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从疑似山羊传染性胸膜肺炎病羊肺组织中分离到1株无胆甾原体

从疑似山羊传染性胸膜肺炎病羊肺组织中分离到1株无胆甾原体

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：江锦秀林裕胜江斌林甦胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所

为了明确福建省某羊场发生的疑似山羊传染性胸膜肺炎病例的病原,本研究利用支原体培养基对肺组织的病原进行分离培养和纯化,通过生化试验和特异性PCR方法进行鉴定。研究结果显示:病羊肺组织在液体培养基上传代后,培养1～2 d后,培养基颜... 详细信息

为了明确福建省某羊场发生的疑似山羊传染性胸膜肺炎病例的病原,本研究利用支原体培养基对肺组织的病原进行分离培养和纯化,通过生化试验和特异性PCR方法进行鉴定。研究结果显示:病羊肺组织在液体培养基上传代后,培养1～2 d后,培养基颜色变黄且不浑浊,经液体-固体培养基3轮克隆纯化后,在体视显微镜下,可见菌落为圆形,突起,无中心脐。该分离菌用吉姆萨染色,在显微镜（用油境）观察,可见分离菌呈淡紫色,具有高度多形性,以小球状和杆状为主。分离菌株使含10%葡萄糖的培养基颜色从红色变为黄色,而不接菌的对照管培养基不变色,即分离菌株能发酵葡萄糖;分离菌株不能使含10%精氨酸的液体培养基（不含葡萄糖）变色,而且对照管也不变色,即分离菌株不能水解精氨酸;分离菌株不能使含10%尿素的液体培养基（不含葡萄糖）变色,而且对照管也不变色,即分离菌株不分解尿素;分离菌株不能使含0.2g.L氯化三苯基四氮唑的液体培养基（不含酚红和葡萄糖）变色,而且对照管也不变色,即氯化四氮唑还原反应阴性;分离菌株在无血清的液体培养基中传3代,培养基颜色变黄,无血清对照管不变色,即胆固醇需要试验阴性。用支原体目16S rRNA通用引物扩增获得目的条带560bp,与预期片段大小相符。用莱氏无胆甾原体特异性引物扩增也获得目的条带505bp,与预期片段大小相符。用丝状支原体簇丝状支原体簇特异性引物、绵羊肺炎支原体特异性引物、无乳支原体特异性引物以及精氨酸支原体特异性引物均未扩增出任何条带。分离菌株的16S rRNA基因部分序列与莱氏无胆甾原体标准株序列的同源性为99.6%。以上鉴定结果表明本次分离到支原体为莱氏无胆甾原体,此为福建省首次报道。关于该莱氏无胆甾原体的致病性等特性,本实验室正在进一步研究。

关键词：山羊传染性胸膜肺炎福建省分离菌液体培养基支原体

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猫杯状病毒新型变异株的遗传特征分析

猫杯状病毒新型变异株的遗传特征分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘春国刘永相刘大飞郭东春田进李志杰刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室东北农业大学动物医学院

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是杯状病毒科、水疱疹病毒属成员之一,也是感染猫的重要病原之一,能够导致猫发生一系列严重的临床症状。FCV基因组包含一个单股正链RNA,极易产生遗传和抗原变异,这也是导致FCV毒力差异和疫苗免疫失... 详细信息

