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4 篇 基因表达
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3 篇 兽医学
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5 篇 中国农业科学院兰...
5 篇 扬州大学
5 篇 广西壮族自治区兽...
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4 篇 中国农业科学院上...
4 篇 江苏省农业科学院...
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3 篇 中国农业科学院哈...
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2 篇 广东省兽医公共卫...
2 篇 广东省农业科学院...
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作者

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7 篇 范晴
7 篇 谢芝勋
7 篇 谢丽基
7 篇 邓显文
7 篇 庞耀珊
7 篇 刘加波
7 篇 罗思思
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5 篇 陈化兰
5 篇 单同领
5 篇 童武
5 篇 王永山
5 篇 刘长明
5 篇 仇华吉
5 篇 柳金雄
5 篇 欧阳伟
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猪繁殖与呼吸综合症病毒Nsp9单域抗体库的构建

猪繁殖与呼吸综合症病毒Nsp9单域抗体库的构建

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：刘红亮王妍肖书奇徐乐周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站陕西杨凌712100

为了制备特异性针对PRRSV Nap9的并且可以抑制病毒感染的纳米抗体，构建了针对Nsp9的双峰驼重链抗体可变区抗体文库。首先利用pET28a载体构建了Nsp9全长的原核表达载体，并将其导入BL21表达菌中。表达并纯化Nsp9重组蛋白，利用His... 详细信息

为了制备特异性针对PRRSV Nap9的并且可以抑制病毒感染的纳米抗体，构建了针对Nsp9的双峰驼重链抗体可变区抗体文库。首先利用pET28a载体构建了Nsp9全长的原核表达载体，并将其导入BL21表达菌中。表达并纯化Nsp9重组蛋白，利用His单抗和PRRSV阳性猪血清鉴定重组蛋白免疫反应性。将重组蛋白与弗氏佐剂充分混匀免疫4岁健康雄性阿拉善双峰驼，经过5轮免疫后采集实验动物血液，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA并反转录cDNA，根据骆驼重链抗体可变区上下游保守序列设计引物，利用PCR扩增VHH基因，将其连入pCANTAB SE噬菌体载体，转化TG1感受态细胞制备双峰驼重链抗体可变区抗体文库。表达并纯化了具有较强免疫反应性的可溶性Nsp9重组蛋白，ELISA结果显示猪体在攻毒后14d左右可以检测到Nsp9的抗体，抗体滴度在功毒后28 d可以达到较高的水平。双峰驼经过5轮免疫后抗体效价达到1:50 000，采集血液后，从350 mL全血中分离得到3×108个外周血淋巴细胞。提取RNA并反转录后，利用PCR扩增得到400 by左右的VHH条带，将其连入pCANTAB 5E噬菌体展示载体中，电转化TGI感受态细胞，得到了库容量为2×108的双峰驼重链抗体文库。猪体感染PRRSV后可产生针对Nsp9的抗体。可溶性Nsp9重组蛋白有望用于针对PRRS的血清学检测。本文构建的抗体库库容大且丰度较高，可用于Nsp9纳米抗体的筛选。

关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒单域抗体库非结构蛋白血清学检测

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猪圆环病毒2型毒株构象中和表位研究

猪圆环病毒2型毒株构象中和表位研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：刘建波黄立平危艳武刘丹王一平李胜斌吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001

猪圆环病毒2型与猪断奶仔猪多系统衰竭综合征有关.8E4单抗是一株针对于PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体,具有中和病毒的能力.然而这株单抗只能与PCV2a株(LG,CL和JF2;8E4单抗阳性病毒株)反应,但是不与PCV2b株(YJ和JF;8E4单抗阴性病毒株)反应.... 详细信息

