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犬钩端螺旋体病PCR和荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

犬钩端螺旋体病PCR和荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：龚悦王斐王巍张文龙曹永国丁壮吉林大学动物医学学院

钩端螺旋体病(简称钩体病),是因感染具有致病性的钩体所引起的一种人兽共患病。犬钩端螺旋体病,是由常见对犬致病的犬型、黄疸出血型、塔拉索夫型等钩体所引起。犬对该病具有易感性,犬感染本病后,临床表现多样,不易进行诊断,因此需要实... 详细信息

钩端螺旋体病(简称钩体病),是因感染具有致病性的钩体所引起的一种人兽共患病。犬钩端螺旋体病,是由常见对犬致病的犬型、黄疸出血型、塔拉索夫型等钩体所引起。犬对该病具有易感性,犬感染本病后,临床表现多样,不易进行诊断,因此需要实验室检测对本病进行辅助的鉴别诊断。常见实验室诊断方法有直接镜检,分离培养,血清学检测,动物接种等,但这些方法或不具备时效性,或缺乏准确性。相较于这些方法,聚合酶链反应(PCR)方法更省时省力,特异性和敏感性优异,并且可用于钩体病的早期诊断。本实验依据仅致病性钩端螺旋体含有的LigB基因序列的保守片段,并对常见对犬致病的钩体株的相关序列进行比对,设计了数对特异性的引物和探针,目的片段大小为124bp。对探针和引物进行筛选及反应条件与体系的优化,构建了含目的基因的质粒作为标准阳性对照,并对质粒进行测序验证。建立了犬钩端螺旋体病PCR和荧光定量PCR诊断方法,并组装成可实现对犬钩体病进行快速高效诊断的试剂盒。对试剂盒的灵敏度、特异性、重复性等参数进行了检验,确定其保存条件和保存期,采集并检测临床犬血液和尿液样本,与显微凝集试验相比较,结果一致。钩端螺旋体的培养需要数周的时间,培养基的配制程序复杂,而诊断钩体病的金标准方法MAT,需要活体钩体才能进行诊断,因而很难得到推广和应用,而PCR方法不需要进行钩体的培养,并且相比于血清学方法,还可用于钩体病的早期诊断。在该实验中,建立的普通PCR方法检测钩体浓度的灵敏度可达到10～1,荧光定量PCR方法的灵敏度可达10～0。近年来,宠物犬的数量不断增加,各类工作犬的数量也有上升。犬易感钩体病,影响犬自身及其主人的健康,该检测方法可推广应用于犬钩体病的早期检测,避免该病的进一步发展和扩散。

关键词：犬钩端螺旋体病钩端螺旋体 PCR 钩体病

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稳定表达兔出血症病毒VPg蛋白RK-13细胞系的构建

稳定表达兔出血症病毒VPg蛋白RK-13细胞系的构建

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：朱杰谭永贵郭慧敏缪秋红孟春春李传峰陈宗艳刘光清中国农业科学院上海兽医研究所

兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)为单股正链RNA病毒,属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。该病毒可使兔发生急性、败血性传染病,发病率达100%,病死率可达90%以上,是兔的一种毁灭性传染病,俗... 详细信息

兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)为单股正链RNA病毒,属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。该病毒可使兔发生急性、败血性传染病,发病率达100%,病死率可达90%以上,是兔的一种毁灭性传染病,俗称"兔瘟"。1984年,该病第一次在中国江苏大规模爆发,病兔呈现肝脏坏死,实质脏器水肿、呼吸系统弥漫性出血等典型病变。随后,该病迅速传播扩散至全球,给世界各国兔养殖业造成了严重的损失。目前,虽然关于RHDV的研究取得了一些进展,但是由于缺少稳定的细胞增殖模型,关于RHDV的复制、翻译的分子机制以及感染和致病机理的研究还没有取得突破性进展。为了构建稳定表达兔出血症病毒VPg蛋白的一种RK-13细胞系,本研究利用慢病毒包装系统,将VPg基因编码序列插入至慢病毒载体pLOV-GFP-3Flag中,构建了pLOV-3Flag-VPg重组质粒。然后将该质粒pLOV-3Flag-VPg与包装质粒psPAX2和外膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,转染48h后收集含重组慢病毒样颗粒的细胞培养上清液。用含慢病毒颗粒的细胞培养上清液感染RK-13细胞,感染24 h后用含嘌呤霉素(2μg/ml)培养基进行抗性筛选、纯化,获得稳定表达VPg的细胞系,并命名为RK-VPg细胞系。连续培养10代后,利用PCR检测发现VPg基因成功插入至细胞基因组中;同时,RT-PCR检测发现整合至细胞基因组中的VPg基因能够转录为mRNA;此外,利用Western blot和IFA方法检测VPg基因在RK-VPg细胞中的表达水平,其中IFA实验结果显示RK-VPg细胞系90%以上发荧光,同时Western blot显示第10代、第15代、第20代RK-VPg细胞VPg蛋白都得到了大量表达。从而上述结果表明,RK-VPg细胞系能够稳定高效的表达VPg蛋白。因此,本研究成功构建了稳定表达兔出血症病毒VPg蛋白的RK-VPg细胞系。我们根据此前的研究,推测VPg在RHDV复制和翻译过程中也扮演着重要的角色。本研究获得的稳定表达VPg蛋白的RK-VPg细胞系为了研究天然状态下该病毒中VPg的功能,提供了良好的平台。

关键词： RHDV VPg RK-13细胞稳定表达

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血清5型、13型副猪嗜血杆菌二价灭活苗研究

血清5型、13型副猪嗜血杆菌二价灭活苗研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：范小兵代军周鹏黄毅谭晓婷文心田文翼平曹三杰黄小波伍锐四川农业大学人兽共患病与猪病防治研究中心

引言副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病,由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）所引起猪的浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的内源性继发感染性疾病。近些年,随着全球养猪业的发展,该病在猪病的发生中起着越来越重要的作用,给养殖户带来... 详细信息

引言副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病,由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）所引起猪的浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的内源性继发感染性疾病。近些年,随着全球养猪业的发展,该病在猪病的发生中起着越来越重要的作用,给养殖户带来巨大的经济损失。本课题对近两年从四川地区所分离的HPS菌株,进行了HPS疫苗用菌株的筛选、疫苗用菌株的生长特性和HPS二价灭活苗的研究,为四川地区副猪嗜血杆菌病的基础研究、预防和控制奠定基础。材料与方法选择四川HPS流行优势血清型5型、13型分离株,作为HPS疫苗用筛选菌株。然后通过测定毒力与免疫原性,从中分别选出MC-203株（血清5型）和XJ-103株（血清13型）。将两菌株划线接种于TSA上并连续传代三次后,挑取单菌落于TSB中,置于37℃,220r/min的空气摇床中培养12h左右,收集菌液。将收集的两种菌液用0.2%的甲醛灭活20h,分别用PBS洗涤并浓缩为1.0×10个/ml,将两菌株和佐剂（铝胶）按1:1:2的比例混合均匀,即成血清5型、13型HPS二价灭活苗。用已制备的HPS二价灭活苗分别免疫14日龄哺乳仔猪和30-35日龄断奶仔猪5头,每头猪注射2ml,同时设立未免对照组。通过观察其接种后的精神状态、呼吸和食欲等,评价所制的二价灭活苗的安全性。结果与讨论根据临床生产实践,用HPS灭活来预防和控制副猪嗜血杆菌病,主要是免疫接种30-35日龄断奶仔猪,其次是接种14日左右的哺乳仔猪,因此需要检验其接种14日龄左右的仔猪和30-35日龄的仔猪的安全性。用所制备并保存的血清5型、13型HPS二价灭活苗,分别免疫14日龄的哺乳仔猪和30-35日龄的断奶仔猪,观察接种后猪只的精神状态、接种部位的变化、呼吸和食欲等临床指标。在细菌灭活苗的生产实践中,菌种中细菌含量的高低与免疫效果呈正相关,细菌含量高可诱发较好的免疫效果,同时也可能会产生副作用。本研究的检测结果表明所制备的HPS二价灭活苗免疫后不会引起猪的不适,是安全可用的。