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是杯状病毒科、水疱疹病毒属成员之一,也是感染猫的重要病原之一,能够导致猫发生一系列严重的临床症状。FCV基因组包含一个单股正链RNA,极易产生遗传和抗原变异,这也是导致FCV毒力差异和疫苗免疫失败的基础。因此,对FCV基因组进行分析具有重要意义。为了解FCV的生物学特性,本研究对患有严重结膜炎的猫体内分离到的一株FCV HRB SS株进行了分离鉴定和遗传分析。结果表明HRB SS株全长基因组除了poly(A)共由7705 nt组成。编码两个大的ORF:ORF1(nt20-5311)和ORF2(nt 5312-7318),以及一个小的ORF3(nt7315-7638)。HRB SS株5'和3'非编码区分别由19nt和67nt组成。此外,HRB SS株在基因组3'端有24nt插入,与韩国分离株12Q087-1和12Q087-5相似,而中国分离株GD与F9疫苗株则保持相同的基因组形式。该片段的插入对病毒的意义如何将有待于进一步研究。基因组核苷酸序列分析结果表明FCVHRB SS株与1874株同源性最高,为80.3%,而与中国分离株GD的同源性最低,仅为76.6%。VP1超变区核苷酸序列分析发现,HRB SS株与疫苗株CVXPOLYCAP的同源性最高,为78.2%,而与中国分离株CH-JL和GD的同源性最低,仅为67.9%和68.8%。推导的超变区氨基酸序列分析结果显示,HB SS与12Q087-5、UTCVM-NH12和FCLF4的同源性最高,为86.7%,而与中国分离株的同源性仅为73.9%。系统发育树分析结果表明FCV HRB SS株基因组核苷酸序列与FCV/DD/2006/GE(德国)和UTCVM-H2(美国)的亲缘关系最近,并与美国分离株Urbana、1874和5789处于同一进化分支。而与疫苗株F9处于不同的进化分支。本研究结果表明,FCV HRB SS分离株为一株新型变异株,并与我国FCV具有不同的遗传起源。

关键词：猫杯状病毒变异株遗传特征超变区

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血管内皮生长因子在牛流行型白血病肿瘤组织的表达及其意义

血管内皮生长因子在牛流行型白血病肿瘤组织的表达及其意义

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：龙塔潘耀谦董发明佘锐萍河南科技大学中国农业大学兽医学院

目的:观察探讨血管内皮生长因子在牛流行型白血病肿瘤组织中的表达、分布及其意义。方法:究采用免疫组化S-P方法首次对14例牛流行型白血病肿瘤组织及瘤旁组织中VEGF的表达、分布变化进行了研究。结果:EBL病牛淋巴结、心脏肿瘤组织中VEG... 详细信息

目的:观察探讨血管内皮生长因子在牛流行型白血病肿瘤组织中的表达、分布及其意义。方法:究采用免疫组化S-P方法首次对14例牛流行型白血病肿瘤组织及瘤旁组织中VEGF的表达、分布变化进行了研究。结果:EBL病牛淋巴结、心脏肿瘤组织中VEGF阳性细胞表达率分别为78.6%和90%,并见到肿瘤组织中绝大多数肿瘤细胞过量表达VEGF,均明显高于相应瘤旁组织,差异极显著(P<0.01)。还观察到血管内皮细胞和血管内肿瘤细胞分泌VEGF现象。结论:VEGF在EBL病牛肿瘤细胞中的高表达现象,证明VEGF在EBL肿瘤形成、浸润和全身多脏器转移的过程中起重要作用。

关键词：牛流行型白血病肿瘤组织血管内皮生长因子

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双向电泳技术分析猪肺炎支原体168强弱毒株差异蛋白

双向电泳技术分析猪肺炎支原体168强弱毒株差异蛋白

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘茂军邱明君张映冯志新白方方熊祺琰武昱孜姜俊兵李桂兰邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心山西农业大学动物科技学院

目的猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎的主要病原,该病是危害世界养猪业的重要疾病之一。目前已发现了Mhp的一些与毒力相关蛋白,但对Mhp强弱毒株中差异蛋白的报道甚少。本试验以Mhp168强弱毒株为材料,利用蛋白组学技术,旨在构建Mhp... 详细信息

