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作者

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非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响

非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：刘艳田立志张翔林洋单春乔涂岳江国托大连三仪动物药品有限公司生物工程研究所辽宁大连 116036 黑龙江省牡丹江农垦分局畜牧水产局黑龙江密山 158308

目的：研究采用淋巴细胞体外培养方法制备的非特异性转移因子的理化性质及不同浓度非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响。方法：通过福林酚测定法检测制备的非特异性转移因子中多肽的含量，采用核糖含量测定测定法检测其核... 详细信息

目的：研究采用淋巴细胞体外培养方法制备的非特异性转移因子的理化性质及不同浓度非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响。方法：通过福林酚测定法检测制备的非特异性转移因子中多肽的含量，采用核糖含量测定测定法检测其核糖的含量，使用GENMED—MTS细胞繁殖定量检测试剂盒测定不同浓度的非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响。结果：本研究所制得的非特异性转移因子具有和牛、羊、鸡等脾源转移因子相似的理化性质，其多肽含量为0.81mg/mL，核糖含量为17.96μg/mL，同时浓度在0.01～0.43mg/mL的范围内非特异性转移因子还能较显著刺激犬淋巴细胞的增殖。结论：本研究所采用的制备方法不但降低了产品研制的成本，而且避免了大量传染病水平传播的可能。同时通过细胞免疫方面考察了非特异性转移因子生物学功能，以期为探讨转移因子的作用机制及其临床应用提供可供参考的实验依据。

关键词：犬病毒性传染病非特异性转移因子多肽核酸淋巴细胞转化增殖免疫调节剂

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Ⅰ型鸭肝炎病毒SG株的分离鉴定及全基因组序列测定与分析

Ⅰ型鸭肝炎病毒SG株的分离鉴定及全基因组序列测定与分析

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：刘标高继明辛英豪刘少宁王波姜世金山东农业大学动物医学院

自2007年12月山东寿光某爆发Ⅰ型鸭肝炎养鸭场分离一株Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ),命名为SG株,对山东寿光地区的疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织进行病原分离,通过鸭胚尿囊腔接种分毒、血凝实验、标准血清中和实验、动物回归实验以及RT-PCR... 详细信息

自2007年12月山东寿光某爆发Ⅰ型鸭肝炎养鸭场分离一株Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ),命名为SG株,对山东寿光地区的疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织进行病原分离,通过鸭胚尿囊腔接种分毒、血凝实验、标准血清中和实验、动物回归实验以及RT-PCR检测对病毒进行鉴定,并在此基础上对该病毒的ELD50和LD50进行了测定.结果表明所分离病毒无血凝性,人工感染12日龄鸭胚和7日龄雏鸭后表现出典型的鸭肝炎病毒致病特征,能被DHV-Ⅰ标准抗血清中和,RT-PCR检测及序列测定为传统的DHV-Ⅰ,其第5代病毒尿囊液对12日龄鸭胚的ELD50为10-5.58/0.2ml,对7日龄雏鸭的LD50为10-4.68/0.2ml.根据已发表序列设计合成9对引物,以SG株DHV-Ⅰ基因组为模板经RT-PCR扩增出9段连续的、相互部分重叠的DNA片段并分别连入T载体进行克隆测序.用DNAstar软件对测序结果进行拼接,获得了该病毒的全基因组核苷酸序列.比较分析发现,SG株DHV-Ⅰ与其他传统DHV-Ⅰ毒株在同一进化分支上,而与DHV-Ⅰ变异株的进化分支距离较远,确证SG株为一株DHV-Ⅰ传统强毒.

关键词： Ⅰ型鸭肝炎病毒分离鉴定全基因组核苷酸序列

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猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白末端序列在病毒复制过程中的作用分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白末端序列在病毒复制过程中的作...

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：谭菲菲韦祖樟孙志庄金山袁世山中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病研究室

核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)是猪繁殖与呼吸综合征病毒((Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome,PRRS))的最主要的结构蛋白,在病毒粒子的包装中起着重要作用,但是对于病毒感染性所必需的N蛋白的最小结构域还不确定.本研... 详细信息

