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36 篇 山东农业大学
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作者

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24 篇 黄伟坚
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抗H3N2亚型猪流感病毒血凝素单克隆抗体的制备与鉴定

抗H3N2亚型猪流感病毒血凝素单克隆抗体的制备与鉴定

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：孔维乔传玲陈艳杨焕良展小过辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨黑龙江 150001

采用纯化的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)作为免疫原免疫6-8周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法筛选分泌抗H3N2亚型SIV的阳性细胞株,经克隆获得7株亲和力较高的杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2C5、2F10... 详细信息

采用纯化的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)作为免疫原免疫6-8周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法筛选分泌抗H3N2亚型SIV的阳性细胞株,经克隆获得7株亲和力较高的杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2C5、2F10、3D3、4E8、5C7、5D12,用其制备的腹水ELISA效价分别为1：105、1：106.1：104、1：105、1：106、1：105、1：106;其中1C9、2C5、2F10、3D3单抗亚类为IgG1,而4E8、5C7、5D12则是IgG2a,所有的单抗轻链均为K型。Wstern-blot结果显示,这7株单抗都能识别HA蛋白,均能分泌针对血凝素的抗体。将本实验室构建的pCAGGS-H3HA质粒转染到293T细胞后,分别用7株单抗进行间接免疫荧光试验,能观察到特异性绿色荧光,证实该7株单抗具有良好的特异性。该亚型单克隆抗体的制备,为SIV鉴别诊断方法的建立奠定了基础。

关键词：猪流感病毒血凝素单克隆抗体鉴别诊断间接免疫荧光试验

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传染性胸膜肺炎放线杆菌apzC基因缺失疫苗菌株的构建及生物学特性的研究

传染性胸膜肺炎放线杆菌apzC基因缺失疫苗菌株的构建及生物学特性...

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：宣春玲王贵平李春玲罗满林贾爱卿广东省农业科学院兽医研究所广州 510640 广东省兽医公共卫生公共实验室广州 510640 华南农业大学兽医学院广州 510642 广东省农业科学院兽医研究所广州 510640 广东省兽医公共卫生公共实验室广州 510640 华南农业大学兽医学院广州 510642

目的：构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)的apx ⅠC基因与apx ⅡC基因缺失突变弱毒菌株APP85，为最终研制出APP的基因工程菌苗奠定基础。方法：以标准菌株APP259中apxⅠC基因与apxⅡC基因为目的... 详细信息

目的：构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)的apx ⅠC基因与apx ⅡC基因缺失突变弱毒菌株APP85，为最终研制出APP的基因工程菌苗奠定基础。方法：以标准菌株APP259中apxⅠC基因与apxⅡC基因为目的缺失基因，根据APP Ⅰ型菌apx基因组序列，利用软件设计分别扩增apxⅠCA上下游同源臂以及apxⅡCA上下游同源臂引物，构建重组自杀转移质粒，将该重组自杀转移质粒先后转移到亲本菌APP259后，利用同源重组筛选到基因缺失突变株。并对该重组菌株主要生物学特性，如溶血性、对小鼠的致病力以及免疫保护作用进行研究。结果：经鉴定表明目的基因已经丢失、APP95基因缺失突变菌株丧失对绵羊血的溶血活性，毒力显著下降，并对免疫小鼠具有良好的安全性。免疫保护性实验表明，用该菌株免疫小鼠后，不仅对同血清型菌株的再次攻击保护率达到85％，对异种血清型菌株(7型)的攻击保护率达到75％。结论：成功获得了apxⅠC基因与apxⅡC基因缺失突变弱毒菌株，可作为预防APP感染的疫苗候选株，为最终研制出APP的基因工程菌苗奠定基础。

关键词：猪传染性胸膜肺炎胸膜肺炎放线杆菌基因缺失突变弱毒疫苗生物学特性

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我国猪场PCV2a和PCV2b共感染情况的调查与分析

我国猪场PCV2a和PCV2b共感染情况的调查与分析

引用

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：翟少伦龙进学韦祖樟张建武岳城禤雄标袁世山中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心/猪传染病防治研究室新疆农业大学动物医学学院广西兽医研究所

近年来我国猪场中猪圆环病毒2型的阳性率有所增加,给我国的养猪业带来了巨大的挑战.本研究主要是为了调查和分析我国猪2型圆环病毒两型间的共感染情况.我们采用差异PCR方法对2008年到2009年间采集的经普通PCR鉴定为PCV2型阳性的病料进... 详细信息

