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猪致病性大肠杆菌O9菌蜕的制备及免疫保护力

猪致病性大肠杆菌O9菌蜕的制备及免疫保护力

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李书光胡琳琳王金良肖跃强沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院山东绿都生物科技有限公司

引言菌影是由裂解基因E调控表达而形成的一种多形态、无活力的、具有一定抗原承载能力的、靶向全身和黏膜免疫系统的细菌菌体。基本上不含有基因组,但是有与原始菌体同样功能的抗原决定簇,能够激发细胞免疫和体液免疫系统。同时菌影含... 详细信息

引言菌影是由裂解基因E调控表达而形成的一种多形态、无活力的、具有一定抗原承载能力的、靶向全身和黏膜免疫系统的细菌菌体。基本上不含有基因组,但是有与原始菌体同样功能的抗原决定簇,能够激发细胞免疫和体液免疫系统。同时菌影含有脂多糖类、类脂A肽聚糖等免疫刺激复合物,具有一定的内在佐剂效应。目的:本试验以猪致病性大肠杆菌O9为对象,构建了大肠杆菌快速非质粒依赖型菌蜕菌株筛选平台,探索其融菌效率和免疫保护力,为猪大肠杆菌病的预防治疗和新型疫苗的研究提供理论依据。材料与方法(1)载体、菌株及相关试剂:猪致病性大肠杆菌O9为山东滨州畜牧兽医研究院重点实验室分离鉴定保存。(2)温控表达盒的构建:扩增的目的产物连接pMD-18T载体构建pMD-18T-E,酶切、PCR鉴定。双酶切pBV220和pMD-18T-E,使用T4 DNA连接酶连接。(3)受体菌感受态细胞的制备:-70℃保存。(4)同源重组:电压:1.8 kV,脉冲25μF,电阻200Ω条件下进行电击、筛选。(5)菌蜕的制备:样品组在4 2℃培养。(6)菌蜕安全性试验及免疫保护试验:使用5周龄非免疫健康小鼠随机进行。结果成功构建温控融菌表达盒,并成功将融菌基因融入猪致病性大肠杆菌O9。30℃继续培养的产物D600值持续升高,出现明显的增菌现象,42℃诱导融菌蛋白的表达,30～60min开始融菌,融菌动力学曲线直观的表现出样品组和对照组D600菌蜕的安全性试验及免疫保护性试验证实菌蜕的安全性可靠。结果皮下免疫组攻毒保护率最高达到71.43%。讨论(1)Red重组系统的运用,避免了重组臂长片段的应用,缩短了重组周期,提高了重组效率。(2)猪致病性大肠杆菌O9的安全性及免疫保护效果本试验未使用本动物开展猪致病性大肠杆菌O9菌蜕的安全性试验和免疫保护性试验,使用了对大肠杆菌敏感的昆明系小鼠,不能够完全替代本动物的试验。

关键词：大肠杆菌免疫保护力

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中国地方牛品种遗传组成和环境适应性的群体基因组学分析

中国地方牛品种遗传组成和环境适应性的群体基因组学分析

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第十六次全国畜禽遗传标记学术研讨会

作者：张毅高亚辉 Mathieu Gautier 丁向东张浩王雅春王曦 MD Omar Faruque 李俊雅叶绍辉苟萧韩建林 Johannes A.Lenstra 中国农业大学动物科技学院法国农业科学院山西农科院畜牧研究所孟加拉农业大学动物科技学院中国农科院北京畜牧兽医研究所云南农业大学动物科技学院中国农科院北京畜牧兽医研究所CAAS-ILRI 联合实验室荷兰乌得勒支大学动物医学系

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福建及邻近省份禽源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

福建及邻近省份禽源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：程龙飞许利娜林建生陈红梅仇微红施少华叶和佳胡秀美梁昭平黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所广州市华南生物药品有限公司

