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Poly(I:C)通过IFIT3作用IFN-β抑制PRRSV复制

Poly(I:C)通过IFIT3作用IFN-β抑制PRRSV复制

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：张莉莉刘捷白娟杜以军王先炜刘星姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起世界养猪业巨大经济损失主要病原之一,目前商品化疫苗和抗病毒药物保护力有限。三角形四肽重复干扰素诱导蛋白3(IFIT3)被认为是一种新的抗病毒蛋白,对先天性免疫具有重要调节作用。猪肺泡巨噬细胞感... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起世界养猪业巨大经济损失主要病原之一,目前商品化疫苗和抗病毒药物保护力有限。三角形四肽重复干扰素诱导蛋白3(IFIT3)被认为是一种新的抗病毒蛋白,对先天性免疫具有重要调节作用。猪肺泡巨噬细胞感染PRRSV后IFIT3明显增加,但IFIT3在PRRSV复制中的作用尚不清楚。采用双链RNA类似物poly(I:C)作为刺激物,在Marc-145细胞上系统地观察IFIT3在PRRSV复制过程中作用,结果显示:双链RNA类似物poly(I:C)刺激Marc-145细胞可以抑制PRRSV复制,而IFIT3表达量明显增加;过量表达猪IFIT3能显著抑制PRRSV复制,干扰Marc-145细胞中内源性IFIT3的表达,利于PRRSV增殖,且同时破坏了poly(I:C)介导的抗病毒功能;过量表达猪IFIT3可以显著增加poly(I:C)诱导的IFN-β启动子活性,相反,干扰Marc-145细胞中内源性IFIT3可以抑制poly(I:C)诱导的IFN-β启动子活性;poly(I:C)能激活Marc-145细胞中IFIT3、TBK1和磷酸化IRF3的表达。此外,尽管poly(I:C)刺激的Marc-145中IFIT3与PRRSV核衣壳(N)蛋白在细胞浆中存在共定位现象,但是共沉淀结果表明二者之间无相互作用。本研究结果表明,Poly(I:C)通过IFIT3介导MAVS信号通路抑制PRRSV复制,从而为PRRSV新型疫苗和抗病毒药物研究奠定了基础。

关键词： PRRSV IFN-β poly(I:C) IFIT3

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表达PRRSV GP5蛋白重组减毒猪霍乱沙门菌C78-1构建及生物学特性

表达PRRSV GP5蛋白重组减毒猪霍乱沙门菌C78-1构建及生物学特性

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：张淼丹张明亮张春杰张俊峰贾艳艳何雷程相朝河南科技大学动物疫病与公共安全重点实验室

为了构建表达猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒PRRSVGP5蛋白口服重组减毒猪霍乱沙门氏菌活载体疫苗株,通过PCR克隆去除信号肽序列的PRRSVORF5基因,将其插入到表达载体pYA3493中,构建了重组质粒pYA3493-dORF5。将该重组质粒电转入猪霍乱沙门... 详细信息

为了构建表达猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒PRRSVGP5蛋白口服重组减毒猪霍乱沙门氏菌活载体疫苗株,通过PCR克隆去除信号肽序列的PRRSVORF5基因,将其插入到表达载体pYA3493中,构建了重组质粒pYA3493-dORF5。将该重组质粒电转入猪霍乱沙门菌基因缺失株(缺失crp,asd基因),获得PRRSVORF5基因减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpasdC78-1(pYA-dORF5)重组菌。通过对重组菌表型性状、生长特性、稳定性及安全性和定制能力进行测定,并对重组菌表达的GP5蛋白进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果显示,该菌株保留了在DAP阴性环境中生存的能力;不能利用麦芽糖、蔗糖及果糖等碳源,但保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度低于强毒株C78-1,而与crpasdC78-1相比变化不明显;在体外连续传代能够稳定遗传dORF5目的基因片段。Western-blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;通过口服途径与强毒株C78-1及猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株C500相比,crpasdC78-1(pYA-dORF5)毒力分别下降492倍和1.3倍。通过侵袭力实验测得重组菌在血液,肠系膜淋巴结和脾脏均定植能力良好。结果表明,成功构建了能稳定表达PRRSVGP5蛋白的口服重组减毒猪霍乱沙门菌,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定了良好的基础。

关键词：重组减毒猪霍乱沙门菌 PRRSV ORF5 生物学特性

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银川某牛场牛源金黄色葡萄球菌的分离鉴定、耐药性分析及毒力基因的检测

银川某牛场牛源金黄色葡萄球菌的分离鉴定、耐药性分析及毒力基因...

