性抗原重组猪霍乱沙门氏菌弱毒菌株C501(pYA-PmtC),为进一步开发猪萎缩性鼻炎-副伤寒的双价基因工程疫苗奠定基础。

关键词：猪霍乱沙门氏菌C500株产毒巴氏杆菌 Asd+平衡致死系统重组疫苗

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猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒转录调控序列TRS鉴定及其功能解析

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒转录调控序列TRS鉴定及其功能解析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：郑海红孙志朱兴全袁世山中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病研究室农业部动物寄生虫病重点实验室华南农业大学兽医学院

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)mRNA的合成采用独特的非连续性转录方式进行,对其发生及调控机制尚不清楚。本文利用RT-PCR技术确定了北美弱毒株PRRSV各个亚基因组mRNA的转录调控因子(TRS-B)的核心序列(CS-B)及其介导的Leader-body... 详细信息

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)mRNA的合成采用独特的非连续性转录方式进行,对其发生及调控机制尚不清楚。本文利用RT-PCR技术确定了北美弱毒株PRRSV各个亚基因组mRNA的转录调控因子(TRS-B)的核心序列(CS-B)及其介导的Leader-body结合位置,结果发现PRRSV mRNA分子的转录可使用经典(canonical)及非经典(noncanonical)TRS-B进行。通过对PRRSV感染性克隆pAPRRS进行定点基因突变及其所致拯救病毒的鉴定,以此确定TRS-L和TRS-B突变对亚基因组转录及病毒感染性的影响。结果表明:(1)同时突变TRS-L最后两个CC的全长突变体pLeaderD对MARC-145细胞无感染性,且未产生sgmRNA7转录本;而只突变最后一个C的pLeaderR能拯救出突变病毒,但突变位点在突变病毒系列传代中发生回复突变,由此证明TRS-L3’的一级序列对不连续性转录起着重要作用且PRRSV具有一定修复功能(。2)突变TRS1233’最后两个碱基的pM7Da或突变TRS93’最后两个碱基的pM7Db均能拯救出病毒,而共同含有TRS9和TRS1233’最后两个碱基突变的pM7DabR不能拯救出病毒,对拯救的突变病毒进行鉴定发现,TRS123突变的拯救病毒在一系列传代中突变碱基回复,而TRS9突变的拯救病毒传代过程中稳定遗传;突变体pM7S3(含有TRS123的三个碱基突变)和pM7Db虽能拯救出活病毒,但突变都使相应的sgmRNA7转录量至零,且vM7S3滴度偏低。由此证明了TRS9和TRS123都可单独承担PRRSVsgmRNA7的转录调控及其3’一级序列对不连续性转录起着重要作用且PRRSV具有修复功能;PRRSV的N蛋白主要来源于sgmRNA7.1的翻译。(3)所有突变病毒的亚基因组中leader–body结合位点碱基均来源于TRS-B,为负链RNA不连续转录模型理论提供直接证据。

关键词： TRS 亚基因组猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 PRRSV 感染性克隆功能解析

来源：评论

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PRRSV GP3N-糖基化作用的初步研究

PRRSV GP3N-糖基化作用的初步研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：刘欢欢周艳君姜一峰张善瑞李国新童光志中国农业科学院上海兽医研究所

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是20世纪80年代末发生的严重危害养猪业的一种病毒性传染病,主要引起母猪流产、死胎等繁殖障碍,引发新生仔猪的高致死率及生长猪的呼吸道症状。PRRSV中GP2a、GP... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是20世纪80年代末发生的严重危害养猪业的一种病毒性传染病,主要引起母猪流产、死胎等繁殖障碍,引发新生仔猪的高致死率及生长猪的呼吸道症状。PRRSV中GP2a、GP3,GP4,GP5为囊膜有关的糖蛋白.糖蛋白可以作为病毒的内源性和外源性受体,病毒还可以借助糖链的修饰来逃避宿主的免疫监控。在PRRSV中GP3为次要结构蛋白,在病毒粒子中它与GP2a,GP4三者以聚合体的形式出现。GP3被认为以保护性免疫有关,但是它的免疫原性和保护作用机制尚不清楚,而关于该蛋白糖基化对病毒的影响仍阐述不多。为研究GP3蛋白的糖基化作用PRRSV的复制,感染,抗原性等方面的影响,本实验从以下方面进行。对已有的PRRSVHuN4-F112弱毒株进行糖基化分析后发现GP3蛋白共存在七个潜在糖基化位点。本实验采用了点突变的方法将GP3蛋白潜在糖基化位点的氨基酸进行突变替换,将N29/N195,N42替换为Q29/Q195,Q42。在本实验室现有HuN4-F112弱毒株感染性克隆的基础上,构建糖基化位点突变重组cDNA克隆,使GP3蛋白上相应的糖基化位点消失从而病毒不能得到相应位置糖链的修饰。cDNA克隆序列测定正确后将其体外转录,转染BHK和MARC-145细胞,病毒传代培养,获得针对GP3-N42,N29/N195(两个位点同时突变)氨基酸糖基化位点替换后的拯救病毒。经感染性克隆标记性MIUI酶切鉴定为重组病毒(非野毒),PRRSVGP5,M蛋白单抗间接免疫荧光检测均可见蛋白表达,对传至五代的病毒提取RNA,反转录后PCR产物序列测定突变的糖基化位点存在。证明获得的拯救病毒为糖基化位点突变后的重组毒。TCID50测定,两株拯救病毒的TCID50为10-4.875/0.1ml.病毒生长曲线测定显示GP3-N42株拯救病毒比HuN4-F112弱毒株降低两个滴度。推测可能是糖链的缺失影响了病毒对宿主细胞的粘附,侵入等作用。本部分实验为进一步研究糖基化作用对PRRS病毒的影响奠定了基础。

