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HBc嵌合PRRSV GP5 CLP候选疫苗的构建及其免疫研究

HBc嵌合PRRSV GP5 CLP候选疫苗的构建及其免疫研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：曹佳媛田明尧辛舒崔卓栋金宁一中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

目前,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在全球范围内流行,基因型表现出高度可变性,对疾病的防控产生了巨大的阻碍。现阶段对PRRS的防控主要采取疫苗接种的方式,但存在一定的局限性,不能对猪群提供全面持久的保护,因此积极发展新型疫苗对控... 详细信息

目前,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在全球范围内流行,基因型表现出高度可变性,对疾病的防控产生了巨大的阻碍。现阶段对PRRS的防控主要采取疫苗接种的方式,但存在一定的局限性,不能对猪群提供全面持久的保护,因此积极发展新型疫苗对控制PRRSV感染与流行有着重要的意义。自成功采用乙肝病毒核心蛋白(HBc)作为疫苗载体表达了口蹄疫病毒抗原表位以来,HBc被越来越多的应用于病毒样颗粒(VLPs)疫苗的研制。作为VLPs疫苗载体,HBc具有以下特点:天然条件下能够自我组装成颗粒样结构,插入位点灵活,装配效率高(>95%),可以提呈抗原,能够在多种表达系统中稳定表达等。本研究以HBc为载体表达PRRSV GP5保护性抗原,构建了HBc-GP5表位VLPs候选疫苗,并对其进行小鼠免疫评价。首先根据Escherichia coli(strain K12)密码子偏好性对HBc序列进行密码子优化,并将其克隆至改造的pET-28a原核表达载体中,获得重组质粒pEO-NEW。经SDS-PAGE、Western blot及透射电镜等方法对表达获得的VLPs进行鉴定,结果表明成功诱导表达了HBc蛋白且表达后蛋白能够自主装配成VLPs,为下一步重组疫苗制备提供研究基础。基于所得到的pEO-NEW表达载体,将优化后的GP5基因插入至pEO-NEW载体的免疫显性区(MIR),获得重组质粒pEO-LEORF。通过SDS-PAGE和Western blot方法鉴定重组目的蛋白,结果显示,成功诱导表达GP5蛋白。经透射电镜对其形态进行观察,结果显示,诱导后的重组蛋白能够自主装配成VLPs。以小鼠为模型分析该HBc-GP5 VLPs候选疫苗的免疫原性,利用ELISA进行抗体检测,结果表明其能够诱导机体产生较高的特异抗体水平;对T细胞亚群及细胞因子进行检测结果表明,疫苗免疫组小鼠CD3+CD4+T细胞淋巴细胞亚型数量及IL-4水平显著高于对照组(P<0.05),淋巴细胞刺激指数(SI)及第三次免疫后IFN-γ含量与对照组相比显著提高(P<0.05),说明HBc-GP5表位VLPs候选疫苗能够模拟病毒样颗粒,有效提呈GP5并诱导机体产生体液和细胞免疫,为下一步实验研究提供数据基础。

关键词：候选疫苗 PRRSV GP5 CLP HBc 免疫研究 CLP

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猪伪狂犬病毒2013年广东株的分离及gB基因序列分析

猪伪狂犬病毒2013年广东株的分离及gB基因序列分析

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：黄元罗振南陈晶赵翠玲王晓虎黄忠向华广东省农业科学院动物卫生研究所广东省兽医公共卫生公共实验室华中农业大学动物医学学院

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种重要动物传染病。2011年以来,我国多个的省份暴发了猪伪狂犬病。临床发病情况表明,在免疫Bartha-K61的区域大面积发生猪伪狂犬病。这提示病毒的抗原性已经... 详细信息

