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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：白方方武昱孜靳蒙蒙刘茂军冯志新熊祺琰邵国青江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心

应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法。在特异性检测试验中,设计的引物不能... 详细信息

应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法。在特异性检测试验中,设计的引物不能扩增出猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒及猪呼吸与繁殖综合症病毒等病原体;敏感性试验表明,第一次PCR和第二次PCR的敏感度分别为3.01mg/L和3.01×10-4mg/L。对41份临床样品肺组织的检测中,普通PCR和巢式PCR的检出率分别为29.3%(12/41)和82.9%(34/41)。结果表明巢式PCR方法明显优于常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性,为猪鼻支原体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。

关键词：猪鼻支原体巢式PCR 检测

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一株绵羊边界病病毒的分离鉴定

一株绵羊边界病病毒的分离鉴定

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：刘霞毛立李文良杨蕾蕾张纹纹魏建忠江杰元江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心安徽农业大学动物科技学院

本实验从华东地区某羊场采集定点监测的绵羊血液样品,通过RT-PCR方法检测瘟病毒5’-UTR基因,证实一只绵羊感染BDV。阳性血清样品接种MDBK细胞,盲传8代后观察,该毒株不致细胞病变。用BDV特异性Npro基因引物检测细胞培养物RNA,在第6-8代... 详细信息

本实验从华东地区某羊场采集定点监测的绵羊血液样品,通过RT-PCR方法检测瘟病毒5’-UTR基因,证实一只绵羊感染BDV。阳性血清样品接种MDBK细胞,盲传8代后观察,该毒株不致细胞病变。用BDV特异性Npro基因引物检测细胞培养物RNA,在第6-8代细胞培养物中获得预期大小片段,测序分析表明成功分离出一株BDV,将其命名为JSLS12-01。5’-UTR和Npro基因系统进化分析显示,该分离株与BDV3参考毒株亲缘关系最近,同源性最高分别为87.7%和75.8%。临床观察BDV检测阳性绵羊,在确诊后6个月内,该羊表现明显的生长缓慢症状。结果证实,本实验从生长缓慢的绵羊鉴定并分离到一株ncp型BDV,经序列分析表明该毒株属于BDV3亚型。

关键词：边界病病毒分离鉴定

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利用iTRAQ技术研究PCV2感染PAMs胞内蛋白和信号通路的变化

利用iTRAQ技术研究PCV2感染PAMs胞内蛋白和信号通路的变化

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2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会

作者：陈萌萌韩俊源张亚群张书霞南京农业大学南京210095

目的:研究PCV2感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后胞内蛋白变化，揭示PCV2所引起免疫抑制的机制.方法:选取PCV2和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性的普通断奶仔猪,分离和培养猪肺泡巨噬细胞(PAMs),分为试验组和对照组,试验组P... 详细信息

目的:研究PCV2感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后胞内蛋白变化，揭示PCV2所引起免疫抑制的机制.方法:选取PCV2和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性的普通断奶仔猪,分离和培养猪肺泡巨噬细胞(PAMs),分为试验组和对照组,试验组PAMs用PCV2感染,对照组PAMs 加等量的细胞培养液,并于感染后第12h、24h和48h收集PAMs,用间接免疫荧光法检测PCV2感染PAMs情况,采用定量蛋白质组学技术——相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)技术结合Nano-LC-MS/MS,采用David在线对差异蛋白进行功能注释聚类分析,运用KEGG对差异蛋白参与的信号途径分析.结果及结论:PCV2感染后12h、24h和48h,PAMs中均见有PCV2抗原,并随感染时间而逐渐增加;3个不同时间点,表现出有显著改变的差异蛋白218个,其中显著上调92个,显著下调120个,这些差异表达蛋白分别与细胞结构,细胞内信号传导,细胞黏附和结合等生物过程相关;KEGG分析发现,差异蛋白涉及的4条信号途径具有一定显著性(P＜0.05),包括核糖体、系统性红斑狼疮和缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸降解和间隙连接.定量蛋白质组学的研究结果,为进一步研究相关蛋白在PCV2的致病性方面提供了依据.