前言为探明近几年来流行于我国部分地区的禽源多杀性巴氏杆菌的血清型,本研究对福建及邻近省份的疑似禽霍乱病死亡鸡、鸭进行细菌分离、鉴定,现报道如下。材料和方法(1)病料来源:2007～2013年福建、浙江、江西、安徽、广东、广西、河北... 详细信息

前言为探明近几年来流行于我国部分地区的禽源多杀性巴氏杆菌的血清型,本研究对福建及邻近省份的疑似禽霍乱病死亡鸡、鸭进行细菌分离、鉴定,现报道如下。材料和方法(1)病料来源:2007～2013年福建、浙江、江西、安徽、广东、广西、河北等省疑似禽霍乱死亡鸡、鸭、鹅。从肝脏分离细菌,革兰氏染色,生化试验进行初步鉴定。(2)分离菌的种鉴定和荚膜群群鉴定:用于种鉴定和荚膜群鉴定的引物和方法参考文献1。同时以双蒸水为空白对照,以多杀性巴氏杆菌CVCC44801株、CVCC392株提取的基因组DNA分别为荚膜群A型和D型的阳性对照。(3)分离菌的Heddleston氏耐热菌体抗原型鉴定:采用琼脂扩散法进行。结果(1)细菌的分离和鉴定:初步鉴定阳性菌株,共有95株(74株来源于鸭,17株来源于鸡,4株来源于鹅)。(2)细菌的种鉴定和英膜群群鉴定:95株均能扩增出与CVCC44801株相同的两个特异性条带,其中一个约460bp,另一个约1044 bp,说明这些细菌均为荚膜群A型的多杀性巴氏杆菌。(3)耐热菌体抗原型鉴定:琼脂扩散试验结果显示,1型64株,占67.4%,为最常见的血清型。1(14)型14株,占14.7%;1(4、14)型9株,占9.5%。除此外,还有1(2、14)、5、12、14型等。讨论多杀性巴氏杆菌的血清型表示方法,是将Carter荚膜群抗原分型(大写英文字母A、B、D、E、F)和Heddleston耐热菌体抗原分型(阿拉伯数字1-16,加括号表示较弱的反应)相结合。我国1979年开始对多杀性巴氏杆菌进行血清学分型研究,报道的均以A:1为主,偶有鸭源荚膜群B型和鸡源英膜群D型。本试验中,74株鸭源、17株鸡源和4株鹅源多杀性巴氏杆菌分离株的血清型以A:1为主。我们认为,20世纪80年代至今三十多年来,流行于我国的禽源(不含火鸡)多杀性巴氏杆菌的血清型没有发生大的变化。

关键词：禽源多杀性巴氏杆菌耐热菌禽霍乱分离鉴定

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宁夏首例小反刍兽疫疫情诊断报告

宁夏首例小反刍兽疫疫情诊断报告

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：周海宁王进香李知新艾文张成莲王磊张和平宁夏动物疾病预防控制中心

引言 2014年2月15日,宁夏盐池县花马池镇深井村两养殖户发生疑似小反刍兽疫。通过实验室血清学和荧光定量RT-PCR方法检测为小反刍兽疫病毒感染。经国家外来动物疫病诊断中心确诊,该起疫情为小反刍兽疫疫情,这在宁夏为首次报道。材料与... 详细信息