猪圆环病毒2型与猪断奶仔猪多系统衰竭综合征有关.8E4单抗是一株针对于PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体,具有中和病毒的能力.然而这株单抗只能与PCV2a株(LG,CL和JF2;8E4单抗阳性病毒株)反应,但是不与PCV2b株(YJ和JF;8E4单抗阴性病毒株)反应.本研究中,对8E4单抗阳性病毒株与8E4阴性病毒株在Cap蛋白中的有差异蛋白进行点突变,表明突变将JF病毒株的第59位精氨酸突变为丙氨酸后,突变毒株能够被8E4单抗识别和中和.同样,同时将YJ毒株中第59位精氨酸突变为丙氨酸,以及第60位的丙氨酸突变为苏氨酸后,突变毒株也能够被8E4单抗识别和中和.本研究表明PCV2 Cap蛋白中的第59位和第60位氨基酸参与构象表位的形成;并且在8E4单抗阴性毒株中突变第59位氨基酸或第59/60位氨基酸后能够产生新的中和表位.本研究为深入研究构象性中和表位、对不同PCV2株进行抗原差异分型,以及获得PCV2新型疫苗候选病毒株提供重要信息.

关键词：猪圆环病毒2型毒株构象中和表位单克隆抗体

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ORFV-DNA Polymeras基因RNAi-siRNA片段筛选鉴定

ORFV-DNA Polymeras基因RNAi-siRNA片段筛选鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：于永忠王金珍张欣媛李珊珊潘求真崔玉东黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院黑龙江大庆163319

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的一种羊属动物接触性皮肤传染病,也是人畜共患传染病之一.根据0RFv与宿主细胞相互作用的特点，本研究选定ORFV胞内复制的关键基因DNA poiymerase为靶向基因，运用RNAi技术进行靶向基因... 详细信息

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的一种羊属动物接触性皮肤传染病,也是人畜共患传染病之一.根据0RFv与宿主细胞相互作用的特点，本研究选定ORFV胞内复制的关键基因DNA poiymerase为靶向基因，运用RNAi技术进行靶向基因沉默的体外试验研究。通过GenBank中注册的标准株ORFV-NZ2的mRNA序列，采用网络自动筛选平台将靶序列通过基因BLAST分析以排除siRNA非特异性抑制其它基因的可能性。在594bp~984bp的靶序列上，遴选出分值较高的3个shRNA候选片段，起始点分别为596,875和947，分别命名为D-875、D-947和D-596。按照shRNA一般构成模式为:正义链TG sen TTCAAGAGA anti CTTTTTTC (Hpa I);反义链TCGAGAAAAAAG sen TCTCTTGAA anti CA(Xho I)。其中TTCAAGAGA为发夹结构;每个片段设置Xho I和Hpa I位点。靶序列引物设计:上游引物TAAGCGATCGCGCGGCGATTCACGCTTAC(SgfI);下游弓肋TAAGCGGCCGCGATGGTCCCGTTGTTGTTG(NotI)。将合成的shRNA候选片段插入慢病毒表达载体pLL3.7,构建的重组质粒分别命名为pLL3.7-D947,pLL3.7-D875,pLL3.7-D596和pLL3.7-D。PCR鉴定结果表明，重组表达载体pLL3.7-D596为阳性重组子，可用于将siRNA转染293T细胞，其它重组子仍需进一步优化。本研究结果为进行ORFV-DNA Polymeras基因沉默的体外试验奠定了基础。

关键词：羊口疮病毒靶向基因核糖核酸片段阳性重组子

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同时鉴别6种鸡病毒性呼吸道病GeXP检测方法的建立

同时鉴别6种鸡病毒性呼吸道病GeXP检测方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：罗思思谢芝勋刘加波谢志勤谢丽基庞耀珊邓显文范晴广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室广西南宁530001

为了建立一种能够同时鉴别H5、H7、H9亚型禽流感、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎等6种鸡病毒性呼吸道传染病病原体的GeXP检测方法,本研究根据这些病原体各自的基因保守序列,设计合成了7对特异性引物,优化反应条件,用单一病毒... 详细信息