核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)是猪繁殖与呼吸综合征病毒((Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome,PRRS))的最主要的结构蛋白,在病毒粒子的包装中起着重要作用,但是对于病毒感染性所必需的N蛋白的最小结构域还不确定.本研究在本实验室所拥有的感染性克隆的基础上,构建了N蛋白末端系列缺失的突变体,通过转染Marc-145细胞,观察细胞病变,检测基因组的复制、亚基因组的转录,表明N蛋白C端可以承受4个氨基酸的缺失而不影响病毒的感染性.值得说明的是N蛋白C端所有缺失突变体转染细胞后拯救出的病毒都发生了额外的突变,包括点突变和缺失.其中C端缺失3个氨基酸的突变体拯救病毒经空斑纯化后出现了5种形式的病毒,包括两种额外缺失和三种额外的点突变.C端缺失4个氨基酸的突变体拯救病毒也发生了额外的点突变.C端缺失5个氨基酸的突变体转染细胞后没有拯救出活的病毒,但可以检测到亚基因组的转录,说明可能影响了病毒粒子的包装.这些拯救病毒都可以在细胞上至少稳定传5代,从而为缺失疫苗的研究奠定基础.

关键词：核衣壳蛋白点突变拯救病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞病变 PRRSV 空斑纯化感染性克隆突变体氨基酸末端序列病毒复制

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一株鹅源副粘病毒分离株全基因组序列的克隆与序列分析

一株鹅源副粘病毒分离株全基因组序列的克隆与序列分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：魏雪涛李银刘宇卓张敬峰江苏省农业科学院兽医研究所.农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心南京 210014

从发病的鹅分离到一株鹅源副粘病毒(GPMV)，血清学鉴定表明该分离病毒为禽副粘病毒-Ⅰ型(PMV-Ⅰ)。运用RT-PCR方法荻取了E01株鹅副粘病毒全基因组序列，并对其进行了比较分析。此株鹅副粘病毒(E01)的全基因组序列由15192个碱基组成，与... 详细信息

从发病的鹅分离到一株鹅源副粘病毒(GPMV)，血清学鉴定表明该分离病毒为禽副粘病毒-Ⅰ型(PMV-Ⅰ)。运用RT-PCR方法荻取了E01株鹅副粘病毒全基因组序列，并对其进行了比较分析。此株鹅副粘病毒(E01)的全基因组序列由15192个碱基组成，与鸡NDV一致，基因由6个ORF组成，3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，但是在NP基因和P基因之间的非翻译区多了6个核苷酸ACACTC。测序后拼接的F基因长1672bp，包含完整的开放阅读框(1662bp)，编码553个氨基酸，F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117，具有强毒株序列特性，同时也与本实验分离该株鹅副粘病毒分离株致病性试验结果相符。根据NDV基因分型标准，鹅副粘病毒E01株归属基因Ⅷ型副粘病毒。F基因与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.9％～97.7％测序后拼接的HN基因长为1716 bp，编码571个氨基酸，与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.0％～98.1％。

关键词：鹅源副粘病毒基因序列遗传变异 F蛋白

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抗人红细胞单链抗体与猪瘟E2蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

抗人红细胞单链抗体与猪瘟E2蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：覃绍敏白安斌吴健敏廖文军袁书智华俊关忠谊广西兽医研究所广西南宁530001 惠朋动物药业有限责任公司广西南宁530001

为构建既具有凝集性又具有抗原性的双功能融合蛋白,本研究以重组质粒PMD-2E8ScFv和PETmE2为模板,应用PCR方法分别扩增出目的基因2E8ScFv(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和mE2(猪瘟E2蛋白主要抗原编码区基因)。采用重叠延伸(SOE)PCR的方法... 详细信息

为构建既具有凝集性又具有抗原性的双功能融合蛋白,本研究以重组质粒PMD-2E8ScFv和PETmE2为模板,应用PCR方法分别扩增出目的基因2E8ScFv(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和mE2(猪瘟E2蛋白主要抗原编码区基因)。采用重叠延伸(SOE)PCR的方法将2E8ScFv和mE2拼接成融合基因2E8mE2,经测序正确后,将2E8mE2亚克隆入PET-DsbA原核表达载体,经PCR和酶切鉴定,表明重组表达质粒PET-DsbA-2E8mE2构建成功。将该重组表达质粒转化入宿主菌BL21(DE3)Plyss中,用IPTG进行诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE电泳、免疫印迹和BandScan软件分析。结果表明：2E8mE2融合基因在大肠杆菌中获得了高效表达,表达产物大部分以不溶的包涵体形式存在,分子量约为65KDa,与预期的大小一致;融合蛋白的表达量约占菌体总量的30％左右。Western blotting与红细胞凝集试验证实：2E8mE2融合蛋白既能够与人红细胞结合,又能够与CSFV抗体反应,具有双功能特性。

关键词：猪瘟单链抗体双功能蛋白原核表达红细胞凝集试验 2E8mE2融合蛋白

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猪传染性胃肠炎病毒M蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