关键词： PRRSV GP3 糖基化位点

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PRRSV Nsp4蛋白酶活性分析及活性中心的鉴定

PRRSV Nsp4蛋白酶活性分析及活性中心的鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：许傲天周艳君李国新于海闫丽萍童光志中国农业科学院上海兽医研究所

猪繁殖与呼吸综合征病毒是单股正链不分节段的RNA病毒,基因组大小约为15kb。PRRSV非结构蛋白Nsp4具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,是参与病毒多聚蛋白前体加工的主要蛋白酶。随着新生多聚蛋白前体中的Nsp1和Nsp2的迅速自我切割,剩余的前体蛋... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒是单股正链不分节段的RNA病毒,基因组大小约为15kb。PRRSV非结构蛋白Nsp4具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,是参与病毒多聚蛋白前体加工的主要蛋白酶。随着新生多聚蛋白前体中的Nsp1和Nsp2的迅速自我切割,剩余的前体蛋白主要由Nsp4加工完成。此外,RRRSV Nsp4还与病毒的复制、毒力以及动物机体对PRRSV的固有免疫有关,是深入研究PRRSV致病机理以及开发抗病药物的重要靶蛋白。本研究根据GeneBank中已发表的高致病性PRRSV HuN4全基因序列,设计引物扩增获得HuN4Nsp4基因,并将其克隆到原核表达载体的T7启动子下,获得表达质粒pT7Pro。同时将Nsp3最后8个氨基酸与全长Nsp4基因融合在一起克隆到表到载体pET32a,获得表达质粒pET32a-Nsp3′4。同时将Nsp4活性位点S118突变为Y118获得表达质粒pET32a-Nsp3′4(Y118),利用pET32a-Nsp3′4和突变体pET32a-Nsp3′4(Y118)表达的融合蛋白作为研究Nsp4酶活性的底物,分析了不同温度、pH、离子和蛋白酶抑制剂对Nsp4酶活性的影响。结果显示,在本实验体系中,Nsp4蛋白酶在24小时就可以使底物被较完全切割,其最适反应温度为8℃,在4～22℃范围内具有比较高的酶活力,随温度上升酶活力迅速下降;最适pH为7.5;其中Cu2+、Zn2+可以显著抑制Nsp4的酶活性;但高浓度的Na+、K+对酶活性没有显著的抑制作用;色氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、金属蛋白酶抑制剂EDTA、胰蛋白酶抑制剂TPCK可以抑制Nsp4蛋白酶活性。利用定点突变技术将Nsp4预测的活性中心His39、Asp64和Ser118以及Ser45、Asp60和Asp69引入一系列单点突变,获得10个Nsp4突变体,表达并纯化突变体蛋白,分析突变体蛋白对酶活性的影响。结果显示His39、Asp64和Ser118三个位点的任何一个突变均能够使Nsp4的酶活性丧失,观察不到明显的切割反应;而对Asp60、Asp69和Ser45三个氨基酸分别突变为Glu、Glu和Leu,这三个氨基酸突变后对Nsp4的酶活性没有明显的影响,进一步证实了His39、Asp64和Ser118是Nsp4发挥蛋白酶活性所必需的。本研究建立了一种分析Nsp4蛋白酶活性的方法,为进一步研究切割底物的特异性与筛选抗病毒药物奠定了基础。

关键词： PRRSV Nsp4蛋白酶活性

来源：评论

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Serological and virological surveillance of swine H1N1 and H3N2 influenza virus infection in central China

Serological and virological surveillance of swine H1N1 and H...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者： Rui Wu Zewen Liu Wangwang Liang Keli Yang Junhua Deng Zhengying Duan Danna Zhou Diping Xu Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science Hubei Academy of Agricultural Sciences Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding

Swine influenza viruses H1N1 and H3N2 have been reported in the swine population worldwide. From June 2008 to June 2009, we carried out serological and virological surveillance of swine influenza in the Hubei province in central China. The serological results indicated that antibodies to H1N1 swine influenza virus in the swine population were high with a 42.5% (204/480) positive rate, whereas antibodies to H3N2 swine influenza virus were low with a 7.9% (38/480) positive rate. Virological surveillance showed that only one sample from weanling pigs was positive by RT-PCR. Phylogenetic analysis of the hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes revealed that the A/Sw/HB/S1/2009 isolate was closely related to avian-like H1N1 viruses and seemed to be derived from the European swine H1N1 viruses. Molecular analysis of the HA protein revealed that the A/Sw/HB/S1/2009 virus persisted in pigs without antigenic drift. In conclusion, H1N1 influenza viruses were more dominant in the pig population than H3N2 influenza viruses in central China, and infection with avian-like H1N1 viruses persistently emerged in the swine population in the area.