为了建立一种能够同时鉴别H5、H7、H9亚型禽流感、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎等6种鸡病毒性呼吸道传染病病原体的GeXP检测方法,本研究根据这些病原体各自的基因保守序列,设计合成了7对特异性引物,优化反应条件,用单一病毒、混合病毒样品来验证所建立的GeXP方法的特异性和准确性,以不同拷贝数的克隆质粒来检测GeXP方法的灵敏度.检测34份临床阳性样品,进一步验证该法的可靠性.结果显示,在7对引物同时存在的GeXP反应体系中,可特异性地扩增出相关6种病毒目的片段,并可在102拷贝/μL水平同时特异地检测出鸡6种病毒性呼吸道传染病,GeXP方法检测34份临床阳性样品结果与病毒分离一致.该研究所建立的GeXP方法不仅可高通量检测6种病原体,而且具有特异性强和灵敏度高的特点,适用于临床样品混合感染的快速鉴别诊断,对这6种发病特征及临床症状相似的鸡病毒性呼吸道病的有效防控有很高的实际应用价值.

关键词：鸡病毒性呼吸道病基因检测多重聚合酶链反应效果评估

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PRRSV GP5蛋白抗独特型抗体的单链可变区片段(SFv)转导MARC-145后抑制PRRSV感染的研究

PRRSV GP5蛋白抗独特型抗体的单链可变区片段(SFv)转导MARC-145后...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：李琼毅王向鹏刘红亮黄柏成王承宝李治军周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站陕西杨凌712100

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种全球性猪传染病,已成为威胁世界养猪业的主要疫病之一.PRRSV感染宿主细胞是一个多步骤且需要多种细胞受体参与的过程.本实验室前期研究以免疫网络学说为理论基础,... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种全球性猪传染病,已成为威胁世界养猪业的主要疫病之一.PRRSV感染宿主细胞是一个多步骤且需要多种细胞受体参与的过程.本实验室前期研究以免疫网络学说为理论基础,利用抗PRRSV GP5的独特型抗体Mab2-5G2找到了与PRRSV感染相关的一个新的受体-NMHCⅡA.本试验以Mab2-5G2杂交瘤细胞的mRNA为模板,通过RT-PCR技术克隆其VH和VL基因;构建表达抗独特型抗体Mab2-5G2的单链可变区片段(single-chain variable antibody fragment,SFv)的慢病毒真核表达载体并转导至PRRSV易感细胞系Marc-145中,经筛选鉴定后获得了稳定表达SFv的MARC-145,不同毒株(包括VR2332,SD16,BJ-4,JXA1,CH-1a,TA-4)感染后观察病毒复制增殖情况.Western blot、IFA和病毒滴定结果表明:与对照组细胞相比,不同PRRSV毒株N蛋白表达量及病毒滴度均出现不同程度的减少或下降.本研究结果证明SFv转导MARC-145后明显抑制PRRSV的增殖,提示NMHCⅡA在PRRSV感染中发挥重要作用.以上研究结果不仅丰富了对PRRSV与受体之间相互作用的了解,也为进一步探索和寻找潜在的抗PRRSV药物靶标提供了理论依据.

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白抗独特型抗体单链可变区片段感染抑制

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兔出血症病毒衣壳蛋白N端携带双串联卵清蛋白T细胞表位嵌合体的表达及鉴定

兔出血症病毒衣壳蛋白N端携带双串联卵清蛋白T细胞表位嵌合体的表...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：张燕胡波宋艳华范志宇魏后军姜平王芳南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

在兔出血症病毒主要结构蛋白VP60的N端插入双串联OVA CD8+T细胞表位(ovalbumin,卵清蛋白第257-264位氨基酸),研究外源片段对VP60蛋白表达及病毒样颗粒(VLPs)装配的影响,分析VP60作为载体的可行性和对外源基因长度的耐受性.通过分子生物... 详细信息

在兔出血症病毒主要结构蛋白VP60的N端插入双串联OVA CD8+T细胞表位(ovalbumin,卵清蛋白第257-264位氨基酸),研究外源片段对VP60蛋白表达及病毒样颗粒(VLPs)装配的影响,分析VP60作为载体的可行性和对外源基因长度的耐受性.通过分子生物学方法将双串联OVA CD8+T细胞表位(257aa-264aa)插入至RHDV衣壳蛋白VP60基因序列的N端,得到重组VP60基因.利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,并命名为DN.经RT-PCR、间接免疫荧光、SDS-PAGE、western blot方法鉴定嵌合蛋白DN的表达,利用电镜观察嵌合蛋白病毒样颗粒的形成.结果表明嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,且可形成与RHDV VLPs类似的病毒样颗粒.本研究为VP60作为载体系统,有效提呈外源片段的研究提供了重要依据,同时也为VLPs疫苗的研制奠定了基础.