近年来我国猪场中猪圆环病毒2型的阳性率有所增加,给我国的养猪业带来了巨大的挑战.本研究主要是为了调查和分析我国猪2型圆环病毒两型间的共感染情况.我们采用差异PCR方法对2008年到2009年间采集的经普通PCR鉴定为PCV2型阳性的病料进行检测,对差异PCR方法扩增出来的部分PCV2a和PCV2b目的序列进行克隆、测序及分析.通过对70份临床病料的检测,并配合PCR产物测序的验证,结果发现该方法易操作,特异性高,可重复性好,可以鉴别出PCV2a与PCV2b,其中PCV2a株25份(25/70),PCV2b株23份(23/70),PCV2a与PCV2b共感染株22份(22/70),参照PCV2a或PCV2b的标准毒株,序列比对显示,我国的PCV2型毒株大多发生了很大的变异,包括碱基的变化及同源重组.本研究确定了我国猪场存在PCV2a与PCV2b的共感染情况,共感染率为31.4%.共感染机制及共感染是否会促进病毒的重组,是否会加重猪体的病情还需要进一步的研究.

关键词： PCV2a PCV2b 差异PCR 共感染同源重组

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猪白细胞介素4、6融合基因和CpG基序对猪蓝耳病疫苗免疫的强化效应

猪白细胞介素4、6融合基因和CpG基序对猪蓝耳病疫苗免疫的强化效应

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：陈建林杨肖王泽洲章欢程驰李栋王红宁李江凌高荣四川大学生命科学学院动物疾病防控与食品安全重点实验室成都610064 四川省动物疾病预防控制中心成都610007 四川省畜牧科学研究院成都610043

为探索新型高效安全的猪蓝耳病疫苗免疫佐剂,本实验用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒包裹猪融合基因PIL-46和CpG基序的真核表达质粒(CNP-(VRIL-46+VRlC)),将CNP-(VRIL-46+VRlC)肌注接种过猪蓝耳病灭活苗的长白川白杂交猪,接种后1、2、4、... 详细信息

为探索新型高效安全的猪蓝耳病疫苗免疫佐剂,本实验用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒包裹猪融合基因PIL-46和CpG基序的真核表达质粒(CNP-(VRIL-46+VRlC)),将CNP-(VRIL-46+VRlC)肌注接种过猪蓝耳病灭活苗的长白川白杂交猪,接种后1、2、4、6和8周采取实验猪静脉血,用Sandwich ELISA检测血清中白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6和IgG、IgA、IgM及特异抗体的含量,同时检测外周血液免疫细胞数量的变化。结果发现实验猪接种CNP-(VRIL-46+VRlC)后1-8周内,其血清中IL-2、IL-4、IL-6和IgG、IgA、lgM及特异抗体的含量较对照组均显著增多(P<0.05),淋巴细胞和单核细胞数量也明显升高(P<0.05),这些表明接种CNP-(VRIL-46+VRlC)的实验猪的特异体液和细胞免疫水平均显著多于对照组,提示PIL-46基因和CpG基序组合能显著增强猪的特异体液和细胞免疫机能,明显提高其免疫防御力,具有研制为高效安全的分子免疫增强剂的应用前景。

关键词：猪蓝耳病白细胞介素融合基因 CpG基序疫苗免疫佐剂强化效应

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猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：张朝霞刘长明危艳武袁婧黄立平中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001

用纯化的重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白作为检测抗原,建立了一种间接ELISA用于血清抗体检测。昆虫细胞株(Sf9)接种重组杆状病毒,对蛋白表达参数及纯化工艺进行了优化。制备了5批重组蛋白抗原,表达量占总蛋白的18.7％左... 详细信息

用纯化的重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白作为检测抗原,建立了一种间接ELISA用于血清抗体检测。昆虫细胞株(Sf9)接种重组杆状病毒,对蛋白表达参数及纯化工艺进行了优化。制备了5批重组蛋白抗原,表达量占总蛋白的18.7％左右;Ni2+亲和层析柱纯化获得重组蛋白回收率为1.7-1.9μg/108细胞,纯度为90.1％;重组蛋白可被特异性抗体识别,具有良好的免疫活性。建立的ELISA法对30份已知阴性血清样本检测临界OD值为0.343;ELISA与IPMA对150份血清进行平行检测符合率为95.3％(143/150),特异性为91.2％(31/34),敏感性为96.5％(112/116);其他几种常见猪病毒参考血清无交叉。组装的试剂盒批内和批间变异系数分别为4.0％-4.8％和8.9％-9.9％;置-20℃保存12个月稳定。试剂盒对人工感染猪血清检测结果,接种后第5w抗体阳转,第8w-9w抗体水平达到高;对来自黑龙江、吉林、河北、上海等地猪场1085份血清抗体检测,阳性率为73.6％,研制的ELISA试剂盒为临床PCV2血清抗体检测及疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