关键词：灭活苗 HPS 副猪嗜血杆菌副猪嗜血杆菌病

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传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP3蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP3蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王彬李淑芹王永强李晓齐曹红郑世军中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室

引言传染性法氏囊病（IBD）是一种危害3-8周龄雏鸡的烈性、高度接触性传染病,主要侵害法氏囊等淋巴器官。耐过鸡由于免疫器官的损伤,体液免疫和细胞免疫功能下降,引起免疫抑制,造成对其它疾病易感和免疫失败。目前治疗传染性法氏囊病最... 详细信息

引言传染性法氏囊病（IBD）是一种危害3-8周龄雏鸡的烈性、高度接触性传染病,主要侵害法氏囊等淋巴器官。耐过鸡由于免疫器官的损伤,体液免疫和细胞免疫功能下降,引起免疫抑制,造成对其它疾病易感和免疫失败。目前治疗传染性法氏囊病最有效的方法之一是在鸡群发病初期注射卵黄抗体,减少损失,因此疾病的早期诊断十分重要。尽管在IBDV致病机理研究方面取得了一定的进展,但仍然有很多科学问题没有解决。本研究成功制备了IBDV VP3蛋白的单克隆抗体,为IBDV抗原检测以及致病机理的研究奠定了基础。材料与方法实验用的免疫蛋白VP3-His、筛选蛋白VP3-GST、菌种与毒株均由本实验室制备和保存。参照文献Current Protocol in Immunology进行小鼠免疫、细胞融合、阳性杂交瘤细胞的亚克隆与筛选。利用间接ELISA、Western Blot和间接免疫荧光实验（IFA）等方法对单抗的特性及抗原识别区进行分析。结果与讨论免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后,经过3次亚克隆,获得1株稳定分泌针对VP3蛋白的单抗杂交瘤细胞株,命名为4H8F7C10。经间接ELISA测定,小鼠腹水效价为2.05×10～6,亲和力解离常数（kD）为9.67×10,这株单抗的亚型为IgG3。Western Blot检测结果表明,抗VP3单抗识别IBDV VP3蛋白,但不识别ALV、REV、ARV感染DF-1细胞以及CIAV感染MSB1细胞收取的细胞总蛋白,说明该单抗具有良好的特异性。间接免疫荧光实验检测结果表明,该株单抗可以特异性识别IBDV感染的DF-1细胞。初步确定此株单抗的抗原识别区位于VP3蛋白N端的50-90位氨基酸。结论 1.本实验成功获得1株稳定分泌针对VP3蛋白的单抗杂交瘤细胞株。2.此株单抗的亚型为IgG3,初步确定此株单抗的抗原识别区位于VP3蛋白N端的50-90位氨基酸。

关键词：传染性法氏囊病病毒 IBDV)VP3 制备与鉴定单克隆抗体

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猪肺炎支原体脂膜蛋白LAMPs通过caspase3和MAPK途径诱导猪肺泡上皮细胞SJPL凋亡

猪肺炎支原体脂膜蛋白LAMPs通过caspase3和MAPK途径诱导猪肺泡上...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：倪博白方方韦艳娜刘茂军冯志新熊祺琰华利忠邵国青江苏省农业科学院兽医研究所

目的使用猪肺炎支原体脂膜蛋白LAMPs作用于猪肺泡上皮细胞(SJPL),检测LAMPs是否为猪肺炎支原体的致病因素。材料与方法使用KM2培养基培养猪肺炎支原体232株(ATCC 27714)。通过TBSE和Triton-114提取猪肺炎支原体的脂膜蛋白LAMPs用于研究... 详细信息