引言 2014年2月15日,宁夏盐池县花马池镇深井村两养殖户发生疑似小反刍兽疫。通过实验室血清学和荧光定量RT-PCR方法检测为小反刍兽疫病毒感染。经国家外来动物疫病诊断中心确诊,该起疫情为小反刍兽疫疫情,这在宁夏为首次报道。材料与方法对盐池县花马池镇深井村两个养殖户的山羊发病情况进行现场调查,随机采集样品,将采集样品进行小反刍兽疫抗体和荧光定量RT-PCR检测。结果经调查,盐池县花马池镇深井村两个养殖户2014年1月底从邻省某活畜交易市场购入活羊,购入后与之前的羊混群饲养。2月13日发现部分购入羊只出现食欲减退,精神沉郁,口鼻有粘性分泌物等症状,经治疗后未见好转,并且陆续出现死亡。解剖的3只山羊,发现口腔和鼻腔黏膜充血、糜烂、坏死;肺脏出血、坏死,肺脏与胸壁粘连;胸腔积液;心脏肿大、呈土黄色;胆囊肿大;肠系膜淋巴结节肿大,化脓;大肠粘膜出血、糜烂、有条纹状出血;肾脏有出血点、水肿;脾脏无明显变化。经实验室检测,24份羊血清样本中14份为小反刍兽疫抗体检测阳性,阳性率58.3%。荧光定量RT-PCR方法进行病毒核酸检测。结果显示,所有的检测样品均出现特异性扩增曲线,最终判定该地区山羊为小反刍兽疫病毒感染。讨论宁夏全区羊只之前并未进行小反刍兽疫免疫,血清学方法检测抗体水平,在一定程度上能够反应出小反刍兽疫在羊群中的感染情况,而荧光定量RT-PCR结果更进一步证明了结论的可靠性。2013年12月份以来,我国新疆、甘肃,内蒙古、宁夏等省(区)又先后暴发小反刍兽疫。截止2014年6月底,已波及22个省(区)。此次疫情的暴发具有传播快、跨度大、风险高等特点,给我国的畜牧业生产造成了严重损失,给动物疫病防控工作带来了严重威胁。宁夏历史上从未发生过羊小反刍兽疫,此次发生的疫病属输入性疫情。本次盐池县疫情的暴发,和养殖户缺乏防疫意识有关。综上所述,畜禽贩运过程已经成为疫病远距离传播的主要途径,应引起畜牧兽医部门的足够重视。

关键词：小反刍兽疫养殖户盐池县小反刍兽疫病毒

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α-synuclein A30P突变减弱小鼠侧脑室下区的神经发生及嗅球的分化

α-synuclein A30P突变减弱小鼠侧脑室下区的神经发生及嗅球的分化

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第五次会员代表大会暨第十六次学术研讨会

作者：张学明 Yongsoo Kim Jenny Brown Richard Wade-Martins Francis Szele 吉林大学畜牧兽医学院动物胚胎工程吉林省重点实验室 Department of Physiology Anatomy and GeneticsUniversity of Oxford

脑室下区(subventricular zone,SVZ)及海马齿状回颗粒下区(subgranular zone,SGZ)是哺乳动物脑内终生存在神经发生的两个主要区域。SVZ产生的多巴胺能神经元经吻侧迁移流(rostral migratory stream,RMS)迁移至嗅球(olfactory bulb,OB)并分化为颗粒细胞层(granular cell layer,GCl)、僧帽细胞层(mitral cell layer,MCl)、外从状层(external plexiform layer,EPl)、突触球层(glomerular layer,Gl)等内的中间神经元;SGZ产生的神经元则迁移至海马齿状回颗粒层成为颗粒细胞。这些细胞能整合入神经网络并发挥功能。已知a-synuclein(SNCA)编码突触核蛋白SNCA,能影响SVZ神经发生中的多巴胺能性神经传递及嗅球的分化。研究表明,SNCA在人类帕金森病等多巴胺能神经退行性疾病的发生发展中扮演着关键角色。现已在家族性帕金森病病例中发现了SNCA的3个点突变:A53T(丙氨酸53-苏氨酸)、A30P(丙氨酸30-脯氨酸)、E46K(谷氨酸46-赖氨酸)。但有关SNCA及其突变对成体SVZ神经发生及嗅球分化的确切作用尚不清楚。本研究采用了携带人SNCA顺式调控元件的细菌人工染色体转基因小鼠(遗传背景均为C57BL),设正常对照(C57BL)、SNCA敲除组(SNCA-/-)及SNCA敲除并表达人SNCAA30P突变(A30PSNCA-/-)3个组,用免疫荧光组织化学方法分析了3组间SVZ神经细胞增殖及嗅球细胞分化的差异。结果显示,①在SVZ内,磷酸化组蛋白3(PH3)阳性的增殖细胞在SNCA-/-鼠明显减少,在A30P SNCA-/-鼠显著减少;②Mash1+细胞在A30PSNCA-/-鼠SVZ内显著减少;③SNCA-/-及SNCAA30P突变致嗅球中心及突触球层(Gl)内的双皮质素Dcx+细胞显著减少;④SNCA-/-及SNCA A30P突变致嗅球Gl内的TH+、Calbindin(CalB)+、Calretinin(CalR)+细胞显著减少;⑤Tunel染色显示,SNCA-/-及A30P SNCA-/-组小鼠嗅球中的细胞凋亡数减少。上述结果提示,SNCA A30P突变减弱了成体SVZ内的神经发生,迟滞了SVZ增殖神经细胞向嗅球的迁移并迟缓了这些迁移细胞向嗅球中间神元的分化。

