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洛克沙胂对土壤细菌nirS、nosZ、16S rDNA V3高变区基因多样性及其丰度的影响研究

洛克沙胂对土壤细菌nirS、nosZ、16S rDNA V3高变区基因多样性及...

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中国畜牧兽医学会动物毒物学分会第十三次学术研讨会

作者：白玲张草熊文广孙永学国家兽药安全评价(环境评估)实验室(华南农大) 华南农业大学兽医学院广州510642

[目的]洛克沙胂是在我国畜禽业被广泛使用的一种有机胂添加剂,在畜禽饲喂后经粪尿直接排放或以施肥而进入土壤和水体环境的排放量十分惊人,其给土壤质量及作物生长带来严重影响,并进威胁人类的健康。本文通过洛克沙胂对菜地土壤微生物... 详细信息

[目的]洛克沙胂是在我国畜禽业被广泛使用的一种有机胂添加剂,在畜禽饲喂后经粪尿直接排放或以施肥而进入土壤和水体环境的排放量十分惊人,其给土壤质量及作物生长带来严重影响,并进威胁人类的健康。本文通过洛克沙胂对菜地土壤微生物群落多样性的影响研究,为其应用后的生态风险评估提供实际依据。[方法]本文以田间地下0～20 cm菜地土壤为研究对象,经室内阴干3d后粉碎过2 mm筛,取12份各3 kg菜地土壤在人工气候箱孵育1～2周后,成功建立了室内人工模拟土壤生态系统,分别添加三个梯度浓度的洛克沙胂(15,75和150 mg/kg,以As计,各浓度设3个重复,并设立3个空白组)进行污染暴露胁迫试验。在第1、2、3、5和8周分别采集试验土样,采用BIOLOG、DGGE、qPCR等方法研究了洛克沙胂对土壤细菌碳利用功能多样性与16SrDNA V3高变区基因多样性、反硝化细菌nirS、nosZ基因多样性及其各基因丰度的影响,通过建立菜地土壤功能多样性指数、基因多样性指数及基因丰度在洛克沙胂暴露下的时间依赖性和剂量依赖性关系,对菜地土壤微生物群落代谢多样性及细菌总量变化情况进行评价。[结果](1)洛克沙胂能降低菜地土壤微生物群落的碳源代谢功能,包括代谢强度和代谢多样性,其抑制效应随洛克沙胂暴露浓度的升高而加强,在后期抑制效应逐渐减小;(2)菜地土壤细菌16S rDNA V3可变区、反硝化细菌nirS、nosZ基因的DGGE指纹图谱分析结果显示,在洛克沙胂暴露胁迫初期,各浓度下均出现部分条带消失而另一部分条带增强变亮现象,随着洛克沙胂浓度升高,其对土壤微生物基因多样性的影响逐渐增强;(3)经qPCR实时荧光定量分析结果显示,反硝化细菌nirS、nosZ基因丰度均出现明显下降,表明洛克沙胂能明显抑制菜地土壤反硝化细菌的生长,药物浓度越高其抑制效应越明显。[结论]洛克沙胂暴露胁迫能导致土壤微生物的碳源利用能力和多样性指数降低,并呈现剂量-效应依赖性关系;土壤总细菌16S rDNA V3高变区基因和反硝化细菌nirS、nosZ基因作为土壤微生物分子标志物,结合BIOLOG技术对土壤细菌碳源利用功能多样性的监测,可为洛克沙胂环境污染胁迫的早期预警与评价提供基础理论数据。

关键词：洛克沙胂土壤微生物群落多样性 BIOLOG

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ERK、JNK在镉经线粒体通路诱导神经细胞凋亡中的调控作用

ERK、JNK在镉经线粒体通路诱导神经细胞凋亡中的调控作用

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中国畜牧兽医学会动物毒物学分会第十三次学术研讨会

作者：江辰阳刘宗平张康保胡飞飞王棋文王怡袁燕顾建红刘学忠卞建春扬州大学兽医学院扬州 225009

[背景]镉(Cd)作为一种高毒性的重金属污染物,能引起包括脑在内的多种器官的严重损伤.镉能导致血脑屏障功能障碍,从而进入脑,导致儿童学习障碍和神经退行性疾病的发生.研究表明,镉能通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protei...