关键词：兔出血症病毒衣壳蛋白双串联卵清蛋白细胞表位嵌合体疫苗研制

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鉴别猪伪狂犬病毒强弱毒的高效纳米PCR检测试剂盒及初步应用

鉴别猪伪狂犬病毒强弱毒的高效纳米PCR检测试剂盒及初步应用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：马兴杰仇铮崔宇超王晓玲张晶朱宝孔苗苗罗亚坤崔尚金中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

本实验建立了鉴别猪伪狂犬病毒(PRV)强弱毒高效纳米PCR检测方法,并对相关条件进行优化,组装了试剂盒.根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB(431 bp)、gE(316 bp)和gG(202 bp)3个基因,用于区分PRV强毒与基因缺失毒株,优化反... 详细信息

本实验建立了鉴别猪伪狂犬病毒(PRV)强弱毒高效纳米PCR检测方法,并对相关条件进行优化,组装了试剂盒.根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB(431 bp)、gE(316 bp)和gG(202 bp)3个基因,用于区分PRV强毒与基因缺失毒株,优化反应条件后建立了纳米PCR检测PRV强弱毒的方法并组装试剂盒,对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性及保存期评估试验,并对临床样品进行了检测.特异性试验表明本试剂盒对于PRV能够扩增出431(gB)、316(gE)和202 bp(gG)的目的片段,对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431 bp和202 bp的目的片段,对于猪捷申病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及大肠杆菌等DNA或cDNA均未扩增出条带,敏感性试验表明本试剂盒的方法比常规PCR方法敏感100～1000倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到101拷贝/μL数量级.试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异,稳定性良好.-20℃至少可保存12个月.在对中国黑龙江、吉林等7个省份的临床送检的117份样品进行检测,检测结果显示PRV强毒阳性率为51％,阴性率为49％,未发现有弱毒感染.鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制,对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义,而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断.

关键词：猪伪狂犬病毒纳米聚合酶链反应毒性检测试剂盒

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传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的制备其抗病毒活性分析

传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的制备其抗病毒活性分析

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：夏兴霞欧阳伟王永山诸玉梅潘群兴毕振威王晓丽吴晓悠董晨红江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒样颗粒(VLP)重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得7株分泌抗IBDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞.用间接免疫荧光试验(IFA)和病毒中和试验(VN)分别测定MAb的特异性和抗病... 详细信息

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒样颗粒(VLP)重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得7株分泌抗IBDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞.用间接免疫荧光试验(IFA)和病毒中和试验(VN)分别测定MAb的特异性和抗病毒活性,杂交瘤细胞株2C8分泌的MAb具有较高的抗IBDV活性,培养上清液中的抗体中和效价为210,诱生BALB/c小鼠腹水中的抗体中和效价达到107,抗体亚类为IgG1κ.将2C8-MAb制成注射液,经肌肉注射,在12h内,鸡血液循环中的鼠源MAb达到高峰,半衰期至少可持续14d.在IBD预防试验中,注射2C8-MAb的鸡可抵抗IBDV强毒感染.在IBD治疗试验中,对IBDV强毒感染发病鸡用2C8-MAb治疗,存活率为60％(18/30),第21 d检测法氏囊组织IBDV全部为阴性;而非治疗对照组,发病鸡的存活率只有20％ (6/30),第21 d检测存活鸡法氏囊组织IBDV全部呈阳性.本试验结果表明,高中和活性的2C8-MAb对IBD具有良好的预防及治疗效果,能够显著降低死亡率,并且MAb治疗康复鸡不带毒.