关键词：小鼠侧脑室下区 SNCAA30P 神经发生嗅球分化

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抗菌肽V13KL与EGFP共表达载体的构建及在COS-7细胞、小鼠胚胎中表达的初步分析

抗菌肽V13KL与EGFP共表达载体的构建及在COS-7细胞、小鼠胚胎中表...

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第五次会员代表大会暨第十六次学术研讨会

作者：关继羽张鹏宋光启刘丽梅王中伟唐博陈育新李子义吉林大学畜牧兽医学院动物胚胎工程吉林省重点实验室长春普莱医药生物技术有限公司

目的:V13KL是人工化学合成的抗菌的多肽,具有高效的杀菌性和较低的溶血性,可以作为临床上比较有前景的候选抗菌药物。本实验旨在将该抗菌肽的cDNA序列构建到真核表达载体上,通过转染COS-7细胞和原核注射的方法研究其表达活性,为最终获... 详细信息

目的:V13KL是人工化学合成的抗菌的多肽,具有高效的杀菌性和较低的溶血性,可以作为临床上比较有前景的候选抗菌药物。本实验旨在将该抗菌肽的cDNA序列构建到真核表达载体上,通过转染COS-7细胞和原核注射的方法研究其表达活性,为最终获得抗抗特定病原菌的转基因动物奠定基础。方法:本课题的合作单位长春普莱医药生物技术有限公司提供抗菌肽V13KL的专利氨基酸序列,并将其反转为cDNA序列形式,通过SOE PCR的方法合成该V13KL的cDNA,将其连入pMD18-T载体进行测序;将此序列及pIRES2-EGFP用限制性内切酶Xhol和EcoRl进行双酶切后连接、转化、提取融合质粒、测序;将所获得的融合质粒以FuGENE HD转染COS-7细胞,转染条件:脂质体FuGENE HD与质粒pIRES2-EGFP-V13KL的比例(ul FuGENE HD:ug DNA)为6:2,COS-7细胞的汇合度为90%时转染细胞,转染复合物(不含血清)为100ul,转染时间为6-8小时,转染后换成10%FBS、1%双抗的DMEM培养液,转染后24-48小时用荧光显微镜观察绿色荧光表达情况;将所获得的融合质粒线性化后以原核注射的方法注入小鼠受精卵以检测其对胚胎发育影响。结果与结论:通过SOE PCR获得的V13KL的cDNA序列经测序与原设计序列相符;经PCR、双酶切鉴定表明V13KL的cDNA已经成功连入pIRES2-EGFP表达载体中;经转染试剂FuGENE HD做瞬时转染,转染后48小时荧光镜检测80%的细胞表达绿色荧光,表明目的抗菌肽V13KL与EGFP在IRES序列元件的介导下得到了高效共表达;将线性化的融合载体对小鼠的50枚受精卵进行原核注射最终获得带有绿色荧光的囊胚6枚,且胚胎状态良好,未见异常,表明V13KL不影响囊胚前期的胚胎的正常发育。本实验将抗菌肽V13KL在COS-7细胞中的高效表达及在小鼠囊胚前期的表达分别为后续真核系统表达手段获得V13KL多肽及对其进行转基因动物抗菌功能的验证提供了重要的实验依据。