关键词：猪圆环病毒2型重组蛋白间接ELISA 抗体检测试剂盒纯化工艺

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猪圆环病毒2型ORF2与猪γ-干扰素基因的重组腺病毒转移载体的构建

猪圆环病毒2型ORF2与猪γ-干扰素基因的重组腺病毒转移载体的构建

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：刘根梅陈瑞爱韩静芳罗满林华南农业大学广东广州510642 广东大华农动物保健品股份有限公司广东新兴 527400 华南农业大学广东广州510642 广东大华农动物保健品股份有限公司广东新兴 527400

以重组腺病毒转移载体P-ORF2,P-γ-IFN为模板,应用Primer5.0设计了2对引物,其中一对引物P1,P2用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增,另一对引物P3,P4则用于γ-IFN基因的扩增。再以所扩增的2段基因为模板,P1,P4为引物扩增融合基因ORF2-γ-IF... 详细信息

以重组腺病毒转移载体P-ORF2,P-γ-IFN为模板,应用Primer5.0设计了2对引物,其中一对引物P1,P2用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增,另一对引物P3,P4则用于γ-IFN基因的扩增。再以所扩增的2段基因为模板,P1,P4为引物扩增融合基因ORF2-γ-IFN。将所扩增的串联基因连接PMD-18T-Simple Vector,经PCR方法和限制性内切酶分析鉴定该串联基因已成功转入重组质粒中(命为PMD-ORF2-γ-IFN)。腺病毒转移载体Pshuttle-CMV和PMD-ORF2-γ-IFN经双酶切后再切胶回收并连接后,经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明两基因已成功连接,由此获得了重组腺病毒转移载体Pshuttle-CMV-ORF2-γ-IFN。重组腺病毒转移载体经PmeI酶切线性化后,在BJ5173细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAD-CMV-ORF2-γ-IFN。经PCR方法和Pacl酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已得到成功构建。

关键词：猪圆环病毒2型 γ-干扰素转移载体重组腺病毒 ORF2基因

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猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

引用

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：张朝霞刘长明危艳武袁婧黄立平中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

用纯化的重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白作为检测抗原,建立了一种间接ELISA用于血清抗体检测。昆虫细胞株（Sf9）接种重组杆状病毒,对蛋白表达参数及纯化工艺进行了优化。制备了5批重组蛋白抗原,表达量占总蛋白的18.7... 详细信息

用纯化的重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白作为检测抗原,建立了一种间接ELISA用于血清抗体检测。昆虫细胞株（Sf9）接种重组杆状病毒,对蛋白表达参数及纯化工艺进行了优化。制备了5批重组蛋白抗原,表达量占总蛋白的18.7%左右;Ni亲和层析柱纯化获得重组蛋白回收率为1.7～1.9μg/10～8细胞,纯度为90.1%;重组蛋白可被特异性抗体识别,具有良好的免疫活性。建立的ELISA法时30份已知阴性血清样本检测临界OD值为0.343;ELISA与IPMA对150份血清进行平行检测符合率为95.3%（143/150）,特异性为91.2%（31/34）,敏感性为96.5%（112/116）;其他几种常见猪病毒参考血清无交叉.组装的试剂盒批内和批间变异系数分别为4.0%～4.8%和8.9%～9.9%;置-20℃保存12个月稳定。试剂盒对人工感染猪血清检测结果,接种后第5w抗体阳转,第8w～9w抗体水平达到高;对来自黑龙江、吉林、河北、上海等地猪场1085份血清抗体检测,阳性率为73.6%.研制的ELISA试剂盒为临床PCV2血请抗体检测及疫苗免疫效果的评价提供了技术手段.

关键词：猪圆环病毒2型重组蛋白间接ELISA 抗体检测试剂盒

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副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的克隆与表达及表达产物的免疫原性分析

副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的克隆与表达及表达产物的免疫原性...

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：朱小宁将大良余兴龙盛益颖李润成罗维葛猛刘俊奇刘春红肖利军湖南农业大学动物医学院长沙湖南 410128

根据已发表的副猪嗜血杆菌D15基因鸟枪序列NZ_ABKM01000005，设计一对特异性引物，以副猪嗜血杆菌5型SP毒株DNA为模板，通过PCR方法扩增出长约2400多bp的片段。将其进行T-A克隆，构建pETD15质粒并进行序列测定和分析。结果表明D15基因... 详细信息