猪传染性胃肠炎病毒M蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：张小波左玉柱刘媛范京惠李潭清李建辉孙彦新河北农业大学动物科技学院

本研究根据GenBank发表的TGEV TS株全基因核苷酸序列,设计了1对用以扩增TGEV主要结构蛋白M基因的特异性引物.利用RT-PCR方法扩增TGEV HB06株M基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定,将获得的M基因片段定向亚克隆入... 详细信息

本研究根据GenBank发表的TGEV TS株全基因核苷酸序列,设计了1对用以扩增TGEV主要结构蛋白M基因的特异性引物.利用RT-PCR方法扩增TGEV HB06株M基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定,将获得的M基因片段定向亚克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-M,转化Rossetta(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白.结果表明,从TGEV HB06株扩增得到了M基因片段,该基因全长789 bp,编码262个氨基酸,与TS株、Purdue-115株、TFI株和H16株的M基因同源性分别为97%、99%、96%和97%.SDS-PAGE电泳结果显示,重组表达质粒获得了约56 kDa的目的带,其中M蛋白的分子质量约为30kDa,与预期的结果一致,并且表达产物主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析表明,表达的M重组蛋白可以被兔源抗TGEV阳性血清识别;试验结果证明,TGEV的M基因高度保守,在大肠杆菌表达系统内成功表达了TGEV M蛋白.

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 M基因克隆原核表达

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猪瘟病毒NS3基因克隆、原核表达及间接ELISA方法初步建立

猪瘟病毒NS3基因克隆、原核表达及间接ELISA方法初步建立

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：蒋大良余兴龙李润成葛猛颜爱李杰刘春红刘俊琦湖南农业大学动物医学院湖南长沙 410128

采用PCR方法从猪瘟病毒兔化弱毒(Hog Cholera Lapinized Virus HCLV)疫苗株cDNA中扩增到长度为2000bp左右NS3基因序列,将其克隆进原核表达载体pET32a(+),构建重组原核表达载体pET-NS3。将pET-NS3转化进大肠杆菌Rosetta(DE3)进行优化表达... 详细信息

采用PCR方法从猪瘟病毒兔化弱毒(Hog Cholera Lapinized Virus HCLV)疫苗株cDNA中扩增到长度为2000bp左右NS3基因序列,将其克隆进原核表达载体pET32a(+),构建重组原核表达载体pET-NS3。将pET-NS3转化进大肠杆菌Rosetta(DE3)进行优化表达,采用SDS-PAGE分析NS3融合蛋白主要以包含体形式表达,分子大小约95 *** Blotting分析表明NS3融合蛋白具有免疫原性。采用Ni+亲和层析方法纯化得到NS3融合蛋白(90％)。以纯化的NS3融合蛋白为抗原初步建立了检测CSFV NS3抗体的间接ELISA方法,对221份不同猪群和年龄的猪血清样品进行检测。将检测结果与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果进行对比,结果阳性符合率为83.33％,阴性符合率为89.38％,总符合率为86.43％。实验结果表明：重组原核表达载体pET-NS3构建成功,NS3融合蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功地表达,建立的间接ELISA检测结果与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果有较高一致性。

关键词：猪瘟病毒兔化弱毒 NS3基因基因克隆原核表达融合蛋白蛋白纯化免疫印迹间接ELISA 病毒检测

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非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响

非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：刘艳田立志张翔林洋单春乔涂岳江国托大连三仪动物药品有限公司生物工程研究所黑龙江省牡丹江农垦分局畜牧水产局

目的研究采用淋巴细胞体外培养方法制备的非特异性转移因子的理化性质及不同浓度非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响.方法通过福林酚测定法检测制备的非特异性转移因子中多肽的含量,采用核糖含量测定测定法检测其核糖的含量.使... 详细信息

目的研究采用淋巴细胞体外培养方法制备的非特异性转移因子的理化性质及不同浓度非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响.方法通过福林酚测定法检测制备的非特异性转移因子中多肽的含量,采用核糖含量测定测定法检测其核糖的含量.使用GENMED—MTS细胞繁殖定量检测试剂盒测定不同浓度的非特异性转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响。结果本研究所制得的非特异性转移因子具有和牛、羊、鸡等脾源转移因子相似的理化性质,其多肽含量为0.81mg/mL,核糖含量为17.96μg/mL,同时浓度在0.01～0.43 mg/mL的范围内非特异性转移因子还能较显著刺激犬淋巴细胞的增殖.结论本研究所采用的制备方法不但降低了产品研制的成本,而且避免了大量传染病水平传播的可能.同时通过细胞免疫方面考察了非特异性转移因子生物学功能,以期为探讨转移因子的作用机制及其临床应用提供可供参考的实验依据.