关键词： V13KL pIRES2-EGFP COS-7 共表达原核注射

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我国口蹄疫流行血清型RT-PCR的鉴别诊断技术

我国口蹄疫流行血清型RT-PCR的鉴别诊断技术

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：程凯慧王洪梅何洪彬山东省农业科学院奶牛研究中心

引言/目的口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等家畜和象、牦牛、梅花鹿等野生偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病,给我国畜牧业造成巨大的经济损失,严重危害畜牧业的发展。因此对口蹄疫的快速、准确诊断是控制... 详细信息

引言/目的口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等家畜和象、牦牛、梅花鹿等野生偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病,给我国畜牧业造成巨大的经济损失,严重危害畜牧业的发展。因此对口蹄疫的快速、准确诊断是控制疫情蔓延扩散的必要前提,也是制定畜牧免疫计划的基础。本研究建立我国口蹄疫流行株不同血清型RT-PCR的鉴别诊断技术,为口蹄疫的防控提供有力的技术支持。材料与方法参考GenBank中的A型、O型、Asia1型FMDV的全基因组核酸序列,进行比对,确定保守区和变异区。采用Primer 5.0设计A型、O型、Asia1型FMDV的通用引物及分型引物,优化FMDV通用、分型RT-PCR的反应体系及反应条件,结合DNA测序技术对引物的特异性和广谱性进行分析。结果与讨论FMDV通用引物均能特异性扩增A型、O型、Asia1型FMDV,扩增目的目的片段与预期大小一致为457bp。分型引物仅能扩增相应A型、O型、Asia1型FMDV,扩增的目的片段分别为320bp、240bp、460bp。通过对扩增片段进行测序分析及Blast比对,分型引物扩增到的序列与相应的血清型FMDV相符,相似性达84～99%。本研究所建立的FMDV鉴别诊断方法,在FMDV通用型检测具有广谱性,在分型检测具有特异性,可有效检出我国2013年大流行的A型FMDV;能快速判断临床样品是否感染FMDV,并能进行血清型分型,可应用于FMDV急性及亚临床感染的诊断及流行病学调查。结论建立了我国口蹄疫流行血清型RT-PCR的鉴别诊断技术,为口蹄疫病毒临床样品的检测、流行病学的调查奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒临床样品鉴别诊断 RT-PCR

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牛卵母细胞胞质注射条件的研究

牛卵母细胞胞质注射条件的研究

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第五次会员代表大会暨第十六次学术研讨会

作者：王中伟张鹏张胜唐博李子义吉林大学畜牧兽医学院动物胚胎工程吉林省重点实验室

卵母细胞胞质注射是研究卵母细胞基因功能(通过注射双链RNA干扰特定基因)、单精子注射(ICSI)和体细胞核移植等实验的重要工具。实验采用piezo法注射GV期及MⅡ期牛卵母细胞,比较了不同处理方法对卵母细胞胞质注射成活率和发育率的影响。P... 详细信息