[背景]镉(Cd)作为一种高毒性的重金属污染物,能引起包括脑在内的多种器官的严重损伤.镉能导致血脑屏障功能障碍,从而进入脑,导致儿童学习障碍和神经退行性疾病的发生.研究表明,镉能通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径和线粒体途径引起神经细胞凋亡.线粒体是镉在细胞内关键的作用位点,镉能引起线粒体膜电位的降低,破坏线粒体膜的完整性,从而导包括细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)和核酸内切酶G(EndoG)在内的线粒体蛋白释放到胞质.但是,线粒体凋亡通路中MAPK的作用机制仍不清楚.[目的]在建立体外培养大鼠大脑皮质神经细胞模型和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)细胞系模型的基础上,通过添加不同的MAPK细胞信号通路抑制剂,揭示MAPK及其下游事件在镉经线粒体通路诱导神经细胞凋亡中的调控作用.[方法]为了探讨Cd在神经细胞凋亡中的作用,以不同浓度(0、5、10、20μmol/L)的Cd处理细胞24h,MTT法检测细胞存活率,Annexin V-FITC荧光染色法检测细胞凋亡率,Western blot法检测caspase-3和PARP的活化情况;为了证明线粒体通路在凋亡中的作用,Cd处理细胞24h后,分别提取细胞的胞浆成分和线粒体成分,Western blot法检测细胞色素C的释放和Bcl-2/Bax比值的变化,免疫荧光法检测AIF和EndoG核转移的情况;为揭示MAPK对线粒体通路的调控作用,分别使用ERK、JNK和p38MAPK的特异性抑制剂U0126、SP600125和SB202190与Cd联合作用细胞,检测细胞存活率、凋亡率,Western blot法检测caspase-3和PARP的活化情况,细胞色素C的释放和Bcl-2/Bax比值的变化,免疫荧光法检测AIF和EndoG核转移的情况.[结果]Cd在(0、5、10、20μmol/L)的浓度范围内能导致细胞存活率的下降,凋亡率的上升,caspase-3和PARP的活化,并存在剂量依赖效应,表明Cd能诱导两种细胞发生凋亡;不同浓度Cd作用细胞24h后,能引起Bcl-2/Bax比值的下降,细胞色素C的释放(p＜0.01),AIF和EndoG向细胞核转移,表明线粒体通路参与Cd诱导的细胞凋亡;与10μmol/L Cd处理组相比,ERK的抑制剂U0126、JNK的抑制剂SP600125与10μmol/L Cd联合作用细胞24后,能显著(p＜0.01)提高细胞的存活率,降低细胞的凋亡率,但p38MAPK的抑制剂SB202190对细胞无保护作用;U0126和SP600125能抑制Cd诱导的Bcl-2/Bax比值的下降,细胞色素C的释放以及AIF、EndoG的核转移.[结论]Cd能通过线粒体通路诱导神经细胞凋亡,包括caspase依赖和非依赖途径;ERK、JNK能调控Cd经线粒体通路诱导的神经细胞凋亡.

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细胞骨架在破骨细胞分化和骨吸收过程中的作用及分子机理

细胞骨架在破骨细胞分化和骨吸收过程中的作用及分子机理

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中国畜牧兽医学会动物毒物学分会第十三次学术研讨会

作者：宋瑞龙刘宗平刘学忠王启超张家铭高倩顾建红朱家桥袁燕仝锡帅扬州大学兽医学院扬州 225009

[背景]破骨细胞(OC)是造成骨质疏松的主要原因.是唯一具有骨吸收活性的细胞,由单核巨噬细胞融合而成,研究OC分化和骨吸收过程具有重要意义.在分化和骨吸收中,细胞骨架发生剧烈变化.研究表明封闭带的完整性对骨吸收起决定作用.RhoGTPase...