目的猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎的主要病原,该病是危害世界养猪业的重要疾病之一。目前已发现了Mhp的一些与毒力相关蛋白,但对Mhp强弱毒株中差异蛋白的报道甚少。本试验以Mhp168强弱毒株为材料,利用蛋白组学技术,旨在构建Mhp168株双向电泳图谱,筛选强弱毒株的差异蛋白,为该病的防控提供理论依据。材料与方法 Mhp168强弱毒株由江苏省农业科学院兽医研究所提供。取Mhp168株强弱毒株新鲜培养物,离心收集菌体,抽提菌体全蛋白,用试剂盒处理样品,测定蛋白质浓度,进行双向电泳(2-DE)。蛋白点进行比对和表达量分析(T检验法,差异>2倍),找出差异蛋白点进行切胶,MALDI-TOF质谱分析。对差异点进行Western-blot验证。结果与讨论采用2-DE技术对来源于同一母本株的猪肺炎支原体168强弱毒株的全菌蛋白进行分离,强毒株凝胶上共检出207±6个蛋白点,弱毒株共检出153±4个蛋白点。强弱毒株的蛋白点进行比对和表达量分析,发现差异点共62个,其中52个仅出现在Mhp168强毒株的图谱上,3个仅出现在Mhp168弱毒株的图谱上;7个蛋白点为强弱毒株图谱所共有,其中3个蛋白点表达上调,4个蛋白点表达下调。在对24个蛋白点进行质谱分析中,成功鉴定比对找到11个,其中4个是血清蛋白,4个为酶类,1个是蛋白前体,1个是假想蛋白,1个是未知蛋白产物(可能未收录于蛋白数据库中)。经Western-blot验证,发现其中的P36蛋白具有较好的免疫原性。结论首次用2-DE技术对同一来源的猪肺炎支原体168强弱毒株的差异蛋白组分析,构建了差异表达图谱,成功鉴定11个差异蛋白,为该病的致病机理和防制奠定了基础。

关键词：强弱毒株强毒株猪肺炎支原体差异蛋白双向电泳技术

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我国基因Ⅶ型新城疫病毒的F基因生物信息学分析

我国基因Ⅶ型新城疫病毒的F基因生物信息学分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：袁乾亮钱晶薛聪王建忠张平仄王珂丛彦龙丁壮吉林大学动物医学学院

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽类为主的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病,被OIE列为必报动物疫病,也是我国中长期规划五大优先防治的动物疫病之一。本研究以不同宿主NDV的分子流行病学为切入点,结合生物信息学手段,统计... 详细信息

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽类为主的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病,被OIE列为必报动物疫病,也是我国中长期规划五大优先防治的动物疫病之一。本研究以不同宿主NDV的分子流行病学为切入点,结合生物信息学手段,统计了NCBI 1475条新城疫病毒F基因序列(GenBank截止2015.5.1),整理并完善其宿主来源、分离年代和地域等背景信息;并基于F基因47-420nt高变区(374bp)对整理的414条全序列进行基因分型,并对我国优势基因型病毒的分子遗传特点进行分析。本研究分析的我国流行株F基因全序列共414条,来自29个省、市区,主要包括6种宿主动物(鸡、鸭、鹅、鸽、猪、野禽等),根据进化树的基本拓扑结构,我国新城疫流行株明显分为2个群,即ClassⅠ和ClassⅡ;其中ClassⅡ量最多,占到总数的85%以上(356/414),且分布范围最广;而ClassⅠ则包括了来自17个省区的58个流行株。进一步对ClassⅡ进行基因型划分可得,我国至今出现过7种基因型。其中种间分析结果表明,鸡群(124/168)、鸭群(23/51)、鹅群(30/35)及野禽(27/47)中主要流行基因Ⅶ型毒株,偶尔存在其他基因型;鸽群中仍以基因Ⅵ型(40/47)为主要流行基因型,这表明基因Ⅷ型新城疫病毒仍是我国家禽和野禽的优势基因型。使用ModelGenerator软件对我国基因Ⅷ型新城疫病毒F基因序列(1659bp)进行最佳碱基替换模型计算,结果212条F基因序列的最佳碱基替换模型为GTR+I+R,说明F基因含有稳定保守区,但是不同毒株间的进化变异速率不尽相同,序列各位点的变异频率也不恒定,这基本符合RNA病毒的遗传进化规律。综上分析表明,目前基因Ⅷ型为我国新城疫病毒优势基因型,最佳碱基替换模型结果体现RNA病毒的遗传进化特征,以此进一步分析我国新城疫病毒基因型的"三间"分布(种间、时间、空间)特征,也为我国新城疫的预防工作提供科学依据。