卵母细胞胞质注射是研究卵母细胞基因功能(通过注射双链RNA干扰特定基因)、单精子注射(ICSI)和体细胞核移植等实验的重要工具。实验采用piezo法注射GV期及MⅡ期牛卵母细胞,比较了不同处理方法对卵母细胞胞质注射成活率和发育率的影响。Piezo注射系统利用压电脉冲的作用产生振动,使管内的水银快速吸入,产生吸力从而穿透细胞膜。这种方法对卵母细胞伤害小,操作快。注射物为荧光标记(FAM)阴性对照双链RNA(上海吉玛公司化学合成)对卵母细胞发育没有影响,并且注射成功的卵母细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,便于检测。实验用两种药物处理卵母细胞,3-isobutyl-1-methylxanthin(IBMX)和细胞松弛素B(CB),IBMX能抑制卵母细胞减数分裂,并且使卵母细胞皱缩产生卵周隙;CB是细胞骨架抑制剂,能减少显微操作过程对卵母细胞造成的机械损伤。实验为了比较IBMX对piezo胞质注射后GV期卵母细胞成活率的影响,将GV期卵母细胞置于含20 ug/ml IBMX的操作液中处理2h,结果显示卵母细胞卵周隙明显增大,IBMX处理组piezo注射后卵母细胞成活率为72.13±3.97%,显著高于未处理组62.11±4.12%(P<0.05);卵母细胞经piezo注射后进行体外成熟培养,成熟率分别为90.27±7.29%和92.47±4.74%,两者差异不显著(P>0.05)。MⅡ期卵母细胞分别使用5μg/ml、10μg/ml和15μg/mlCB处理30min后进行Piezo注射,卵母细胞的成活率分别为85.97±1.00%、85.70±1.60%、83.26±4.94%,而对照组的(不用CB处理)成活率为72.13±3.97%,显著低于添加CB各组(P<0.05)。但是不同CB浓度处理组卵母细胞成活率差异不显著(P>0.05)。MⅡ期卵母细胞注射后经孤雌激活,各组囊胚率(囊胚数/卵母细胞数)分别为12.39±0.5%(对照组)、12.06±1.23%、13.68±1.10%、10.35±2.35%,15μg/mlCB处理组囊胚率显著低于其他3组(P<0.05)。结论:piezo法注射是方便有效的牛卵母细胞胞质注射方法,GV期卵母细胞注射时用IBMX处理能显著提高注射后卵母细胞成活率,注射时操作液中添加5-10μg/mlCB,卵母细胞成活率显著高于不添加CB组。

关键词：卵母细胞 piezo 胞质注射卵周隙牛

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副鸡禽杆菌血凝素蛋白单克隆抗体的制备及夹心ELISA诊断方法的初步建立

副鸡禽杆菌血凝素蛋白单克隆抗体的制备及夹心ELISA诊断方法的初...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李淑芳徐玉智张培君龚玉梅王宏俊北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室沈阳农业大学生物科学与技术学院

副鸡禽杆菌是鸡传染性鼻炎(IC)的病原菌,该细菌培养条件苛刻、分离及生化鉴定较困难,发病鸡临床症状不典型且病程缓慢,这都加大了临床诊断和实验室检测的难度。本实验的目的在于研制出该菌的种特异性单抗,并在此基础上建立起特异性较强... 详细信息

副鸡禽杆菌是鸡传染性鼻炎(IC)的病原菌,该细菌培养条件苛刻、分离及生化鉴定较困难,发病鸡临床症状不典型且病程缓慢,这都加大了临床诊断和实验室检测的难度。本实验的目的在于研制出该菌的种特异性单抗,并在此基础上建立起特异性较强、敏感性较好的检测方法。本实验以副鸡禽杆菌C型标准菌株Modesto菌株的血凝素蛋白HA为抗原,四次免疫8周龄的BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag-14进行融合。通过间接ELISA和Western进行筛选,将获得的阳性细胞进行亚克隆,筛选稳定分泌单克隆抗体的细胞株。经5次亚克隆后共获得11株针对副鸡禽杆菌血凝素蛋白HA的特异性单抗,分别命名为3D3、1D6、5C9、4C3、4G1、6G2、5D2、1E8、3F5、4F5、4G2,以上单抗腹水的间接ELISA效价在105～3×106之间,直接平板凝集在23～25。免疫球蛋白亚类试剂盒鉴定结果表明:3D3、1D6、4C3、4G1、5D2、4F5、4G2属于IgG1亚型,5C9、6G2、1E8属于IgG2b亚型,而3F5属于IgG2a亚型。特异性实验结果表明:11株单抗只与副鸡禽杆菌反应,而不与巴氏杆菌、禽嗜血杆菌、放线杆菌发生交叉反应,显示出比较好的种特异性,本研究在研制出副鸡禽杆菌HA蛋白的特异性单克隆抗体的基础上建立了能检测副鸡禽杆菌的夹心ELISA方法,并应用此方法对几种临床中常见病原菌和已获得的副鸡禽杆菌进行了检测,结果证实,本方法具有较好的特异性和敏感性,而且操作简便、快速,是一种使用于鸡传染性鼻炎的诊断、流行病学调查、检疫和监测的有效方法。这些都为有效控制该病的暴发提供了必要的生物材料和方法。