[背景]破骨细胞(OC)是造成骨质疏松的主要原因.是唯一具有骨吸收活性的细胞,由单核巨噬细胞融合而成,研究OC分化和骨吸收过程具有重要意义.在分化和骨吸收中,细胞骨架发生剧烈变化.研究表明封闭带的完整性对骨吸收起决定作用.RhoGTPases在细胞骨架的调节中扮演着重要角色.但其在OC分化和骨吸收中的变化尚不明确.RhoGEF和ROCK分别是它的上下游物质.OPG能强烈抑制前体细胞(pOCs)转化为OC,但OPG对封闭带的影响及分子机理尚未知.[目的]研究OC分化中细胞骨架和RhoGTPase表达的变化,及OPG对封闭带的影响和分子机理.[方法](1) RTCA;实验分两组,一组添加M-CSF和RANKL诱导剂,另一组为对照,用RTCA检测细胞指数(NCI)变化.(2) OC分化：以相同密度和诱导剂诱导细胞,第0天至第6天,TRAP染色和IF检测TRAP活性、细胞形态和骨架结构.另第0天至第5天提RNA,QRT-PCR检测OC标志酶TRAP, CK, DC-STMP及RhoGTPases的表达.(3) OPG对封闭带的影响：以相同密度和诱导剂诱导细胞,当封闭带形成后,添加0,20,40,80ng/ml的OPG处理10h,通过活细胞、IF和QRT-PCR检测形态学、封闭带及RhoGTPases表达.[结果]RTCA显示前3d的NCI无区别,第4,5天诱导组NCI迅速增大并远超对照组.TRAP染色显示pOCs 2d后有了TRAP活性,第4天突然形成大量带伪足OC,第5,6天变为边缘光滑无伪足.分化中,细胞融合变大,核增多并从中心分散到细胞边缘,有趣的是,细胞融合始于丝状伪足的融合,且有选择性.激光共聚焦显示,在pOCs分化为OC中,细胞骨架发生剧烈变化.在pOCs和未成熟的OC中,丝状伪足有3种,伪足小体由pOCs的点状分布,变成未成熟OC的簇状,进而变成成熟OC的封闭带,此时核分布在细胞边缘.QRT-PCR结果显示,Rac1,Rac2,cdc42Vl和RhoA是OC和pOCs中表达最高的四种,其中Rac1和cdc42V1表达量完全相同,在pOCs中,Rac1和cdc42表达量最高,但在OC中Rac2表达量最高.活细胞和IF染色显示,对照组封闭带完整,20ng/mlOPG处理组封闭带断裂,而40和80ng/ml处理组封闭带消失.QRT-PCR检测RhoGTPases,net1和ROCK的表达,发现RhoGEF,ROCK2和大部分RhoGTPases表达下降.[结论]在OC分化和骨吸收中,细胞骨架发生剧烈变化,RhoGTPases参与了其调节.细胞分化的研究显示Rac1,Rac2,RhoA和cdc42V1可能对细胞骨架起着重要作用.细胞融合始于丝状伪足的融合,而这种融合是选择性的,可能受Racl,Rac2,and FLNA的调节.另cdc42,RhoU和RhoF分别调节了三种不同丝状伪足.对骨吸收的研究显示,OPG能损害已形成的封闭带,进而抑制骨吸收.OPG能够通过抑制RhoGEF家族中的net1,进而减少RhoGTPases,然后减少ROCK2的表达,最后影响到封闭带的形成,抑制骨吸收.

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自噬在镉致神经细胞损伤中的作用及调控机理

自噬在镉致神经细胞损伤中的作用及调控机理

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中国畜牧兽医学会动物毒物学分会第十三次学术研讨会

作者：王棋文刘宗平王涛张康宝胡飞飞王怡袁燕顾建红刘学忠卞建春扬州大学兽医学院江苏扬州 225009 扬州大学兽医学院江苏扬州 225009 毕节学院毕节试验区研究院贵州毕节 551700

[背景]自噬是一种在进化上高度保守,依赖溶酶体降解长寿命蛋白、大分子和细胞器等物质的过程.环境应激可诱导细胞自噬的发生,自噬过程有助于维持细胞的动态平衡,防止生物体的损伤,但过量持续的自噬会破坏细胞内的细胞器和重要的蛋白质...