关键词：新城疫病毒基因序列基因Ⅶ型生物信息学分析

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滩羊不同胚胎发育时期尾组织形态学分析及PDGFD基因表达研究

滩羊不同胚胎发育时期尾组织形态学分析及PDGFD基因表达研究

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第十六次全国畜禽遗传标记学术研讨会

作者：韩建刚马月辉中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

引言我国绵羊按尾型可以大致划分为肥尾羊、脂臀羊、瘦尾羊，绵羊脂尾能够在饲草丰富的季节将过剩的能量存储于尾部脂肪组织中，以备冬季饲草不足时为机体提供所需能量，同时为人类提供可食用脂肪。

关键词：滩羊胚胎 HE染色 PDGFD

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猪SAMHD1抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在MARC-145细胞中的复制

猪SAMHD1抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在MARC-145细胞中的...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：杨莘周艳君单同领姜一峰童武虞凌雪刘飞童光志中国农业科学院上海兽医研究所

2006年,高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的出现,对我国的养猪业和养殖户造成了巨大的经济损失。目前,HP-PRRSV仍然是世界范围内防控的重点,并且其仍在持续的进化。最近研究证实,SAMHD1作为一种天然限制性因子,能够阻止HIV-1... 详细信息

2006年,高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的出现,对我国的养猪业和养殖户造成了巨大的经济损失。目前,HP-PRRSV仍然是世界范围内防控的重点,并且其仍在持续的进化。最近研究证实,SAMHD1作为一种天然限制性因子,能够阻止HIV-1型病毒在髓源细胞中的复制。然而,SAMHD1的生物学特性还知之甚少。为了探索SAMHD1对PRRSV增殖的影响,本实验通过RACE方法克隆获得猪SAMHD1全基因及其编码序列,并构建了含有其编码序列的真核表达载体。将重组的真核表达载体转染MARC-145细胞,进而感染HP-PRRSV,观察病毒的复制增殖状况。其次,通过不同时间段感染HP-PRRSV,检测病毒在感染过程中对SAM-HD1蛋白的调控关系。猪SAMHD1同样为核内定位蛋白,几乎在所有的组织中均有表达。序列分析发现,其具有明显的遗传进化规律。Western blot、间接免疫荧光(IFA)和实时荧光定量RT-PCR检测发现,MARC-145细胞中过表达SAMHD1蛋白,能够明显抑制病毒的复制;细胞培养上清中病毒TCD50也明显降低。HP-PRRSV病毒在感染MARC-145细胞的不同阶段,SAMHD1的mRNA水平没有明显的变化,只是在感染后期20h-24hSAMHD1蛋白水平出现一定程度的下降。但HP-PRRSV病毒感染PAM细胞后不同时间段,荧光定量RT-PCR的方法检测SAMHD1蛋白mRNA变化发现,随着病毒感染SAMHD1蛋白mRNA水平出现明显的上调趋势;western blot检测发现,SAMHD1蛋白水平变化在感染后12h-24h出现明显的上调。HP-PRRSV在感染PAM细胞后,SAMHD1蛋白出现明显的活化,发挥其抗病毒作用,但病毒的增殖并没有受到影响。HP-PRRSV在感染细胞的过程中能够调控SAMHD1蛋白的活性来抑制其抗病毒作用,从而有利于自身的感染与增殖。本实验中,第一次克隆获得猪SAMHD1全基因序列。病毒滴度测定与westernblot结果分析表明,猪SAMHD1转染MARC-145细胞后能够有效抑制HP-PRRSV的复制,其抗病毒机制及其通路的活化仍需要进一步的探索,SAMHD1可作为一种潜在的抑制PRRSV及其他动脉炎病毒增殖的抗病毒因子。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 MARC-145 SAMHD1 PRRSV