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中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第八届会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：达举云宋倩史金莲李怡娜李宗帅陈艳卢挺张勇甘肃农业大学动物医学院甘肃动物生殖生理及繁殖调控重点实验室

引言奶牛乳房炎是奶牛场最常见的三大疾病之一,其对动物健康福利和牧场经济效益产生了严重的影响。根据研究表明,金黄色葡萄球菌则是引起乳房炎的最主要病原菌,金黄色葡萄球菌干扰免疫系统和以抗生素为主的治疗方式,是导致金黄色葡萄球... 详细信息

引言奶牛乳房炎是奶牛场最常见的三大疾病之一,其对动物健康福利和牧场经济效益产生了严重的影响。根据研究表明,金黄色葡萄球菌则是引起乳房炎的最主要病原菌,金黄色葡萄球菌干扰免疫系统和以抗生素为主的治疗方式,是导致金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎更加难以治疗的原因。本试验采用Baird-Parker琼脂选择性培养基分离培养金黄色葡萄球菌,通过形态学鉴定、生化鉴定和16S rDNA相结合的方法鉴定金黄色葡萄球菌,通过PCR技术分析该牛场引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌对11种抗生素的耐药状况,检测MRSA菌株的流行情况、7种耐药基因的携带情况,

关键词：金黄色葡萄球菌耐药性分析耐药基因毒力基因分离鉴定

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Porcine mesenchymal stem cells:Isolation,characterization and their in vivo applications

Porcine mesenchymal stem cells:Isolation,characterization an...

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中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会

作者： Gyu-Jin Rho College of Veterinary Medicine Gyeongsang National University

Mesenchymal stem cells(MSCs) hold a great promise for cell based therapies due to their self-renewal capacity and broader differentiation potential into various cell *** is further supported by the fact that MSCs are largely accessible from various adult tissues with easy purification and proliferation in ***,the similarities in organ physiology,size and genetic characteristics between pigs and human offer an ideal model system to evaluate the function,phenotype,molecular and biological properties of porcine MSCs under in vitro and in vivo conditions. A series of studies in our lab employed porcine MSCs isolated from various tissue sources such as umbilical cord matrix(UCM),bone marrow,skin,adipose and ovarian tissues, and characterized their multilineage potential in *** addition,porcine MSCs were also evaluated for their ability towards in vivo osteogenesis,neurogenesis and oogenesis using animal *** isolation,the plastic adherent cells in primary culture exhibited a typical fibroblast-like morphology with higher proliferation potential and formed colonies with cluster of *** cells showed alkaline phosphatase(AP) activity and represented a relatively lower population at G0/G1 state of the cell *** from all sources were strongly positive for cell surface markers,such as CD29,CD44,CD90 and vimentin and exhibited a relatively lower expression of cytokeratin and immunophenotype markers,namely MHCⅡand ***,the expression of pluripotency markers,such as Oct-3/4,Nanog and Sox-2 was observed in all types of MSCs both at mRNA and protein levels. Upon induction in specific media,all MSCs were successfully differentiated into mesenchymal and ectodermal lineages along with the expression of markers and genes involved in specific *** 3-4 weeks of culture in specific media,MSCs revealed the appropriate phenotype of differentiated cells including osteocytes(von Kossa and alizarin red),adipocytes(oil red 0) an

关键词： Mesenchymal stem cells Osteogenesis Neurogenesis Oogenesis In vitro and in vivo study Pig

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Effects of growth-promoting factors on long-term proliferation of mouse spermatogonial stem cells(SSCs)

Effects of growth-promoting factors on long-term proliferati...

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中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会

作者： Zhi-Guo Fan~1,Rui-Kai Lv~1,Jian-Hong Hu~1,Zhong-Liang Jiang~1, Qing-Wang Li~(1,2),Yu Liu~1,Jin-Xin Mo~1,Zhe Qiang~1 1 College of Animal Science and Technology,Northwest A & F University,Yangling,Shaanxi 712100,P.R.China 2 College of Environment and Chemistry Engineering,Yanshan University,Qinhuangdao,Hebei 066004,P.R.China