目的使用猪肺炎支原体脂膜蛋白LAMPs作用于猪肺泡上皮细胞(SJPL),检测LAMPs是否为猪肺炎支原体的致病因素。材料与方法使用KM2培养基培养猪肺炎支原体232株(ATCC 27714)。通过TBSE和Triton-114提取猪肺炎支原体的脂膜蛋白LAMPs用于研究。实验用细胞为猪气管上皮细胞SJPL,DMEM培养后接种96孔细胞板待用。研究中先使用MTT法检测不同浓度LAMPs对细胞的生长抑制作用,随后使用DAPI,AO/EB双染及末端羟基标记TUNEL法检测细胞凋亡的形态学变化。通过流式细胞仪检测LAMPs诱导细胞的凋亡率。通过caspase3,caspase8酶活性检测以及Western Blot法检测凋亡通路相关信号蛋白PARP,Bax和p38 MAPK。同时检测了炎性因子NO及超氧化物的浓度。结果与讨论经过MTT法检测IAMPs对细胞的毒性作用,选定0.2mg/mL为研究作用浓度。在LAMPs与SJPL细胞相互作用24h后出现了典型的细胞凋亡现象。细胞核出现核固缩,碎裂,皱缩为不规格的形状,并出现凋亡小体,同时由于基因组断裂而暴露的3'-OH被TUNEL标记为绿色荧光。在AO/EB双染中出现橙黄色凋亡细胞。使用流式细胞仪检测LAMPs作用于细胞24后出现36.5%±11.6%的凋亡率。在LAMPs作用于SJPL细胞6h时,caspase 3的酶活性与阴性细胞相比升高了40倍,caspase 8的酶活性提升了4倍。在凋亡通路的检测中,PARP被切割为两个较小的片段被活化,p38 MAPK被磷酸化,促凋亡蛋白Bax表达增加的同时,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调,Cyt c从线粒体释放到细胞质中被激活。此外,LAMPs还可以刺激细胞产生NO和超氧化物。结论猪肺炎支原体的脂膜蛋白LAMPs具有诱导猪肺泡上皮细胞SJPL凋亡的能力,其中激活了caspas3,caspase8,PARR,p38 MAPK,Bax及细胞色素Cytc。这项研究可以帮助我们进一步认识猪肺炎支原体的治病机制,对LAMPs诱导细胞凋亡途径更深入的研究将有助于确立猪肺炎支原体感染的治疗靶标。

关键词：猪肺炎猪肺炎支原体 caspase3 LAMPs

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鼠伤寒沙门菌SL1344株△crp△sipB缺失株生物学特性的检测

鼠伤寒沙门菌SL1344株△crp△sipB缺失株生物学特性的检测

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：陈松彪张春杰程相朝余祖华何雷郁川廖成水河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室

引言鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一群最常见的引起食物和水源性污染病原菌,具有广泛的宿主,能够引起哺乳动物和人类发生系统性感染,具有重要的公共卫生意义。材料与方法在前期对鼠伤寒沙门菌SL1344株crp/sipB双缺失株研究... 详细信息

引言鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一群最常见的引起食物和水源性污染病原菌,具有广泛的宿主,能够引起哺乳动物和人类发生系统性感染,具有重要的公共卫生意义。材料与方法在前期对鼠伤寒沙门菌SL1344株crp/sipB双缺失株研究发现对小鼠的毒力较亲本菌株约下降10～3倍,并且免疫机体后对野毒的攻击具有较好的免疫保护效力,有潜力作为鼠伤寒菌弱毒疫苗的候选菌株,所笔者在此对双缺失株的生物学特性从其运动性、生物被膜的形成能力、以及糖酵解的影响等方面进一步进行研究,以期研究出减毒背景清楚的沙门菌疫苗候选菌株。结果和讨论SL1344△crp△sipB双缺失株的运动性结果显示双缺失株较亲本菌株相比失去了运动性的能力,这可能是由于双基因缺失后影响调控细菌鞭毛相关基因的表达,是否是由此引起的需要进一步的验证,而此也是影响其毒力发生降低的一个途径;生物被膜的主要成分测定试验结果也发现基因缺失后影响菌毛和纤维素的表达,所以缺失菌株在刚果红平板上呈现白色光滑的菌落形态,从而有可能影响其生物被膜的形成,从而影响其毒力,这与Javier等报道爱德华氏菌J100株crp基因缺失株结果相一致。丙酮酸和乳酸的含量测定结果表明缺失株的乳酸和丙酮酸含量较亲本菌株相比上升,说明缺失株的糖酵解途径增强,即更多的进行无氧呼吸,我们推测缺失株的糖酵解途径增强会导致能量生威减少,而肿瘤细胞的一个很重要的特点即其糖酵解效率特强,能否使用缺失株的这一特性去抑制肿瘤细胞的糖酵解效率,从而达到治疗或者缓解肿瘤的目的,这个问题值得探讨。缺失株对上皮细胞的细胞增殖和毒性结果也同样表明该基因缺失株对上皮细胞的毒性作用同样发生了下降。上皮细胞的黏附和侵入试验表明缺失株的黏附和侵入能力较亲本菌株相比发生了显著的降低,笔者猜测可能是由于缺失株调控鞭毛形成的相关基因表达受到抑制。