关键词：副鸡禽杆菌特异性 ELISA 鸡传染性鼻炎单克隆抗体

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从疑似山羊传染性胸膜肺炎病羊肺组织中分离到1株无胆甾原体

从疑似山羊传染性胸膜肺炎病羊肺组织中分离到1株无胆甾原体

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：江锦秀林裕胜江斌林甦胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所

为了明确福建省某羊场发生的疑似山羊传染性胸膜肺炎病例的病原,本研究利用支原体培养基对肺组织的病原进行分离培养和纯化,通过生化试验和特异性PCR方法进行鉴定。研究结果显示:病羊肺组织在液体培养基上传代后,培养1～2 d后,培养基颜... 详细信息

为了明确福建省某羊场发生的疑似山羊传染性胸膜肺炎病例的病原,本研究利用支原体培养基对肺组织的病原进行分离培养和纯化,通过生化试验和特异性PCR方法进行鉴定。研究结果显示:病羊肺组织在液体培养基上传代后,培养1～2 d后,培养基颜色变黄且不浑浊,经液体-固体培养基3轮克隆纯化后,在体视显微镜下,可见菌落为圆形,突起,无中心脐。该分离菌用吉姆萨染色,在显微镜（用油境）观察,可见分离菌呈淡紫色,具有高度多形性,以小球状和杆状为主。分离菌株使含10%葡萄糖的培养基颜色从红色变为黄色,而不接菌的对照管培养基不变色,即分离菌株能发酵葡萄糖;分离菌株不能使含10%精氨酸的液体培养基（不含葡萄糖）变色,而且对照管也不变色,即分离菌株不能水解精氨酸;分离菌株不能使含10%尿素的液体培养基（不含葡萄糖）变色,而且对照管也不变色,即分离菌株不分解尿素;分离菌株不能使含0.2g.L氯化三苯基四氮唑的液体培养基（不含酚红和葡萄糖）变色,而且对照管也不变色,即氯化四氮唑还原反应阴性;分离菌株在无血清的液体培养基中传3代,培养基颜色变黄,无血清对照管不变色,即胆固醇需要试验阴性。用支原体目16S rRNA通用引物扩增获得目的条带560bp,与预期片段大小相符。用莱氏无胆甾原体特异性引物扩增也获得目的条带505bp,与预期片段大小相符。用丝状支原体簇丝状支原体簇特异性引物、绵羊肺炎支原体特异性引物、无乳支原体特异性引物以及精氨酸支原体特异性引物均未扩增出任何条带。分离菌株的16S rRNA基因部分序列与莱氏无胆甾原体标准株序列的同源性为99.6%。以上鉴定结果表明本次分离到支原体为莱氏无胆甾原体,此为福建省首次报道。关于该莱氏无胆甾原体的致病性等特性,本实验室正在进一步研究。

关键词：山羊传染性胸膜肺炎福建省分离菌液体培养基支原体

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