To investigate the influence of growth-promoting factors,including EGF,IGF-1 and FGF,on the proliferation of mouse SSCs,21 kinds of culture methods,including single factor groups,double factors combinations and triple factors combinations,were designed to culture SSCs ***,the results were significantly *** the third passage of mouse SSCs was cultured for 4 days,the highest percentage of SSCs proliferation was 40.30%, yet the lowest level was 11.20%(p< 0.01) on single factor groups,the highest percentage of SSCs proliferation was 61.50%,yet the lowest level was 37.51%(p < 0.01) on double factors combinations,the highest percentage of SSCs proliferation was 56.53%,yet the lowest level was 39.72%(p < 0.01) on triple factors *** these data,we can find that single factor EGF(lOng/ml) was able to promote distinctly the SSCs proliferation,whereas the double factors EGF(20ng/ml),IGF-1(20ng/ml) combinations and the triple factors EGF(20ng/ml),IGF-1(20ng/ml), FGF(1Ong/ml) combinations were optimal combinations *** confirm that moderate single factor and the proportionate appropriately multi-factors combinations can promote abundantly the SSCs proliferation in vitro.

关键词： Spermatogonial stem cells Proliferation EGF IGF-1 FGF

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主动免疫抑制素对水牛卵泡发育、超排反应和相关激素分泌的影响研究

主动免疫抑制素对水牛卵泡发育、超排反应和相关激素分泌的影响研...

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中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会

作者：李德如覃广胜覃永长苇英明黄群山蒋和生施振旦华南农业大学动物科学学院广西水牛研究所广西大学

选25头具有正常发情周期的高产水牛,随机分为高剂量组10头、低剂量组8头、对照组7头。高剂量组首次免疫重组猪INH-亚基融合蛋白2mg/头,首次后第28和第56天分别进行加强免疫,剂量为1mg/头,同期对低剂量组进行免疫,免疫原用量为高剂量组... 详细信息

选25头具有正常发情周期的高产水牛,随机分为高剂量组10头、低剂量组8头、对照组7头。高剂量组首次免疫重组猪INH-亚基融合蛋白2mg/头,首次后第28和第56天分别进行加强免疫,剂量为1mg/头,同期对低剂量组进行免疫,免疫原用量为高剂量组的一半,对照组牛同期注射矿物油与生理盐水混合佐剂。在第二次加强免疫后11天,采用FSH 4日递减法同时对实验组和对照纽进行超排处理,并根据发情表现进行人工输精,输精后第6天收集胚胎。结果显示:主动免疫抑制素促进了卵泡发育;提高了免疫后血液雌二醇、孕酮和活化素浓度。而且免疫抑制素组的头均获胚/卵总数(4.40±1.23和4.12±1.04 VS 2.86±0.75)和头均可利用胚胎数(3.40±1.18和3.21±1.24 VS 1.54±1.13)都显著高于对照组(P<0.05)。从超排后的第8天开始,免疫组和对照组孕酮的浓度和黄体的数目都高度相关(r=0.72,r=0.68,P<0.05),而活化素浓度高的实验牛则会产生更多的可移植胚胎数。以上数据表明:主动免疫抑制素可以促进水牛卵泡发育,提高超排后的可移植胚胎数和可移植胚率。

关键词：水牛免疫抑制素超数排卵

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PRRSV不同毒力毒株诱导Toll样受体和细胞因子表达特性的比较

PRRSV不同毒力毒株诱导Toll样受体和细胞因子表达特性的比较

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：张莉莉刘捷白娟王晓晔李玉峰姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因容易变异,不同流行毒株毒力差异较大,造成严重经济损失,但其免疫和致病机制尚不清楚。本研究将24头仔猪平均分成4组,每组6头,分别接种高致病性PRRSV分离株BB0907(HP),低毒力PRRSV毒株NT0801(LP),NT080... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因容易变异,不同流行毒株毒力差异较大,造成严重经济损失,但其免疫和致病机制尚不清楚。本研究将24头仔猪平均分成4组,每组6头,分别接种高致病性PRRSV分离株BB0907(HP),低毒力PRRSV毒株NT0801(LP),NT0801第70代衍生毒株NT0801-F70(LP-der)和DMEM营养液(对照),隔离饲养观察。攻毒后0、6、9、15天用ELISA方法检测猪血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10含量;攻毒后15天用Real-timePCR方法检测各组肺脏和脑组织中TLR2、3、7和8基因表达水平,并分离猪肺泡巨噬细胞(PAMs)和猪外周血淋巴细胞(PBMCs),分别采用TLR2、3、7/8的配体(LTA、poly(I:C)、CL097)和PRRSV刺激,检测细胞上清中细胞因子水平。结果为:与LP相比,HP组试验猪产生明显临床症状,而LP-der几乎没有毒力;HP感染猪的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平高于LP或者LP-der组。LP组PAMs经poly(I:C)或CL097刺激后分泌的TNF-α和IL-1β水平显著高于DMEM营养液对照组,同时,HP组PBMCs经CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6显著高于LP和LP-der组。HP组PBMCs经CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6高于LP和LP-der组,LP组PAMs经poly(I:C)、CL097刺激后TNF-α和IL-1β的分泌高于DMEM组。该结果表明,与LP和LP-der相比,HP更能诱导TLR3、7、8和TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ表达,从而丰富了PRRSV免疫和致病机制理论,并有助于开发更为有效的PRRSV疫苗。