关键词：鸡传染病法氏囊病病毒单克隆抗体抗病毒活性

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副猪嗜血杆菌分泌组中主要保护性抗原的筛选与鉴定

副猪嗜血杆菌分泌组中主要保护性抗原的筛选与鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：刘娇李建军崔宁张艳禾谢芳李刚周泷倪洪波王春来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163000

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是革拉瑟氏病(Glasser's disease)的病原体,该病以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征,对养猪业危害严重并造成巨大的经济损失.HPS的主要毒力因子以及保护性抗原目前还不是很清楚... 详细信息

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是革拉瑟氏病(Glasser's disease)的病原体,该病以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征,对养猪业危害严重并造成巨大的经济损失.HPS的主要毒力因子以及保护性抗原目前还不是很清楚,这大大妨碍了高效疫苗的研制和该病的免疫防制.一般来说,病原细菌的主要毒力因子和保护性抗原往往是其分泌到菌细胞外的毒素和一些酶类,以及位于细菌表面的外膜蛋白等.本研究利用免疫蛋白质组学(Immune proteomics)技术对HPS分泌组中的保护性抗原进行了筛选和鉴定.一共鉴定到了6种具有良好反应活性的蛋白，分别是亚铁血红素结合蛋白HbpA、过氧化氢酶Catalase、寡肽透酶OppA、寡肽胞周结合蛋白OppA2、外膜蛋白P2以及参与Fe3+和ATP结合转运的AfuA蛋白。以上6种蛋白经原核表达载体pET-28a(+)克隆后都得到了良好表达，纯化的6种重组蛋白经western blot及ELISA检测验证，均具有良好的反应活性;6种重组蛋白免疫小鼠后可以刺激机体产生较高滴度的抗体，对HPS血清5型强毒株Nagasaki 5倍LDP剂量菌的攻击能够提供良好的保护力，保护率均介于50~80％之间。结果表明，本研究筛选和鉴定到的这6种蛋白可以作为亚单位疫苗的候选抗原。

关键词：副猪嗜血杆菌保护性抗原蛋白筛选反应活性鉴定

来源：评论

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猪繁殖与呼吸综合征病毒5非翻译区(-)突出茎环是病毒复制必需的顺式作用元件

猪繁殖与呼吸综合征病毒5非翻译区(-)突出茎环是病毒复制必需的顺...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：高飞郑浩姜一峰李丽薇郑海红周艳君韦祖樟童光志中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 广西大学动物科学技术学院广西南宁530005

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组5'非翻译区(UTR)对病毒复制转录等生物合成过程至关重要,但其发挥作用的机制尚不清楚.本实验室在北美型(pAPRRS)与欧洲型PRRSV(pSHE)感染性克隆骨架上,分别在各自的5' UTR与ORF1之间插入&qu... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组5'非翻译区(UTR)对病毒复制转录等生物合成过程至关重要,但其发挥作用的机制尚不清楚.本实验室在北美型(pAPRRS)与欧洲型PRRSV(pSHE)感染性克隆骨架上,分别在各自的5' UTR与ORF1之间插入"at"形成NdeⅠ位点,由此产生的两个突变全长克隆pTLNd4和pSHEnde,经过转染和传代证明突变位点的引入不影响两者的感染性.在此基础上,将两型5'UTR进行互换,所构建的突变体克隆pTLV8和pSHSP5中,前者具有感染性,后者则是致死性突变体.在对pSHSP5以及pTLV8的二级结构预测中发现,嵌合突变体pTLV8的5'端虽然与亲本pAPRRS的二级结构差异很大,但保留了TRS所在的最突出的茎环结构,且TRS与ORF1的AUG均位于最顶端的loop上.而pSHSP5的此茎环结构则遭到了破坏.对另一突变体,pPa2(在5'UTR和ORF1之间插入"aatt"形成Pac Ⅰ的酶切位点)的研究中也发现只要突变破坏了顶端loop结构.对病毒就是致死性的.这也佐证了此茎环结构的重要性.综上所述,本研究证明了TRS所在的顶端loop结构是调控病毒复制转录过程的关键顺式作用元件之一.任何对其结构破坏的突变都会成为致死性突变.

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒非翻译区突出茎环转录调控序列结构预测

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