关键词：非特异性转移因子多肽核酸犬淋巴细胞增殖

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猪基因工程复合重组抗病毒制剂对高致病性猪蓝耳病病毒体内抑制作用研究

猪基因工程复合重组抗病毒制剂对高致病性猪蓝耳病病毒体内抑制作...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：刘光辉闫若潜吴志明李桂喜张健张志凌河南省动物疫病预防控制中心河南郑州 450008 商丘市动物疫病预防控制中心河南商丘 4760001

选取35头猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病原和血清学检测均阴性猪平均分为7组进行rPoIFN-α-linke-PoIL2蛋白在猪体内抗高致病性猪蓝耳病病毒(猪繁殖与呼吸综合征病毒,HP-PRRSV)试验,并设rPoIFN-α蛋白和rPom-2蛋白等量混合物,单rPoIFN... 详细信息

选取35头猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病原和血清学检测均阴性猪平均分为7组进行rPoIFN-α-linke-PoIL2蛋白在猪体内抗高致病性猪蓝耳病病毒(猪繁殖与呼吸综合征病毒,HP-PRRSV)试验,并设rPoIFN-α蛋白和rPom-2蛋白等量混合物,单rPoIFN-α蛋白及单rPoIL-2蛋白作对照,分别从体温变化、出现HP-PRRSV典型症状维持时间、死亡率、月增重率、病毒血症维持时间等几个方面评估其抗PRRSV在猪体内活性情况。结果表明：rPoIFN-α-linker-PoIL2蛋白、rPoIFN-α蛋白和rPoIL-2蛋白等量混合物、rPoIFN-α蛋白均可有效抑制PRRSV在猪体内的增殖和持续性感染,明显降低发病猪体温,减少高温维持时间、减缓发病症状、降低死亡率;rPoIFN-α-linker-PoIL2蛋白对PRRSV的抑制作用优于单一rPoIFN-α蛋白,稍优于、rPoIFN-α蛋白和rPoIL-2蛋白等量混合物,大大优于rPoIL-2蛋白制剂。本研究结果表明：rPoIFN-α-linker-PoIL2蛋白在猪体内具有rPoIFN-α蛋白和rPoIL-2蛋白的双重抗病毒活性,发病早期应用rPoIFN-α-linker-PoIL2蛋白对PRRSV的抑制效果明显优于后期。

关键词： rPoIFN-α-linker-PoIL2蛋白抗病毒制剂猪繁殖与呼吸综合征病毒体内抑制基因工程

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PCV2 Rep基因启动子区vISRE突变株的生物学特性研究

PCV2 Rep基因启动子区vISRE突变株的生物学特性研究

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：曹瑞兵顾金燕张羽陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室

猪圆环病毒2型（PCV2）是近年来发现的一种重要的动物病原,适量的猪干扰素能促进其在细胞中的增殖.为了揭示PCV2 Rep基因启动子区类干扰素刺激反应元件（vISRE）的生物学功能,本研究应用感染性克隆技术构建了2株vISRE点突变的重组PCV2,... 详细信息

猪圆环病毒2型（PCV2）是近年来发现的一种重要的动物病原,适量的猪干扰素能促进其在细胞中的增殖.为了揭示PCV2 Rep基因启动子区类干扰素刺激反应元件（vISRE）的生物学功能,本研究应用感染性克隆技术构建了2株vISRE点突变的重组PCV2,对突变病毒在PK15细胞上的增殖特性、遗传稳定性及对干扰素刺激的反应特性进行了分析.结果显示,PCV2 Rep基因启动子区ISRE点突变后PCV2仍可在PK15细胞中正常复制,但病毒滴度比亲本毒株下降.PCV2 1740在PK15细胞上3至10代之间遗传稳定,PCV2 1741在PK细胞上第3代病毒保持突变基因的特征,但传至第7代时1743和1744位的AC突变为TT,并一直保持到第10代。100U/mL的PoIFN-α处理感染病毒的PK15细胞后,亲本毒株和2个突变毒株的阳性感染细胞数量均有增加,但亲本毒株病毒粒子数的增加显著高于2个突变毒株.根据结果推测PCV2 Rep基因启动子区vISRE的突变影响其启动子活性,并可能在干扰素促进病毒增殖中发挥调控作用。

关键词：猪圆环病毒2型 Rep基因启动子干扰素刺激反应元件基因突变

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