关键词： Surveillance Swine influenza virus H1N1 subtype H3N2 subtype Central China

来源：评论

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Immune Responses to the Attenuated Mycoplasma hyopneumoniae 168 Strain Vaccine by Intrapulmonic Immunization in Piglets

Immune Responses to the Attenuated Mycoplasma hyopneumoniae ...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：冯志新 Guo-Qing Shao Mao-Jun Liu Xu-Su Wu Yong-Qi Zhou Yuan Gan Institute of Veterinary Medicine Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Key Laboratory of Animal Diseases Diagnostic and Immunology Ministry of Agriculture·National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products Nanjing Tianbang Bio-Industry Co.LTD

To investigate the immune responses to the attenuated Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) 168 strain vaccine, 8-15 days old piglets were immunized with M. hyopneumoniae 168 strain vaccine by intrapulmonic route. And the specific IgG antibody in serum, lymphoproliferation, IFNγ and specific secretory IgA (SIgA) antibody in bronchoalveolar lavage fluid were detected on 30 and 60 day post-immunization (DPI), respectively. On 60 DPI, all the pigs except for those in health control group were challenged with a field M. hyopneumoniae strain JS. Necropsy was performed on 30 day post-challenge (DPC). The results showed that IFNγ and specific SIgA were stimulated on surface of respiratory tract after immunization. And peripheral blood mononuclear cells could also be proliferated about 1.81 fold and 2.12 fold on 30 and 60 DPI, when stimulated by M. hyopneumoniae protein in vitro. However, no serum's systemic IgG antibody against M. hyopneumoniae was detected during the whole immune phage. After challenge, vaccinated pigs were observed with only very slight histological lesion in individual lobes. None of vaccinated pigs showed any clinical signs. While the unvaccinated pigs from challenge control group showed varying degrees of clinical sign and severe macroscopical lesion of mycoplasmal pneumonia of swine (MPS). The result suggested that the attenuated M hyopneumoniae 168 strain vaccine inoculated by intrapulmonic route could activate the systemic cellular immunity, the local mucosal immunity and IFNγ secretion in respiratory tract to against M. hyopneumoniae infection in piglets.

关键词： Mycoplasma hyopneumoniae, attenuated vaccine, cellular immunity, mucosal immunity.

来源：评论

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T cell stimulatory capacity of Newcastle disease virus hemagglutinin-neuramidinase in vitro and in vivo

T cell stimulatory capacity of Newcastle disease virus hemag...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：李霄 Chang Li Huijun Lu Mingyao Tian Kuoshi Jin Ningyi Jin Genetic Engineering Laboratory of PLA Academy of Military Medical Sciences of PLA

AIM: To investigate the T cell stimulatory capacity and anti-tumor properties of Newcastle disease virus (NDV) hemagglutinin-neuraminidase (HN). METHODS: The expression of HN was identified by western blot and indirect immunofluorescence assay (IFA). Sialidase activity of NDV HN was assayed by the periodate-resorcinol method. Human peripheral blood mononuclear cells (hPBMCs) were isolated and the cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses toward the HepG-2 target cells infected with the recombinant adenovirus expressing NDV HN (Ad-HN) were determined using lactate dehydrogenase (LDH) assay in vitro. The in vivo anti-tumor effects of NDV HN were evaluated in the H22 solid tumor model. Regional lymph nodes of the mouse model treated with Ad-HN were removed for harvesting T lymphocytes and the cytotoxic of CTL and natural killer (NK) cells, cytokine secretion were carried out by LDH assay, flow cytometric analysis and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), respectively. RESULTS: The resuls of western blot and IFA showed that HN was effectively expressed and mainly localized on cell surface. Sialidase activity assay showed that Ad-HN reduced significantly sialic acid amount of the hepatoma cells compared with the empty adenovirus vector (Ad-mock). The observation that the infection with Ad-HN made hepatoma cells more sensitive to the CTLs of hPBMCs in vitro confirmed the enhancement of the anti-tumor immunity of this approach. Furthermore, the in vivo assays performed by using C57BL/6 mice containing established H22 primary tumors expanded the in vitro studies. When treated with Ad-HN, the growth of subcutaneous primary tumors was suppressed and the main survival of the mouse model was increased. In addition, the treatment of mice with Ad-HN elicited strong NK and CTL responses, high levels of Th1 cytokine IL-2 and IFN-γ secretion. CONCLUSION: NDV HN is effective at eliciting T cell mediated antitumor cytotoxicity via the sialidase activity and may be a novel strategy f

关键词： NDV T cell stimulatory capacity of Newcastle disease virus hemagglutinin-neuramidinase in vitro and in vivo

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