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种重要动物传染病。2011年以来,我国多个的省份暴发了猪伪狂犬病。临床发病情况表明,在免疫Bartha-K61的区域大面积发生猪伪狂犬病。这提示病毒的抗原性已经发生了改变。材料与方法本研究分离了2013年广东流行的3株猪伪狂犬病毒,对其gB基因进行了序列测定。取来自伪狂犬病发病猪场的46份血清(用ELISA检测gE抗体全部阳性),分别用广东2013毒株Heyuan2013、鄂A株和Batha株进行抗体中和试验。结果与讨论核苷酸序列分析表明,2013年广东流行毒株相互之间gB基因核苷酸序列相似性为99.7-100%,而与疫苗株Batha-K61相似性在97.8-98.0%。这表明2013年这几处流行均为同一毒株造成。氨基酸序列比对结果表明,gB基因氨基酸序列与传统疫苗株Bartha-K61相比,已有巨大的差异,尤其是在gB基因的N端,总计有17个氨基酸的变异,其中包括3个氨基酸的缺失,1个氨基酸的插入和15个氨基酸的替换。这17个氨基酸的变异均发生在gB基因的N端,在gB蛋白的第一个抗原表位处。抗体中和试验表明,用3个毒株测得的中和抗体效价呈显著的差异,河源野毒株>鄂A株>Bartha。这表明三个毒株的血清学特性已经有了显著的差异,三种毒株的抗原性已经发生了显著的变化。其中,疫苗株Batha与鄂A株之间的差异较小,而广东流行毒株Heyuan-2013与其余两株之间的差异较大。结论 2013年广东流行毒株与Batha疫苗株相比,gB基因发生了17个氨基酸的巨大变异;流行毒与疫苗株鄂A株及Bartha株的血清学特性已经发生了显著变化:gB基因的变异可能是产生血清学变化的原因之一。

关键词：伪狂犬病毒分离鉴定 gB基因序列分析

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鼠伤寒沙门菌SL1344株cya基因缺失株减毒机制的初步研究

鼠伤寒沙门菌SL1344株cya基因缺失株减毒机制的初步研究

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：张春杰陈松彪程相朝余祖华何雷郁川廖成水贾艳艳河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室

引言鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhmurium)是具有广泛的宿主,是目前世界各国分离率最高的菌型之一。该菌能引起各种哺乳动物以及人类发生全身性感染,具有重要的公共卫生意义。本研究以鼠伤寒沙门菌SL1344株cya基因缺失株为研究对象进行... 详细信息

引言鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhmurium)是具有广泛的宿主,是目前世界各国分离率最高的菌型之一。该菌能引起各种哺乳动物以及人类发生全身性感染,具有重要的公共卫生意义。本研究以鼠伤寒沙门菌SL1344株cya基因缺失株为研究对象进行生物学特性的检测,进一步对cya基因缺失株的减毒机制进行初步研究。材料与方法本研究以鼠伤寒沙门菌亲本菌株SL1344以及cya基因缺失株为研究对象,对亲本菌株和cya缺失株进行耐酸碱性、耐盐性、运动性、生物生物被膜主要成分以及黏附和入侵等生物学特性的测定。结果与讨论耐酸碱性以及耐盐性结果表明:cya基因缺失后其对酸碱性以及盐的耐受性较亲本菌株相比均发生了下降,有研究表明鼠伤寒沙门菌sipB基因缺失后会影响其细胞膜的耐高渗能力,由此笔者猜测cya基因可能与sipB基因存在调控关系,所以该基因缺失后会影响sipB基因的表达。cya基因缺失株的运动型试验结果表明该基因缺失后细菌失去了运动能力,这与Javie等构建的爱德华菌的crp基因缺失株的结果相一致,说明crp和cya基因缺失后可能会影响细菌的鞭毛的形成,一旦鞭毛的形成受阻势必会影响细菌的运动。生物被膜的主要成分为卷曲菌毛和纤维素,在本试验中cya缺失菌株的生物被膜主要成份测定表明:该基因缺失后影响菌毛和纤维素的表达,故缺失菌株在刚果红平板上呈现白色光滑的菌落形态,从而有可能影响其生物被膜的形成,从而影响其的毒力,这与本实验室的前期出现的结果相一致,即cya基因缺失株可能是通过影响生物被膜的形成从而达到减毒的目的,紧接着我们又进行了该基因缺失株对上皮细胞的黏附和侵入试验,发现cya基因缺失后会影响其对上皮细胞的黏附和入侵能力,从而达到减毒的目的。