[背景]自噬是一种在进化上高度保守,依赖溶酶体降解长寿命蛋白、大分子和细胞器等物质的过程.环境应激可诱导细胞自噬的发生,自噬过程有助于维持细胞的动态平衡,防止生物体的损伤,但过量持续的自噬会破坏细胞内的细胞器和重要的蛋白质导致细胞死亡,这种死亡方式是非caspase依赖的程序性死亡.镉(Cd)是具有很强毒性的重金属,低浓度的镉就具有神经毒性,能严重影响神经系统的功能,体外研究表明镉可激活一系列级联反应,导致神经细胞发生凋亡和坏死,但在此过程中是否有自噬的参与,尚未见有相关文献报道.[目的]本研究以大鼠大脑皮质神经细胞和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)为模型,探讨Cd对两种细胞的毒性效应以及自噬在损伤中的作用和调节机制,进一步揭示镉的神经毒性作用机理.[方法]为检测Cd在处理两种细胞的过程中是否发生了自噬现象,以不同浓度(0、2.5、5、10、20μmol/L)的处理细胞24h,20μmol/L Cd处理不同时间(0～24h),MTT法检测细胞活性,Western印迹检测细胞LC3蛋白表达水平,免疫荧光观察LC3聚点现象,透射电镜观察自噬结构;为探讨自噬和凋亡的相互关系,电镜检测凋亡形态学变化,分别利用caspase抑制剂Z-VAD-fmk,自噬特异性阻断剂羟氯喹(CQ)和促进剂雷帕霉素(RAP)联合Cd作用细胞,流式细胞术测定细胞凋亡率变化;为研究自噬在Cd毒性损伤中的作用,分别利用CQ和RAP联合Cd作用细胞,检测LC3的表达变化,测定细胞活性;为探讨class Ⅲ PI3K/beclin-1/Bcl-2通路在Cd神经毒性中作用,检测Cd在不同浓度和不同时间以及以及联合PI3K激酶的特异性抑制剂LY294002后,class Ⅲ PI3K、beclin-1、Bcl-2和LC3的表达.[结果]随着Cd剂量的增加和处理时间的延长,细胞活性显著降低,呈明显的时间-效应和剂量效应关系;随着Cd剂量的增加,LC3Ⅱ的表达显著增加,20μmol/L Cd作用细胞4h后,LC3Ⅱ表达量最高,随后逐渐降低;20μmol/L Cd作用细胞4h,神经细胞发生明显的聚点现象(p＜0.01),出现典型的自噬体结构,表明Cd能诱导细胞发生自噬;20μmol/L Cd作用24h,细胞出现明显的凋亡现象,应用CQ,凋亡率显著升高(p＜0.01),应用Z-VAD-fmk和RAP,凋亡率显著降低(p＜0.01),表明自噬延迟了凋亡的发生;应用CQ和RAP,LC3Ⅱ的表达量均显著增加,CQ能降低细胞活性,而RAP使细胞活性增强,表明Cd诱导的自噬是保护性的;Cd能促进class Ⅲ PI3K、beclin-1、Bcl-2蛋白表达量升高,LY294002能明显降低classⅢ PI3K、beclin-1、Bcl-2、LC3的表达,表明PI3K/beclin-1/Bcl-2通路在Cd诱导的自噬中发挥正调控作用.[结论]Cd能诱导神经细胞发生保护性自噬,自噬可能通过延迟凋亡和激活PI3K/beclin-1/Bcl-2通路降低Cd造成的神经细胞毒性损伤.

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Effects of Fluoride and Sodium Sulfite on MAPK Pathway in Mice Testis

Effects of Fluoride and Sodium Sulfite on MAPK Pathway in Mi...

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中国畜牧兽医学会动物毒物学分会第十三次学术研讨会

作者： Jianhai Zhang Jiyin jin Chen liang Zilong Sun Ruiyan Yan Jinming Wang Xiaowen Wang Jundong Wang Shanxi Key Laboratory of Ecological Animal Science and Environmental Veterinary Medicine Shanxi Agricultural University Shanxi Taigu 030801 P.R.China

Sulfur dioxide (SO2) and SO2 derivatives colorless are ubiquitous environmental pollutant and an important chemical intermediate in several industrial and food product processes, also are closely related to toxical effect of fluoride in male ***-activated protein kinases (MAPKs) is one of the most interconnected pathways, and there are four major branches of the MAPK pathway include the classical MAPK pathway, c-Jun Nterminal kinase (JNK) and p38 MAPK pathway, and the ERK5 pathway, which play an important role in complex cellular programs like proliferation, reproduction, development, transformation, and *** order to explore if MAPK signal pathway involve in the reproductive toxicity mechanisms of fluoride and Sodium Sulfite, 72 healthy male Kunming mice were employed for Fluoride (150 mg/L NaF) and Sodium Sulfite (500 mg/L Na2SO3) exposure by drinking water alone or combination (150 mg/L NaF+500 mg/L Na2SO3) for 14 weeks, and the MAPK signal pathway (ERK1/2/5, JNK1/2/3 and p38) and transcriptional factors of JNK downstream (C-Jun, JunD, Elk-1 and ATF-2) expression levels were analyzed by Real-time RT-PCR in mice *** results showed that: (1) at 7 weeks after exposure, JNK2 mRNA expression levels decreased by 29.6%, 59.3% (P<0.01) and 56.8% (P<0.01), and ERK2 mRNA expression also significant down-regulated from 3 treated groups compared with the control group, ***, ERK1、 JNK1、 JNK3 and ERK5 mRNA expression had no significant changes;(2) At 14 week, JNK1 expression decreased by 39.1%, 61.8% (P<0.05) and 25.5%, JNK2 expression downed by 48.9%, 39.8% (P<0.01) and 37.5%, respectively, and that ERK5 expression increased significantly in treatment ***, ERK1, ERK2, JNK3 and p38 mRNA expression levels had no influenced distinctly by Fluoride, Sodium Sulfite or their combination;(3) Fluoride and Sodium Sulfite treatment for 14 weeks up-regulated obviously the transcriptional factors C-Jun and Jun D mRNA express