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三株与HP-PRRSV疫苗株高度同源的高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒的分离鉴定

三株与HP-PRRSV疫苗株高度同源的高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：姜一峰夏天奇周艳君虞凌雪杨莘黄勤锋李丽薇高飞曲泽慧童武童光志中国农业科学院上海兽医研究所

引言 2012年江苏省桌未使用过Hp-PRRSV疫苗的猪场保育猪群中出现疑似PRRS症状,导致大部分仔楮死亡。从发病猪血清中分离到三株猪繁殖和呼吸综合征病毒,命名为NT1、NT2和NT3,鉴定分析结果显示三株病毒可能来源于HP-PRRSV疫苗株毒力反强... 详细信息

引言 2012年江苏省桌未使用过Hp-PRRSV疫苗的猪场保育猪群中出现疑似PRRS症状,导致大部分仔楮死亡。从发病猪血清中分离到三株猪繁殖和呼吸综合征病毒,命名为NT1、NT2和NT3,鉴定分析结果显示三株病毒可能来源于HP-PRRSV疫苗株毒力反强。材料和方法将采集的发病猪血清在MARC-145细胞上进行病毒分离,在PAM和MARC-145细胞上进行生长曲线的测定。对病毒全基因组进行扩增并测序,对获得的全长基因组序列进行遗传演化分析、同源性分析及氨基酸比对分析。最后感染仔猪,对分离的病毒进行体内致病性分析。结果与讨论三株病毒在PAM和MARC-145细胞上均有较高的生长滴度。全基因组序列分析结果显示:三株病毒在NSP2编码区存在与HP-PRRSV分子特征一致的不连续的30个氨基酸的缺失,提示三株病毒均属于HP-PRRSV。全基因组序列进行比较分析结果显示:3株NT病毒在全基因组与JXA1传代的同源性最高,在99.5-99.7%之间。遗传演化分析结果显示:三株NT病毒与JXA1传代病毒在同一进化分支上,同属于北美型PRRSV种HP-PRRSV分支。氨基酸分析结果显示:三株NT病毒一共具有12个JXA1-P80特征性氨基酸位点,分别位于基因组ORF1a(Asp686,Thr782,Va1958,Arg981,Gly987,Met1092,Leu1422和Asp1659)、ORF1b(Gly420,His844和Thr1033)和GP4(Val172)编码区。体内致病性试验结果显示:三株NT病毒能够引起包括发热在内的PRRS临床症状,均能导致超过半数的仔猪死亡。结论三株NT病毒可能来源于HP-PRRSV疫苗株JXA1-P80毒力反强。

关键词： HP-PRRSV 疫苗株高致病性同源的分离鉴定

来源：评论

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猪繁殖与呼吸综合症病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体的制备及其抗病毒功能研究