关键词：基因缺失株 SL1344 cya 减毒机制鼠伤寒沙门菌初步研究

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PRRSV感染的PAM中ISGs表达分析

PRRSV感染的PAM中ISGs表达分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：马改妮刘珂魏建超邵东华邱亚峰马志永中国农业科学院上海兽医研究所

前言猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称蓝耳病,是严重危害我国生猪产业的重大病毒性传染病。猪肺泡巨噬细胞(PAM)是PRRSV最主要的靶细胞。据报道已有数种干扰素刺激基因(ISGs)能够抑制PRRS... 详细信息

前言猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称蓝耳病,是严重危害我国生猪产业的重大病毒性传染病。猪肺泡巨噬细胞(PAM)是PRRSV最主要的靶细胞。据报道已有数种干扰素刺激基因(ISGs)能够抑制PRRSV的复制。本实验对PRRSV感染的PAM中的表达进行了分析。实验方法(1)PAM的分离:选取10头选取40日龄健康断奶小猪,进行CSFV抗原、PPV抗原、PCV2抗原、PRV抗体、PRRSV抗体和抗原的检测。选定阴性健康猪。对猪进行安乐死后,打开胸腔分离肺脏。在超净工作台中,向猪肺脏中灌入灭菌PBS,灌满后再反复抽吸,将肺泡中的PAM冲出。1000rpm离心10min。用培养液重悬细胞,用100um的滤膜过滤细胞,去掉杂质。1000rpm离心10min,培养液重悬细胞,对细胞液进行计数,稀释到5*106个/ml。(2)IFN使用量的筛选:将分离的PAM以没孔106个的数量接种之24孔细胞培养板中,细胞两小时后贴壁,用PBS洗掉不贴壁和死细胞,用100ng/ml、200ng/ml和300ng/ml的猪alfa IFN作用24小时后,接0.1 MOI的PRRSV,作用2h后换1%维持液,24小时后收样,检测病毒复制情况。(3)ISGs表达分析:将分离的PAM以没孔106个的数量接种之24孔细胞培养板中,细胞两小时后贴壁,用PBS洗掉不贴壁和死细胞,用200ng/ml的猪alfaIFN作用24小时后,接0.1 MOI的PRRSV,作用2h后换1%维持液,分别在4h、12h、24h收样。提取RNA,反转录获得cDNA,进行real-timePCR检测,分析ISG15,ISG56,Mx1表达情况和PRRSV复制情况。实验结果用100ng/ml、200ng/ml和300ng/ml的猪alfa IFN作用PAM,检测病毒复制情况,200ng/ml的IFN对PRRSV的抑制作用更明显。猪I型干扰素能够抑制PRRSV的复制,接毒后12h和24h抑制效果明显。接毒组ISG15,SG56,Mx1在接毒后4h的表达量与对照组相比较没有较大的差别。接毒后12h和24h,相比较于对照组,实验组ISG15,SG56,Mx1的表达量差异显著,且12h时的差异更显著。

关键词： PRRSV MOI 病毒复制细胞培养板 PAM

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传染性法氏囊病病毒对鸡法氏囊组织中干扰素和p53转录的影响

传染性法氏囊病病毒对鸡法氏囊组织中干扰素和p53转录的影响

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：欧阳伟王永山刘华洁杜希宁张海彬江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心南京师范大学生命科学学院

为了分析传染性法氏囊病病毒(HBDV)感染对鸡体抗病毒天然免疫的影响,用IBDV弱毒(B87)和强毒(QL/12)分别感染4周龄SPF鸡,每隔12h时(12～84h)取3只鸡的法氏囊组织作为一个pool,用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测其感染前后干扰素(IFN)和p53的... 详细信息