关键词： Fluoride and Sodium sulfite MAPK JNK Real-time PCR Testis

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宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离及鉴定

宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离及鉴定

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中国畜牧兽医学会动物毒物学分会第十三次学术研讨会

作者：张蕾蕾余永涛何生虎宁夏大学农学院动物科学系宁夏银川750021

[背景]黄花棘豆(Oxytropis ochrocephala Bunge)是一种疯草(豆科棘豆属和黄芪属有毒植物),广泛分布于我国宁夏、甘肃、青海、西藏等西部省区,动物长期或过量采食黄花棘豆会发生以神经系统机能紊乱为特征的慢性中毒病,表现为共济失调、...

[背景]黄花棘豆(Oxytropis ochrocephala Bunge)是一种疯草(豆科棘豆属和黄芪属有毒植物),广泛分布于我国宁夏、甘肃、青海、西藏等西部省区,动物长期或过量采食黄花棘豆会发生以神经系统机能紊乱为特征的慢性中毒病,表现为共济失调、四肢麻痹瘫痪、流产、不孕不育等症状,严重的会发生大批死亡.苦马豆素(swainsonine,SW)是黄花棘豆的主要毒性成分,它是一种吲哚里西啶生物碱,该生物碱能够抑制细胞内溶酶体α-甘露糖苷酶和高尔基体糖苷酶Ⅱ的活性,导致低聚糖代谢和功能性糖蛋白合成障碍,细胞发生空泡变性和组织器官功能紊乱.目前,SW在动物机体内的毒理作用机制和在疯草中的合成机制还未被阐明,因此,动物疯草中毒问题仍未能从根本上得到解决.近年研究表明,疯草中普遍存在一类能够产生SW的内生真菌.20世纪末,Braun等从3种美国疯草中均分离到一类能够产生SW的内生真菌,该类真菌生长特性和形态结构相近,根据真菌ITS序列信息,将其初步划分为链格孢属(Alternaria)真菌.后来,Braun等应用丙环唑诱导该类真菌产生分生孢子等形态结构,结合真菌的ITS、β-tublin等序列信息,将其进一步划分为埃里砖格孢属(Embellisia)真菌,并初步确定疯草中SW的含量和该类内生真菌感染的程度紧密相关.随后,我国学者王琦、卢萍、余永涛等从中国的疯草中分离到能够产SW的内生真菌.2009年Pryor等根据美国疯草中产SW内生真菌的形态特征及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gpd)、内部转录间隔区序列(internal transcribed space,ITS)、线粒体核糖体小亚基(mitochondrial small subunit rDNA,mt SSU)序列等序列信息,对产SW疯草内生真菌进行了系统的真菌分类学研究,将美国疯草中的产SW内生真菌重新划分为一个新的属——Undifilum,并统一命名为***.目前,国外学者已对内生真菌***与疯草中SW含量的关系进行了系统研究,认为***是疯草中SW产生的主要因素,与疯草的毒性紧密相关,抑制该类内生真菌在疯草中的生长和繁殖将有望消除或降低疯草的毒性.本研究对宁夏黄花棘豆中的产SW内生真菌进行了分离和筛选,诱导其产生分生孢子,克隆和测定真菌的gpd、ITS、mt SSU等基因序列,根据真菌形态和遗传进化分析结果对其进行重新的种属分类,为进一步研究疯草内生真菌合成SW的分子调控机理提供菌种和奠定基础.[目的]对宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌进行分离和鉴定,为进一步研究疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机理提供菌种和奠定基础.[方法]：分离并纯化黄花棘豆植物组织中的真菌,采用气相色谱质谱联用法对各菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能够产生苦马豆素的内生真菌;紫外线照射和黑暗交替培养诱导内生真菌产孢;提取真菌DNA,扩增和测定真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gpd)、内部转录间隔区序列(internal transcribed space,ITS)、线粒体核糖体小亚基(mitochondrial small subunit rDNA,mt SSU)序列,进行同源性比较和遗传进化分析,对其进行种属分类和命名.[结果]从宁夏黄花棘豆中共分离到5株真菌,其中菌株NX-FEL001菌丝中含有苦马豆素,经诱导培养,该菌株能够产生分生孢子及分生孢子梗等结构,序列同源性和系统发育分析表明该菌株与Undifilum真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析结果将菌株NX-FEL001鉴定为Undifilum oxytropis.[结论]宁夏黄花棘豆中存在产SW的内生真菌,经诱导培养,菌株NX-FEL001能够产生分生孢子及分生孢子梗等结构,序列同源性和系统发育分析表明该菌株与Undifilum真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析菌株NX-FEL001鉴定为Undifilum oxytropis.