关键词：缺失株上皮细胞 crp SL1344 生物学特性鼠伤寒沙门菌

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巴马猪人工感染猪鼻支原体和猪滑液支原体后鼻腔粘膜中特异性sIgA抗体分泌规律研究

巴马猪人工感染猪鼻支原体和猪滑液支原体后鼻腔粘膜中特异性sIgA...

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：白昀冯志新熊祺琰宋伟祥韦艳娜马庆红甘源邵国青江苏省农业科学院兽医研究所

目的巴马猪在分别人工感染猪鼻支原体和猪滑液支原体后,研究其鼻腔粘膜中特异性sIgA抗体分泌规律。材料与方法取猪鼻支原体(11051207株,10～9CCU/ml)和猪滑液支原体(ATCC27059株,10～8CCU/ml)培养物分别通过鼻内感染4～6周龄巴马猪,3ml/... 详细信息

目的巴马猪在分别人工感染猪鼻支原体和猪滑液支原体后,研究其鼻腔粘膜中特异性sIgA抗体分泌规律。材料与方法取猪鼻支原体(11051207株,10～9CCU/ml)和猪滑液支原体(ATCC27059株,10～8CCU/ml)培养物分别通过鼻内感染4～6周龄巴马猪,3ml/头,24h后用相同菌株相同剂量再次鼻内感染试验猪。感染前和首次感染后D2、D4、D7、D10、D14、D21、D28、D35日采集鼻拭子,分别检测猪鼻支原体和猪滑液支原体特异性的sIgA抗体,研究其鼻腔粘膜中特异性sIgA抗体的分泌规律。结果与讨论巴马猪在感染猪鼻支原体(11051207株)后D7天鼻腔粘膜sIgA抗体开始转阳(1/3),D10天sIgA抗体水平达到最高峰并全部转阳(3/3),之后抗体水平缓慢下降,至D35天已有部分(2/3)试验猪鼻腔粘膜sIgA抗体为阴性。巴马猪在感染猪滑液支原体(ATCC27059株)后D7天鼻腔粘膜sIgA抗体开始转阳(1/3),之后逐渐升高,至D21天sIgA抗体水平达到最高峰,并一直维持到D35天仍未见有明显下降趋势。结论通过鼻内感染猪鼻支原体和猪滑液支原体的方法均能成功的诱导鼻腔粘膜产生相应的特异性sIgA抗体。猪滑液支原体接种剂量显著低于猪鼻支原体,但可比猪鼻支原体感染后产生更快更持久的特异性sIgA抗体,这一方面可能是由于菌株毒力的差异,另一方面也可能是由于猪滑液支原体抗原反应性更强的结果。虽然在两菌株在感染后均可激活猪呼吸道的免疫反应,但在整个试验的过程中均未观察到各自明显的临床症状,这提示我们在研究猪肺炎支原体时要注意猪鼻支原体和猪滑液支原体对其产生的交叉影响,尤其是在临床检测猪肺炎支原体时,亦需做到与猪鼻支原体和猪滑液支原体的鉴别诊断。