为了分析传染性法氏囊病病毒(HBDV)感染对鸡体抗病毒天然免疫的影响,用IBDV弱毒(B87)和强毒(QL/12)分别感染4周龄SPF鸡,每隔12h时(12～84h)取3只鸡的法氏囊组织作为一个pool,用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测其感染前后干扰素(IFN)和p53的mRNA水平,同时分析法氏囊组织的病理变化和病毒载量。结果显示:在QL/12组,IFN-α和IFN-βmRNA水平随着时间的增加逐渐升高,48h达到峰值,随后降低;IFN-γmRNA水平随着时间的增加逐渐升高,60h达到峰值,随后逐渐降低;p53 mRNA含量迅速升高,60h达到峰值,随后降低。在B87组,IFN-αmRNA水平先降低后升高(48h达到最低值),而IFN-βmRNA水平变化不规则,72h含量最高;IFN-γmRNA水平先逐渐升高后降低(72h达到峰值);p53mRNA含量变化较小,36h含量最高。QL/12组诱导法氏囊组织产生的IFN mRNA(IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA)以及p53 mRNA水平均显著高于B87组。病理组织学检查,QL/12组法氏囊淋巴滤泡呈不同程度的损伤,而B87组法氏囊组织未见明显的组织病变。qRT-PCR检测,QL/12组法氏囊组织中病毒含量48h达到峰(8.4×10～6copies/mg),而B87组法氏囊组织中病毒含量72h达到峰值(6.6×10～4copies/mg)。本研究结果表明IBDV感染严重干扰了鸡体IFN和p53介导的抗病毒天然免疫反应。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) 干扰素 p53 天然免疫

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猪鼻支原体vlp家族重组蛋白的构建表达及黏附宿主细胞功能检测

猪鼻支原体vlp家族重组蛋白的构建表达及黏附宿主细胞功能检测

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王佳熊祺琰纪燕倪博张必雄马庆红刘茂军冯志新邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

目的猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)在临床猪场的感染率极高,可引起猪的多种慢性炎症,同时其与多种人类肿瘤具有相关性,属人兽共患性病原。目前对猪鼻支原体的黏附因子及致病机制等尚不清楚。本研究以猪鼻支原体表面的可变脂蛋白(vlp... 详细信息

目的猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)在临床猪场的感染率极高,可引起猪的多种慢性炎症,同时其与多种人类肿瘤具有相关性,属人兽共患性病原。目前对猪鼻支原体的黏附因子及致病机制等尚不清楚。本研究以猪鼻支原体表面的可变脂蛋白(vlp)家族为研究对象,鉴定其对宿主细胞的黏附能力。材料与方法根据已公布的猪鼻支原体vlp家族7种成员的基因序列设计引物,扩增目的基因,并将该基因片段装入pET-32a(+)原核表达载体中构建重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,质粒转化大肠杆菌,筛选获得阳性克隆。重组工程菌经IPTG诱导表达目的蛋白,经镍柱亲和层析获得7种纯化的vlp重组蛋白。利用间接免疫荧光法及微孔板定量法分别对vlp各个成员的黏附功能进行鉴定。结果与讨论成功构建了7种重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,获得阳性重组工程菌。经IPTG诱导及镍柱亲和层析纯化,获得了较纯的7种vlp重组蛋白。间接免疫荧光检测结果显示,vlpA、vlpB、vlpC蛋白黏附PK细胞最为明显;vlpE和vlpG蛋白亦有黏附,但荧光密度稍弱;vlpD及vlpF蛋白孵育孔与阴性对照孔及空白载体蛋白对照孔相比,无明显差异。微孔板黏附定量试验检测结果显示,重组蛋白vlpA、vlpB、vlpC、vlpE、vlpG可明显黏附PK细胞并呈现剂量依赖性;重组蛋白vlpD粘附力较低,但在蛋白浓度12.5～50μg/ml之间,粘附强度有所上升,具有统计学差异;重组蛋白vlpF与空白载体蛋白对照相比粘附能力不明显,该结果与间接免疫荧光检测结果基本一致;在STEC细胞中,7种Vlp重组蛋白对细胞的黏附均有统计学差异,并有明显剂量依赖性。重组vlpD和vlpF对STEC细胞的粘附强于其对PK细胞的粘附。结论本研究成功构建了猪鼻支原体7种vlp的重组蛋白,并对其黏附功能进行了初步鉴定,证明vlp为猪鼻支原体的黏附因子之一。