关键词： PRRSV 免疫原性致病性 TLRs 细胞因子

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猪Toll样受体配体对PRRSV免疫佐剂作用

猪Toll样受体配体对PRRSV免疫佐剂作用

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：张莉莉白娟刘捷王晓晔李玉峰姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室

猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)给全球养猪业造成了巨大的经济损失,目前商品化疫苗仅能提供部分保护力。近来关于人和猪的一些研究表明Toll样受体(TLR)的配体有免疫佐剂效应,如合成的双链RNA(dsRNA)[poly(I:C)]、脂磷壁酸(LTA)和CL097... 详细信息

猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)给全球养猪业造成了巨大的经济损失,目前商品化疫苗仅能提供部分保护力。近来关于人和猪的一些研究表明Toll样受体(TLR)的配体有免疫佐剂效应,如合成的双链RNA(dsRNA)[poly(I:C)]、脂磷壁酸(LTA)和CL097。为了研究这些化合物是否诱导PRRSV特异性免疫应答效果,本试验采用PRRSV灭活病毒液(KV)与TLR配体组合后皮下免疫小鼠。结果表明,单独的poly(I:C)和CL097诱导小鼠IFN-γ和PRRSV特异性抗体水平高于KV组或KV-LTA组。将20头6周龄PCV2和PRRSV抗原、抗体均阴性的断奶仔猪,随机分为4组,第1组接种由100μgpoly(I:C)、80μgDOTAP和灭活病毒配制而成的灭活苗,第2组接种8μgCL097、80μgDOTAP和灭活病毒配制而成的灭活苗,第3组接种的是灭活病毒配制而成的灭活苗,第四组接种DMEM。每头猪通过颈部肌肉进行免疫,首免后2周加强免疫一次。首免后14天和28天,采血分离血清,用于PRRSV抗体及细胞因子(IL-4和IFN-γ)的检测;同时分离外周血淋巴细胞,测定淋巴细胞增殖反应,并测定细胞分泌细胞因子(IL-4和IFN-γ)的量。首免后28天,肌肉接种2×105.0TCID50 PRRSVS Y0608病毒液。攻毒后隔离饲养,每天观察仔猪临床表现,测量直肠温度。攻毒后第7、14和21天采血分离血清,用于病毒及抗体的检测。攻毒后第21天扑杀所有试验猪,采集肺脏组织,并进行病理学检查。结果为,KV混合poly(I:C)或CL097后诱导猪体产生的PRRSV特异性抗体和T淋巴细胞增殖水平高于KV组。攻毒后,与KV或对照组相比,KV-poly(I:C)或-CL097免疫组患猪产生的临床症状较轻、病毒血症更低、肺部的病理损伤更少。表明KV-poly(I:C)或-CL097能提高抵抗PRRSV的保护力。TLR3和TLR7/8的配体为新PRRSV疫苗的开发提供了候选佐剂。

关键词： PRRSV 灭活病毒(KV)疫苗 TLR配体佐剂

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H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异毒株的致病性研究

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异毒株的致病性研究

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：赵军王新卫王川庆陈陆郑鹿平王泽霖河南农业大学禽病研究所

作者在研究1998～2008年中国H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株HA基因的进化时发现有2个致病性最强的毒株因HA基因第145位氨基酸的突变导致产生一个潜在的糖基化位点,从而使其不与单抗H6、F6等反应。为进一步探究这类变异毒株HA基因变异对H... 详细信息