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卵巢注射法制备Melittin转基因小鼠和鸡

卵巢注射法制备Melittin转基因小鼠和鸡

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第五次会员代表大会暨第十六次学术研讨会

作者：梁梓森左珂菁陈峰谢青梅

蜂毒肽(melittin,MLT)是蜂毒的主要成分,具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗艾滋病毒及抗辐射方面等作用。本研究通过卵巢直接注射法成功制备了MLT转基因小鼠和鸡,主要内容如下:(1)对MLT基因进行改造:第七位Lys改为Arg,将第八位Val改为Gly,去除... 详细信息

蜂毒肽(melittin,MLT)是蜂毒的主要成分,具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗艾滋病毒及抗辐射方面等作用。本研究通过卵巢直接注射法成功制备了MLT转基因小鼠和鸡,主要内容如下:(1)对MLT基因进行改造:第七位Lys改为Arg,将第八位Val改为Gly,去除第十三位Leu加大疏水力矩,降低溶血性。将改造后的基因插入质粒pVAX1的多克隆酶切位点区,构建pVAX1-MLT真核表达质粒,大量抽提,得到高纯度卵巢注射用真核质粒并测定浓度。(2)取12只体重相近的雌性昆明白小鼠,随机平均分为三组。通过外科手术将pVAX1-MLT质粒注射到小鼠卵巢内,第一组每侧卵巢注射质粒浓度为50ng/μL的质粒5μL,第二组每侧卵巢注射质粒浓度为100ng/μL的质粒5μL,第三组每侧卵巢注射PBS缓冲液5μL,手术恢复后与雄鼠自然交配。取子代小鼠尾部组织提取基因组,用PCR方法检测基因组阳性率:第一组为72.97%(27/37),第二组为75.76%(25/33)。PCR产物测序结果与已知的MLT基因序列吻合度为100%。对MLT基因在子代小鼠中的表达进行检测,取1只PCR检测阳性小鼠,通过RT-PCR检测证实子代小鼠的肝脏、肾脏和卵巢中有MLT基因转录水平上的表达,在心脏中未见MLT基因的表达,说明转基因小鼠中外源基因的表达有组织差异性。子代小鼠皆健康存活。(3)通过外科手术将质粒pVAX1-MLT质粒注入110d麻鸡卵巢,待试验母鸡开产后,每3d对其人工授精,收集种蛋,进行孵化。取10d子代小鸡翅膀的肌肉组织,提取基因组,用PCR方法检测子代基因组阳性率为34.8%(69/198)。取2只PCR阳性小鸡的心脏、肝脏、肾脏和卵巢抽提RNA,用RT-PCR检测转录基因的表达情况,结果显示1只小鸡MLT基因在心脏、肝脏、肾脏和卵巢中皆有表达,另1只鸡MLT基因在肝脏、肾脏和卵巢中表达,而心脏检测结果为阴性。免疫荧光检测实验中所检测的PCR阳性小鸡,其心脏、肝脏、肾脏和卵巢检测结果皆为阳性。实验结果表明,通过卵巢直接注射法可成功制备MLT转基因小鼠和鸡。卵巢注射法具有简便、高效、花费低等优点,是一种具有广阔应用前景、可用于制备各种转基因动物的优良转基因技术。实验结果为建立生物反应器生产药用蛋白、拓宽抗微生物肽的应用前景提供一条简便可行的新途径,为培育高产、优质、抗病力强的动物新品种提供具有重要参考价值的新方法。

关键词：蜂毒肽卵巢注射转基因鸡转基因小鼠

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：舒一中国畜牧兽医学会动物传染病学分会