关键词：猪鼻支原体重组蛋白宿主细胞 vlp 功能检测

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构建表达GM-CSF的重组PRRSV

构建表达GM-CSF的重组PRRSV

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：虞凌雪周艳君姜一峰童武童光志中国农业科学院上海兽医研究所

引言猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染能够延迟宿主产生中和抗体和细胞免疫应答,造成免疫抑制。树突状细胞(DC)作为专业抗原递呈细胞,能够被粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集、活化并成熟,进而引发获得性免疫。为了更好地提高... 详细信息

引言猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染能够延迟宿主产生中和抗体和细胞免疫应答,造成免疫抑制。树突状细胞(DC)作为专业抗原递呈细胞,能够被粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集、活化并成熟,进而引发获得性免疫。为了更好地提高PRRSV弱毒苗的免疫水平,本研究拟在PRRSV弱毒疫苗株中构建能够表达猪源GM-CSF的重组PRRSV,为该病的预防和控制提供新的思路。材料和方法以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)弱毒疫苗HuN4-F112株为载体,在其感染性分子克隆的基础上,利用融合PCR法,在ORF1b和ORF2a间插入猪源GM-CSF和PRRSVORF6转录调控序列(TRS6),用限制性内切酶Swa I将重组GM-CSF的PRRSV全基因cDNA克隆线性化,通过体外转录获得病毒RNA。将重组病毒RNA转染BHK-21细胞,并在Marc-145细胞进行病毒拯救。将救获的重组病毒经鉴定后,在Marc-145上连续传代分析其生物学特性和遗传稳定性。结果(1)救获的重组病毒HuN4-F112-GM在感染Marc-145细胞72小时后,即可以观察到明显的细胞病变,IFA检测结果显示引入的猪源GM-CSF能够在感染的细胞中产生特异性荧光,且救获的重组病毒可以被PRRSV N蛋白特异性单抗识别,表明我们成功获得了重组病毒HuN4-F112-GM。(2)对重组病毒HuN4-F112-GM进行遗传稳定性分析结果显示,在连续传至20代时各代次病毒中插入的外源基因GM-CSF均未发生突变、缺失和插入等。(3)绘制第5、10、15、20代重组病毒HuN4-F112-GM的多步生长曲线,结果显示该重组病毒与亲本毒相比生长特性基本一致,表明外源基因GM-CSF的插入未影响病毒复制。结论本研究成功救获了能够表达猪源GM-CSF的重组病毒HuN4-F112-GM,该重组病毒保持了亲本毒的增殖特性,且具有遗传稳定性,为进一步在机体内对重组病毒HuN4-F112-GM进行免疫评价奠定基础。

关键词： CSF 外源基因 PRRSV 重组病毒 GM-CSF

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猪支原体肺炎动物发病模型的建立

猪支原体肺炎动物发病模型的建立

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：杨若松冯志新华利忠熊祺琰 Hassan Zackaria Ali Ishag 陈财王佳武昱孜刘茂军邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心张家口市动物疫病预防控制中心

目的猪支原体肺炎是一种由猪肺炎支原体引起的猪的慢性呼吸道传染病,对我国养猪业带来了很大的不良影响,建立可靠的猪肺炎支原体实验动物攻毒模型,是研制新型猪支原体肺炎疫苗和药物的前提,本研究旨在建立一个标准的猪支原体肺炎发病模... 详细信息