根据已发表的副猪嗜血杆菌D15基因鸟枪序列NZ_ABKM01000005，设计一对特异性引物，以副猪嗜血杆菌5型SP毒株DNA为模板，通过PCR方法扩增出长约2400多bp的片段。将其进行T-A克隆，构建pETD15质粒并进行序列测定和分析。结果表明D15基因含有一个2418bp的开放阅读框，编码805个氨基酸。与D15参考基因序列及其推导的氨基酸序列比较，同源性分别为99.9％和99.8％。序列的5'端有一段18个氨基酸的信号肽，该序列C末端最后10个氨基酸残基：Q-F-Q-F-S-I-G-G-S-F，具有典型革兰氏阴性细菌外膜蛋白特征，对于蛋白定位于细菌外膜有重要意义。以pMDTD15质粒为模板，用PCR的方法扩增副猪嗜血杆菌D15基因，并将其克隆到pET-28a(+)中，构建得到pETD15原核表达质粒，将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后，用IPTG诱导重组菌，并用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物。结果表明，pETD15重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达，融合蛋白分子量约为94kDa，融合蛋白能被副猪嗜血杆菌阳性血清识别，具有反应原性。将表达的D15蛋白免疫昆明小鼠和豚鼠后，具有一定的保护效力。

关键词：猪细菌性疾病副猪嗜血杆菌外膜蛋白 D15基因原核表达免疫原性

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猪瘟病毒NS3基因克隆、原核表达及间接ELISA方法初步建立

猪瘟病毒NS3基因克隆、原核表达及间接ELISA方法初步建立

引用

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：蒋大良余兴龙李润成葛猛颜爱李杰刘春红刘俊琦湖南农业大学动物医学院

采用PCR方法从猪瘟病毒兔化弱毒（Hog Cholera Lapinized Virus HCLV）疫苗株cDNA中扩增到长度为2000bp左右NS3基因序列,将其克隆进原核表达载体pET32a（+）,构建重组原核表达载体pET-NS3.将pET-NS3转化进大肠杆菌Rosetta（DE3）进行优... 详细信息

采用PCR方法从猪瘟病毒兔化弱毒（Hog Cholera Lapinized Virus HCLV）疫苗株cDNA中扩增到长度为2000bp左右NS3基因序列,将其克隆进原核表达载体pET32a（+）,构建重组原核表达载体pET-NS3.将pET-NS3转化进大肠杆菌Rosetta（DE3）进行优化表达,采用SDS-PAGE分析NS3融合蛋白主要以包含体形式表达,分子大小约95 *** Blotting分析表明NS3融合蛋白具有免疫原性.采用Ni亲和层析方法纯化得到NS3融合蛋白（90%）.以纯化的NS3融合蛋白为抗原初步建立了检测CSFV NS3抗体的间接ELISA方法,对221份不同猪群和年龄的猪血清样品进行检测.将检测结果与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果进行对比,结果阳性符合率为83.33%,阴性符合率为89.38%,总符合率为86.43%.实验结果表明:重组原核表达载体pET-NS3构建成功,NS3融合蛋白在大肠杆菌Rosetta（DE3）中成功地表达,建立的间接ELISA检测结果与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果有较高一致性.

关键词： CSFV NS3 基因克隆原核表达融合蛋白蛋白纯化免疫印迹间接ELISA

来源：评论

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副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的克隆与表达及表达产物的免疫原性分析

副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的克隆与表达及表达产物的免疫原性...

引用

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：朱小宁余兴龙盛益颖李润成罗维葛猛刘俊奇刘春红肖利军将大良湖南农业大学动物医学院

根据已发表的副猪嗜血杆菌D15基因鸟枪序列NZBKM01000005,设计一对特异性引物,以副猪嗜血杆菌5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增出长约2400多bp的片段.将其进行T-A克隆,构建pETD15质粒并进行序列测定和分析.结果表明D15基因含有一个24... 详细信息

根据已发表的副猪嗜血杆菌D15基因鸟枪序列NZBKM01000005,设计一对特异性引物,以副猪嗜血杆菌5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增出长约2400多bp的片段.将其进行T-A克隆,构建pETD15质粒并进行序列测定和分析.结果表明D15基因含有一个2418bp的开放阅读框,编码805个氨基酸.与D15参考基因序列及其推导的氨基酸序列比较。同源性分别为99.9%和99.8%.序列的5′端有一段18个氨基酸的信号肽,该序列C末端最后10个氨基酸残基:Q-F-Q-F-S-I-G-G-S-F,具有典型革兰氏阴性细菌外膜蛋白特征,对于蛋白定位于细菌外膜有重要意义.以pMDTD15质粒为模板,用PCR的方法扩增副猪嗜血杆菌D15基因,并将其克隆到pET-28a（+）中,构建得到pETD15原核表达质粒,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG诱导重组菌,并用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物.结果表明,pETD15重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白分子量约为94kDa,融合蛋白能被副猪嗜血杆菌阳性血清识别,具有反应原性.将表达的D15蛋白免疫昆明小鼠和豚鼠后,具有一定的保护效力.

关键词：副猪嗜血杆菌外膜蛋白原核表达免疫原性

来源：评论

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