猪繁殖与呼吸综合症病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体的制备及其抗病毒...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘红亮王妍肖书奇周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reprodluctive and respiratory syndrome,PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一种急性传染病,是目前严重危害我国乃至世界养猪业的重要病毒性传染病。目前尚无针对该病确实有效的防止措施,研发新型的... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reprodluctive and respiratory syndrome,PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一种急性传染病,是目前严重危害我国乃至世界养猪业的重要病毒性传染病。目前尚无针对该病确实有效的防止措施,研发新型的抗病毒方法已经成为PRRS研究的热点。PRRSV非结构蛋白Nsp9具有RNA依赖的RNA聚合酶活性,在病毒基因复制和转录过程中发挥着关键的作用,并且Nsp9在不同毒株之间相对比较保守,因此Nsp9是研发抗病毒药物的理想靶蛋白。本实验表达并纯化了可溶性Nsp9重组蛋白,将其免疫成年雄性双峰驼。经过5轮免疫后采集实验动物血液,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA并反转录cDNA,利用巢式PCR扩增VHH基因,将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体,转化TG1感受态细胞构建双峰驼重链抗体可变区抗体文库。利用噬菌体展示技术筛选Nsp9特异性纳米抗体,经过3轮淘选,筛选到8株Nsp9特异性纳米抗体。co-IP实验表明在细胞质中表达的纳米抗体Nb6和Nb7可以特异性结合Nsp9。为了研究纳米抗体潜在的抗病毒功能,我们构建了稳定表达Nb6和Nb7的Marc-145细胞系,细胞增殖实验结果表明纳米抗体并不影响细胞的生长。病毒感染实验结果表明Nb6可以抑制不同PRRSV毒株（SD-16、JX-A1、GD-HD、VR2332）在Marc-145细胞中的增殖。研究还发现,稳定表达Nb6的Marc-145细胞细胞病变（CPE）出现的时间要明显晚于对照组。用0.01 MOI或更低的毒量接种Marc-145细胞系,感染后5天细胞没有出现CPE,并且上清中未检测到感染性的PRRSV。进一步的研究发现,Nb6是通过抑制PRRSV基因的复制和转录进而抑制病毒的增殖。本实验制备了PRRSV Nsp特异性纳米抗体,为Nsp9及其功能的研究提供了有用的工具。其中Nb6可以抑制病毒的增殖,其有望开发成为新型的PRRS治疗药物。

关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒 PRRSV 抗病毒功能非结构蛋白纳米抗体

来源：评论

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轮状病毒VP7基因在昆虫细胞上的表达

轮状病毒VP7基因在昆虫细胞上的表达

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基罗思思广西兽医研究所

引言牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)是引起犊牛腹泻的主要病原体,主要感染1-7日龄犊牛,可引起犊牛消化道机能紊乱,临床上以呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡失调为主要特征。由于轮状病毒具有流行广、发病率高、危害大的特点,现己发展成... 详细信息

引言牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)是引起犊牛腹泻的主要病原体,主要感染1-7日龄犊牛,可引起犊牛消化道机能紊乱,临床上以呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡失调为主要特征。由于轮状病毒具有流行广、发病率高、危害大的特点,现己发展成为一种世界性疾病,给世界各地的养牛业造成了巨大的经济损失。BRV的结构蛋白VP7还是一种Ca2+结合蛋白,与病毒粒子的形态形成和稳定有关。VP7的抗原决定簇大多具有构象性,因此给BRV疫苗的研制带来了困难。因此本研究旨在昆虫细胞上克隆表达VP7基因,并将获得天然蛋白折叠特性的BRV VP7衣壳蛋白,制备出具有良好反应原性的抗原,为BRV诊断试剂盒的研发奠定基础。材料与方法 BRV分离株NADL冻干毒购于中国兽药监察所;BRV阳性血清由本实验室保存;pFastBacHTA质粒、***10和DH10BAC菌株,为云南出入境检验检疫局动检实验室惠赠。本研究利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamEⅠ和PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmi耐-VP7。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE和western bloting分析。结果与讨论结果显示,实验成功扩增VP7基因,大小为981bp,重组蛋白大小为63.1KU,与预期值相符Westemblotting分析表明该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。本研究扩增和克隆了NCDV VP7基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系,在昆虫细胞上表克重组VP7蛋白。杆状病毒表达系统比起传统原核表达系统具有以下的优越性:安全性好、表达效率高、表达的蛋白具有生物学活性、重组病毒将不能产生多角体,更加安全、容量大。适合于下一步大量的制备与纯化蛋白,为建立BRVELISA检测试剂盒奠定基础。

关键词：昆虫细胞 VP7 牛轮状病毒

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