目的猪支原体肺炎是一种由猪肺炎支原体引起的猪的慢性呼吸道传染病,对我国养猪业带来了很大的不良影响,建立可靠的猪肺炎支原体实验动物攻毒模型,是研制新型猪支原体肺炎疫苗和药物的前提,本研究旨在建立一个标准的猪支原体肺炎发病模型。材料与方法本研究使用的猪支原体肺炎冻干组织毒保存于江苏省农业科学院,试验猪为没有猪支原体肺炎感染的健康二元猪。首先,通过荧光定量PCR方法确定组织毒中病原的含量。其次,利用小鼠接种试验,确定攻毒材料的安全性。再次,将组织强毒按照1:10,1:100,1:1000,1:10000进行稀释,计算感染支原体病原的拷贝数,经气管内注射途径对试验猪进行感染。最后,攻毒后28天,剖检感染猪,观察肺脏病变情况和临床症状,确定猪肺炎支原体为多少拷贝时,为最佳攻毒剂量,建立猪支原体肺炎人工发病模型,并对该病的人工发病模型标准化。结果与讨论猪肺炎支原体感染剂量为9.5×10～6copies时,肺脏评分均分为17.3;9.5×10～5copies时,均分为10.75;9.5×10～4copies时,均分为10.75;9.5×10～3copies时,均分为6.8。根据28分评分法对肺脏病变组织评分,均分在10以上,达到发病判断标准,本研究建立的猪支原体肺炎发病模型为将猪肺炎支原体含量大于9.5×10～4 copies的组织强毒,经气管内注射途径对健康二元猪感染,可以引起猪支原体肺炎,发病率达到100%。通过本研究发现,肺脏病变的评分和攻毒剂量未见显著的线性相关关系,推断猪支原体肺炎强毒感染动物后,支原体只要达到发病的阈值,即可引起发病。结论本研究建立了一个稳定的猪支原体肺炎发病模型,并对其完成了标准化,为猪支原体肺炎新疫苗、新药物的效力实验提供了良好的技术平台。

关键词：猪支原体肺炎猪肺炎支原体

来源：评论

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含有新城疫病毒M、F、HN基因病毒样颗粒的构建及表达

含有新城疫病毒M、F、HN基因病毒样颗粒的构建及表达

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：钱晶丛彦龙袁乾亮薛聪尹仁福王珂张平仄丁壮吉林大学动物医学学院

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽类为主的一种急性、高度接触性、致死性传染病。利用昆虫杆状病毒表达系统表达新城疫病毒主要结构基因,可组装成结构空心化的蛋白颗粒,即新城疫病毒样颗粒,该类颗粒与完整病毒的免疫原性相似,无复制... 详细信息

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽类为主的一种急性、高度接触性、致死性传染病。利用昆虫杆状病毒表达系统表达新城疫病毒主要结构基因,可组装成结构空心化的蛋白颗粒,即新城疫病毒样颗粒,该类颗粒与完整病毒的免疫原性相似,无复制和感染能力,具有理想疫苗及其载体的诸多优势。本研究以当前流行的基因Ⅶ型新城疫病毒NA-1株为研究对象,分别扩增其M、F、HN基因,以M+F和M+HN组合形式连接至pFastBac Dual转移载体中,利用Bac-to-Bac系统,将目的片段分别重组至野生杆状病毒上,最终构建了共表达的重组杆状病毒rBV-M+F和rBV-M+HN。进一步对提取的第3代重组杆状病毒基因组DNA,经PCR鉴定结果均与预期结果相符;同时对感染Sf9细胞和细胞培养上清进行Western blotting检测,结果显示在rBV-M+F感染的细胞培养上清可见约40kDa和60kDa条带,而感染细胞沉淀中仅有约60kDa条带;另一组rBV-M+HN感染的细胞培养上清可见约40kDa和70kDa条带,感染细胞沉淀中仅有约70kDa条带,蛋白大小与预期结果一致。已有研究表明,单独表达新城疫病毒M基因即可形成病毒样颗粒,说明M蛋白是形成新城疫病毒样颗粒的主要驱动力。F和HN蛋白作为新城疫病毒的主要糖蛋白,对其毒力起到关键作用。实验结果表明,M与F蛋白或HN蛋白的组合均可分泌到细胞培养上清中,说明以M蛋白为骨架新城疫病毒样颗粒会以出芽形式释放到Sf9细胞外,这可能与新城疫病毒感染细胞后的出芽形式相似。因此,本实验构建两种不同组合的新城疫病毒样颗粒(即M+F和M+HN),进而研究含有不同糖蛋白的病毒样颗粒对宿主免疫应答的影响,试图探讨F蛋白和HN蛋白在细胞水平上的生物学活性及其之间的潜在联系,同时也为新型新城疫疫苗的研制提供新策略。