关键词：猪圆环病毒2型感染免疫抑制猪肺泡巨噬细胞信号通路定量检测

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PRRSV感染PAM中猪FcγRⅢ介导的免疫抑制反应

PRRSV感染PAM中猪FcγRⅢ介导的免疫抑制反应

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：杨青原秦运杰王冬梅杜东颖夏平安杨明凡崔保安河南农业大学牧医工程学院兽医微生物实验室

为了研究猪FcγRⅢ介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)免疫抑制反应,本研究采用将含有200个TCID50的PRRSV、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(100ng/mL)和纯化鼠抗猪FcγRⅢ IgG(550μg/ml)分别处理PAM细胞;同时用纯化鼠抗猪FcγRⅢIgG(550μg/ml)处理PAM细胞后接种含有200个TCID50的PRRSV,并设健康细胞对照组。各组分别培养12h、24h、36h、48h、60h、72h后收集细胞及上清,用已经建立的绝对荧光定量PCR方法检测接毒组PAM细胞中不同时间段内PRRSV复制水平,用相对荧光定量PCR检测各组PAM细胞中IFN-α、TNF-αmRNA转录水平。结果显示,PRRSV在感染PAM细胞后12-24h期间PRRSV促进IFN-α的mRNA水平,36-72h期间PRRSV抑制IFN-α的mRNA水平,之后IFN-α的mRNA水平恢复正常;TNF-αmRNA水平在感染后12h-72h均略微上调。LPS处理PAM细胞后,IFN-α、TNF-α的mRNA水平均上调。用纯化鼠抗猪FcγRⅢ IgG处理猪PAM后,选择性激活猪PAM细胞表面FcγRⅢ,数据显示IFN-α、TNF-αmRNA水平显著下调,表明猪FcγRⅢ信号途经能够抑制宿主细胞的先天性抗病毒免疫反应;PRRSV感染选择性激活猪PAM细胞表面FcγRⅢ后显著抑制抗病毒因子IFN-α、TNF-α的转录水平,说明FcγRⅢ能够抑制PRRSV感染后的抗病毒免疫反应。

关键词：猪Fc受体猪FcγRⅢ PRRSV PAM IFN-α TNF-α

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鉴别猪伪狂犬病毒强弱毒的高效纳米PCR检测试剂盒及初步应用

鉴别猪伪狂犬病毒强弱毒的高效纳米PCR检测试剂盒及初步应用

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2013年中国畜牧兽医学会养猪学分会学术研讨会

作者：马兴杰仇铮崔宇超崔尚金中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001

目的:建立了鉴别猪伪狂犬病毒(PRV)强弱毒高效纳米PCR检测方法,并对相关条件进行优化,组装了试剂盒.方法:根据PRV保守序列设计引物,建立纳米PCR检测PRV强弱毒方法,进行敏感性、特异性试验,试剂盒的组装及评估试验.结果:特异性试验表明... 详细信息

目的:建立了鉴别猪伪狂犬病毒(PRV)强弱毒高效纳米PCR检测方法,并对相关条件进行优化,组装了试剂盒.方法:根据PRV保守序列设计引物,建立纳米PCR检测PRV强弱毒方法,进行敏感性、特异性试验,试剂盒的组装及评估试验.结果:特异性试验表明本试剂盒对于PRV能够扩增出431(gB)、316(gE)和202bp(gG)的目的片段,对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431和202bp的目的片段,其他对于猪捷申病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、非洲猪瘟病毒等均未扩增出条带,敏感性试验表明纳米PCR方法比常规PCR方法敏感100-1000倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到101copy/μL数量级.利用两种不同方法对攻毒小鼠检出时间的比较试验结果显示,纳米PCR可以在第3天检测到病毒核酸,而普通PCR在第4天才能检出.试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异,稳定性良好.-20℃至少可保存12个月.在对中国黑龙江、吉林等7个省份的临床送检的110份样品进行检测,检测结果显示PRV强毒阳性率为53％,阴性率为47％,未发现有弱毒感染.结论:鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制,对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义,而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断.