作者在研究1998～2008年中国H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株HA基因的进化时发现有2个致病性最强的毒株因HA基因第145位氨基酸的突变导致产生一个潜在的糖基化位点,从而使其不与单抗H6、F6等反应。为进一步探究这类变异毒株HA基因变异对H9亚型AIV的致病性的影响,本研究对12株具有上述血凝素分子特征的H9流行毒株进行了致病性方面的系统研究。结果显示这类毒株在HA裂解位点处仅有1个碱性氨基酸,均为典型的低致病性AIV毒株,但145位氨基酸均发生漂变(S→N),导致在145～147aa多了一个糖基化位点NGT,并丧失了与单抗的血凝抑制反应特性。该类毒株对SPF鸡胚、鸡和细胞的致病力大大增强,EID50、ELD50为10-8.0～-9.5/0.2ml,高于疫苗株1～2滴度;MDT/MLD最低,多数在60～80h;1日龄SPF鸡的ICPI为0.23～1.7,6周龄SPF鸡的IVPI为0.21～1.1,而疫苗株均为0;可以在不加胰酶的CEF、CEK、DF-1、MDCK单层细胞上不经适应而直接繁殖,12～24h出现病变。人工感染SPF鸡或免疫鸡,从第2天起均可从咽喉、泄殖腔分离到病毒,免疫抗体或同源抗体均不能阻止其攻毒后的排毒。表明这类毒株致病性的增加与HA基因的变异密切相关。因HA基因145-147aa位增加了一个NGT,蛋白结构分析显示血凝素头部蛋白减少了一个β折叠。三维空间构象的变化导致抗HA抗体作用位点的变异或缺失,并影响其邻近的受体结合位点,从而改变该毒株的抗原性和其它生物学特性。这是一类HA蛋白S145位发生变异的毒株,虽然约占当前流行毒株总数的5%-7%,但它更能抵抗机体的防御机制,因而有更大的生存空间。在强大的免疫压力和自然选择下这类毒株有可能逐步成为优势毒株,造成更大的危害,这为该病的防控提出了新的挑战。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒变异毒株 HA基因糖基化位点致病性

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脑心肌炎病毒VP1蛋白B细胞表位解析与阻断ELISA抗体检测方法的建立

脑心肌炎病毒VP1蛋白B细胞表位解析与阻断ELISA抗体检测方法的建立

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：陈兴慧何庆东白娟王先炜姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室

脑心肌炎病毒(EMCV)可引起仔猪的急性致死性心肌炎和母猪的繁殖障碍等疾病,并具有重要公共卫生学意义。本研究采用杂交瘤细胞技术,研制获得18株能稳定分泌抗EMCV抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清ELISA抗体效价为1:1600～1:6400,小鼠腹... 详细信息

脑心肌炎病毒(EMCV)可引起仔猪的急性致死性心肌炎和母猪的繁殖障碍等疾病,并具有重要公共卫生学意义。本研究采用杂交瘤细胞技术,研制获得18株能稳定分泌抗EMCV抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清ELISA抗体效价为1:1600～1:6400,小鼠腹水抗体效价达1:1000000。15株单抗的亚类为IgG1,3株单抗的亚类为IgG2b,所有单抗的轻链均为κ型。Westernblot结果表明,其中17株能特异性识别病毒VP1蛋白,2B6株能识别病毒VP2蛋白。IFA结果为,11株单抗都能识别EMCV。利用原核表达系统,对VP1蛋白进行截短表达,结果获得41个重组截短蛋白,采用间接ELISA和Westernblot精确定位了17株单克隆抗体所识别的抗原表位,结果共鉴定出5个抗原表位:V(2)ENAEK(7)(单抗6E11、7A7和7C9识别),A(17)DFVA(21)(单抗2C8识别),F(19)VAQPVY(25)(单抗1D1、1F3、2A2、2A5、4B2、4B9、4F1、5A1、5A11和5G1识别),P(42)IGAFTVK(49)(单抗1G8和3A9识别)和F(36)YDRSSPIGAFTVKS(50)(单抗4E2识别)。选择EMCVVP1单抗7C9进行辣根过氧化物酶标记,应用纯化的EMCV重组VP1蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了检测EMCV抗体的阻断ELISA方法。通过对30份EMCV阴性血清检测,确定其判定标准为:阻断率PI≥39.10%时为阳性,PI≤29.46%时为阴性,29.46%﹤PI﹤39.10%时为可疑。30份临床血清样品检测结果显示,该方法与中和试验符合率为90%,且阻断ELISA的敏感性高于血清中和试验。该方法与口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等参考阳性血清均无交叉反应;批内和批间重复性试验结果显示变异系数均小于10%。应用该阻断ELISA方法检测我国不同猪群580份血清,EMCV抗体阳性率为41.03%。本研究为VP1蛋白功能研究和EMCV诊断方法研究建立奠定了较好基础,具有较好应用前景。

关键词：脑心肌炎病毒单克隆抗体 VP1蛋白 B细胞表位阻断ELISA

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