关键词：新城疫病毒糖蛋白培养上清病毒样颗粒

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鸡IFN-γ基因的克隆表达及单克隆抗体制备

鸡IFN-γ基因的克隆表达及单克隆抗体制备

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：柳亚楠王永强李晓齐曹红郑世军中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室

引言γ-干扰素（IFN-γ）是由活化的T淋巴细胞和NK细胞产生的,属于Ⅱ型干扰素。鸡IFN-γ（chIFN-γ）发现于1995年,由Digby和Lowenthal首先成功克隆出了chIFN-γ基因,是一种单拷贝基因。chIFN-γ有495个碱基组成,切去信号肽的成熟蛋白... 详细信息

引言γ-干扰素（IFN-γ）是由活化的T淋巴细胞和NK细胞产生的,属于Ⅱ型干扰素。鸡IFN-γ（chIFN-γ）发现于1995年,由Digby和Lowenthal首先成功克隆出了chIFN-γ基因,是一种单拷贝基因。chIFN-γ有495个碱基组成,切去信号肽的成熟蛋白大小含有145个氨基酸,约为16.8 kDa。不同种属IFN-γ氨基酸同源性较低,具有较强的种属特异性,不同种属的IFNγ相互间很难发挥生物学作用。国内对于chIFN-γ的研究较少,基本处于起步阶段。本研究利用原核表达鸡IFN-γ蛋白,通过免疫小鼠、细胞融合和筛选制备出针对chIFN-γ的单克隆抗体,为进一步研究chIFN-γ的功能奠定了基础。材料与方法大肠杆菌DH5α、Rosseta感受态细胞、质粒pET-28a、pGEX-6P-1、SP2/0细胞等由中国农业大学免疫生物学实验室保存。根据Current Protocol in Immunology上提供的方法进行细胞融合、筛选及亚克隆,并利用ELISA、Westem Blot方法对获得的单抗进行鉴定。结果与讨论从鸡外周血淋巴细胞中提取RNA进行反转录,利用特异性引物进行PCR,获得chIFN-γ基因。构建原核表达载体chifn-γ-pET-28a和chifn-γ-pGEX-6P-1,测序正确后转入感受态细胞Rosseta进行诱导表达,然后纯化得到chIFN-γ-His和chIFN-γ-GST蛋白,分别用于免疫小鼠和筛选杂交瘤细胞株的抗原。用chIFN-γ-His免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后进行细胞融合、筛选、亚克隆得到2株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2B10,4D10。应用间接ELISA方法测定2株单抗的重链类型均为IgG1。应用间接ELISA方法测定2株单抗的亲和力解离常数（K）分别为6.36*10和8.12*10,表明2株单抗均为高亲和力抗体。将chIFN-γ进行C端、N端同时截短,应用Westem Blot方法鉴定2株单抗的抗原识别表位均为chIFN-γ的100-145位氨基酸。应用Western Blot方法鉴定2株单抗的特异性,2株单抗均能识别原核表达的chIFN-γ蛋白,而不识别对应的chIL-2、chIL-4、chIL-10、chIFN-β蛋白,表明4株单抗特异性良好。结论实验结果表明以原核表达chIFN-γ蛋白制备单克隆抗体效果良好,为进一步研究chIFN-γ的功能提供了重要工具。

关键词：单克隆抗体制备原核表达 ELISA 不同种属细胞融合 IFN

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