关键词：猪伪狂犬病毒纳米PCR技术检测试剂盒效果评估

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沉痛悼念顾问盛志廉教授

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猪业科学 2013年第12期30卷 138-138页

作者：孙德林 <猪业科学>

中国动物育种学界泰斗、动物数量遗传学科的奠基人之一、东北农业大学教授盛志廉先生于2013年12月8日11﹕48仙逝,享年88岁。2013年10月28日早上的相见,是我与盛先生最后之别。大约早上7﹕30左右,他坐在轮椅上等待吃早餐,那时就感到先生... 详细信息

中国动物育种学界泰斗、动物数量遗传学科的奠基人之一、东北农业大学教授盛志廉先生于2013年12月8日11﹕48仙逝,享年88岁。2013年10月28日早上的相见,是我与盛先生最后之别。大约早上7﹕30左右,他坐在轮椅上等待吃早餐,那时就感到先生身体很虚弱,但他还是坚持参加在成都举行的第17届全国动物遗传育种学术研讨会。会上,中国畜牧兽医学会动物育种学分会授予他＂中国畜牧兽医学会动物育种终身贡献奖＂。

关键词：中国畜牧兽医学会动物遗传育种东北农业大学动物育种数量遗传学学术研讨会育种学

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PRRSV不同毒力毒株诱导Toll样受体和细胞因子表达特性的比较

PRRSV不同毒力毒株诱导Toll样受体和细胞因子表达特性的比较

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：张莉莉刘捷白娟王晓晔李玉峰姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因容易变异,不同流行毒株毒力差异较大,造成严重经济损失,但其免疫和致病机制尚不清楚。本研究将24头仔猪平均分成4组,每组6头,分别接种高致病性PRRSV分离株BB0907(HP),低毒力PRRSV毒株NT0801(LP),NT080... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因容易变异,不同流行毒株毒力差异较大,造成严重经济损失,但其免疫和致病机制尚不清楚。本研究将24头仔猪平均分成4组,每组6头,分别接种高致病性PRRSV分离株BB0907(HP),低毒力PRRSV毒株NT0801(LP),NT0801第70代衍生毒株NT0801-F70(LP-der)和DMEM营养液(对照),隔离饲养观察。攻毒后0、6、9、15天用ELISA方法检测猪血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10含量;攻毒后15天用Real-timePCR方法检测各组肺脏和脑组织中TLR2、3、7和8基因表达水平,并分离猪肺泡巨噬细胞(PAMs)和猪外周血淋巴细胞(PBMCs),分别采用TLR2、3、7/8的配体(LTA、poly(I:C)、CL097)和PRRSV刺激,检测细胞上清中细胞因子水平。结果为:与LP相比,HP组试验猪产生明显临床症状,而LP-der几乎没有毒力;HP感染猪的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平高于LP或者LP-der组。LP组PAMs经poly(I:C)或CL097刺激后分泌的TNF-α和IL-1β水平显著高于DMEM营养液对照组,同时,HP组PBMCs经CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6显著高于LP和LP-der组。HP组PBMCs经CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6高于LP和LP-der组,LP组PAMs经poly(I:C)、CL097刺激后TNF-α和IL-1β的分泌高于DMEM组。该结果表明,与LP和LP-der相比,HP更能诱导TLR3、7、8和TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ表达,从而丰富了PRRSV免疫和致病机制理论,并有助于开发更为有效的PRRSV疫苗。

关键词： PRRSV 免疫原性致病性 TLRs 细胞因子

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猪Toll样受体配体对PRRSV免疫佐剂作用

猪Toll样受体配体对PRRSV免疫佐剂作用

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：张莉莉白娟刘捷王晓晔李玉峰姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室

猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)给全球养猪业造成了巨大的经济损失,目前商品化疫苗仅能提供部分保护力。近来关于人和猪的一些研究表明Toll样受体(TLR)的配体有免疫佐剂效应,如合成的双链RNA(dsRNA)[poly(I:C)]、脂磷壁酸(LTA)和CL097... 详细信息

猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)给全球养猪业造成了巨大的经济损失,目前商品化疫苗仅能提供部分保护力。近来关于人和猪的一些研究表明Toll样受体(TLR)的配体有免疫佐剂效应,如合成的双链RNA(dsRNA)[poly(I:C)]、脂磷壁酸(LTA)和CL097。为了研究这些化合物是否诱导PRRSV特异性免疫应答效果,本试验采用PRRSV灭活病毒液(KV)与TLR配体组合后皮下免疫小鼠。结果表明,单独的poly(I:C)和CL097诱导小鼠IFN-γ和PRRSV特异性抗体水平高于KV组或KV-LTA组。将20头6周龄PCV2和PRRSV抗原、抗体均阴性的断奶仔猪,随机分为4组,第1组接种由100μgpoly(I:C)、80μgDOTAP和灭活病毒配制而成的灭活苗,第2组接种8μgCL097、80μgDOTAP和灭活病毒配制而成的灭活苗,第3组接种的是灭活病毒配制而成的灭活苗,第四组接种DMEM。每头猪通过颈部肌肉进行免疫,首免后2周加强免疫一次。首免后14天和28天,采血分离血清,用于PRRSV抗体及细胞因子(IL-4和IFN-γ)的检测;同时分离外周血淋巴细胞,测定淋巴细胞增殖反应,并测定细胞分泌细胞因子(IL-4和IFN-γ)的量。首免后28天,肌肉接种2×105.0TCID50 PRRSVS Y0608病毒液。攻毒后隔离饲养,每天观察仔猪临床表现,测量直肠温度。攻毒后第7、14和21天采血分离血清,用于病毒及抗体的检测。攻毒后第21天扑杀所有试验猪,采集肺脏组织,并进行病理学检查。结果为,KV混合poly(I:C)或CL097后诱导猪体产生的PRRSV特异性抗体和T淋巴细胞增殖水平高于KV组。攻毒后,与KV或对照组相比,KV-poly(I:C)或-CL097免疫组患猪产生的临床症状较轻、病毒血症更低、肺部的病理损伤更少。表明KV-poly(I:C)或-CL097能提高抵抗PRRSV的保护力。TLR3和TLR7/8的配体为新PRRSV疫苗的开发提供了候选佐剂。

关键词： PRRSV 灭活病毒(KV)疫苗 TLR配体佐剂

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鸡白痢沙门菌感染雏鸡的病理学变化

鸡白痢沙门菌感染雏鸡的病理学变化

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2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会

作者：查华石火英尚竟晋海云王婉刘伊扬州大学扬州225009

目的：为研究鸡白痢沙门菌分离株对雏鸡的病理学变化。方法：通过筛选2010至2012年期间中国华东部分地区的78株鸡白痢沙门菌分离株,选择具有代表性的12株鸡白痢沙门菌在雏鸡上进行毒力实验。对其中2株鸡白痢沙门菌强毒分离株(分别命名为... 详细信息

目的：为研究鸡白痢沙门菌分离株对雏鸡的病理学变化。方法：通过筛选2010至2012年期间中国华东部分地区的78株鸡白痢沙门菌分离株,选择具有代表性的12株鸡白痢沙门菌在雏鸡上进行毒力实验。对其中2株鸡白痢沙门菌强毒分离株(分别命名为S1016和S1064)进行细菌定殖研究,同时设置阳性和阴性对照组(每组30只):口服接种后第3、7、14、21、28天取鸡的肝脏、脾脏、盲肠和法氏囊,通过细菌分离计数观察鸡白痢沙门菌的动态变化,并运用组织病理学和免疫组化方法研究其引起的组织病变和细菌分布情况。结果：分离株接种后各脏器鸡白痢沙门菌的动态变化情况有所不同,但在接种后第14－28天沙门菌均不同程度下降,盲肠和法氏囊的沙门菌定殖量明显多于肝脏和脾脏。免疫组化检测发现雏鸡感染过程中鸡白痢沙门菌不同程度地分布于盲肠和法氏囊,而在肝脏和脾脏中却未检测到细菌抗原。在盲肠中,分离株接种后第3－14天可见沙门菌多集中分布于炎性细胞处,接种第21天后抗原显著减少,零星分布于李氏隐窝周围。法氏囊中,S1064接种后第3天出现大量沙门菌且分布于皮质区及髓质区,第7－14天抗原分布较为分散且数量有所减少,第21－28天抗原显著减少,零星分布于滤泡间及皮质区;S1016接种后第3天出现大量沙门菌且分布于滤泡间及皮质区,第14天抗原显著增加且分布较为集中,第21－28天未检测到细菌抗原。结论：这两株鸡白痢沙门菌分离株对雏鸡具有较强的致病性,但不同分离株对雏鸡脏器的定殖能力、分布情况及所引起的组织学病变均存在一定差异。本文研究了鸡白痢沙门菌分离株对雏鸡的病理学变化,为揭示鸡白痢沙门菌感染机理及疫苗研制提供了相关的实验依据。

关键词：鸡白痢沙门菌感染致病机制抗原分布病理组织学

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H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异毒株的致病性研究

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异毒株的致病性研究

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：赵军王新卫王川庆陈陆郑鹿平王泽霖河南农业大学禽病研究所

作者在研究1998～2008年中国H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株HA基因的进化时发现有2个致病性最强的毒株因HA基因第145位氨基酸的突变导致产生一个潜在的糖基化位点,从而使其不与单抗H6、F6等反应。为进一步探究这类变异毒株HA基因变异对H... 详细信息

作者在研究1998～2008年中国H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株HA基因的进化时发现有2个致病性最强的毒株因HA基因第145位氨基酸的突变导致产生一个潜在的糖基化位点,从而使其不与单抗H6、F6等反应。为进一步探究这类变异毒株HA基因变异对H9亚型AIV的致病性的影响,本研究对12株具有上述血凝素分子特征的H9流行毒株进行了致病性方面的系统研究。结果显示这类毒株在HA裂解位点处仅有1个碱性氨基酸,均为典型的低致病性AIV毒株,但145位氨基酸均发生漂变(S→N),导致在145～147aa多了一个糖基化位点NGT,并丧失了与单抗的血凝抑制反应特性。该类毒株对SPF鸡胚、鸡和细胞的致病力大大增强,EID50、ELD50为10-8.0～-9.5/0.2ml,高于疫苗株1～2滴度;MDT/MLD最低,多数在60～80h;1日龄SPF鸡的ICPI为0.23～1.7,6周龄SPF鸡的IVPI为0.21～1.1,而疫苗株均为0;可以在不加胰酶的CEF、CEK、DF-1、MDCK单层细胞上不经适应而直接繁殖,12～24h出现病变。人工感染SPF鸡或免疫鸡,从第2天起均可从咽喉、泄殖腔分离到病毒,免疫抗体或同源抗体均不能阻止其攻毒后的排毒。表明这类毒株致病性的增加与HA基因的变异密切相关。因HA基因145-147aa位增加了一个NGT,蛋白结构分析显示血凝素头部蛋白减少了一个β折叠。三维空间构象的变化导致抗HA抗体作用位点的变异或缺失,并影响其邻近的受体结合位点,从而改变该毒株的抗原性和其它生物学特性。这是一类HA蛋白S145位发生变异的毒株,虽然约占当前流行毒株总数的5%-7%,但它更能抵抗机体的防御机制,因而有更大的生存空间。在强大的免疫压力和自然选择下这类毒株有可能逐步成为优势毒株,造成更大的危害,这为该病的防控提出了新的挑战。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒变异毒株 HA基因糖基化位点致病性

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