关键词：猪鼻支原体滑液支原体抗体分泌人工感染鼻腔粘膜特异性巴马猪

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应用实时荧光定量PCR技术快速定量检测鸡毒支原体

应用实时荧光定量PCR技术快速定量检测鸡毒支原体

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：孙俊颖刘志成孙敏华董嘉文李林林张建峰广东省农业科学院动物卫生研究所

引言鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）感染引起的禽慢性呼吸道病（Chronic Respiratory Disease,CRD）,广泛分布世界所有养禽国家,在我国部分地区感染率高达75%以上,严重阻碍养禽业的健康发展。控制MG感染的最根本有效方法就... 详细信息

引言鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）感染引起的禽慢性呼吸道病（Chronic Respiratory Disease,CRD）,广泛分布世界所有养禽国家,在我国部分地区感染率高达75%以上,严重阻碍养禽业的健康发展。控制MG感染的最根本有效方法就是对感染鸡群进行净化,从根本上切断MG的传播和流行。但由于经济原因,大多数鸡场仍采用疫苗防控。因此建立一种敏感性高、特异性强、快速有效的检测方法对鸡群的早期诊断和净化,以及对疫苗质量的监控和分子流行病学调查具有重要意义。材料与方法通过比对GenBank中的鸡毒支原体16S rDNA基因序列,在保守区域设计了1对引物,扩增186 bp目的片段,然后将扩增产物与pMD-18T载体连接,构建重组阳性质粒,以此为模板建立检测鸡毒支原体的SYBRG Gree n I real-time PCR方法,并进行灵敏性、特异性、重复性及临床样品和疫苗检测试验。结果与讨论结果显示,该方法在1.96×10s copies/μL.96×10～2 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数0.999;最低检测限为1.96×10～1copies/μL;与禽类其它呼吸道病原无交叉反应;批内及批间变异系数均低于2%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。用该方法抽检30份疑似病例的肺脏组织,结果检出12份阳性,同时用普通PCR和血清平板凝集试验对这些病料进行检测,结果分别检出10份和7份阳性。检测结果说明该方法敏感性明显高于普通PCR和血清平板凝集试验方法。采用建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法对两种弱毒疫苗的病毒含量进行了测定,结果测得MG的含量为1.6×10～5copies/μL、1.0×10～5copies/μL,为弱毒疫苗的质量监控提供了一种新的快速检测方法。结论本研究建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法特异性强、重复性好,定量限为1.96×10～2copies/μL,检测限为1.96×10～1copies/μL,灵敏度比RT-PCR高100倍,还可避免常规PCR电泳检测所带来的高污染率,并且可精确定量,可应用于MG感染引起的慢性呼吸道病的早期检测及疫苗监测等方面的定量研究。

关键词：鸡毒支原体平板凝集试验 PCR 慢性呼吸道病弱毒疫苗快速定量检测实时荧光定量

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鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB△asd双缺失株的构建及特性的研究

鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB△asd双缺失株的构建及特性的研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：陈松彪张春杰程相朝余祖华何雷郁川廖成水河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室

引言鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)属于肠道致病菌,是一种重要的食物源性病原体,其具有广泛感染的宿主谱,在公共卫生方面具有重要的意义。材料与方法本研究以减毒鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB为研究对象,利用自杀性质粒pRE△asd介... 详细信息

引言鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)属于肠道致病菌,是一种重要的食物源性病原体,其具有广泛感染的宿主谱,在公共卫生方面具有重要的意义。材料与方法本研究以减毒鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB为研究对象,利用自杀性质粒pRE△asd介导的细菌同源重组技术,构建SL1344△sipB△asd宿主-载体平衡致死系统,并进一步研究其生物学特性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。结果和讨论asd基因主要编码编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶,该酶是二氨基庚二酸(diaminopimelic acid,DAP)生物合成途径中的必需酶,而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要成分。asd缺失株在无外源DAP条件下溶菌死亡。因此,利用asd基因互补系统能够与asd缺失株表型互补,使重组菌在无外源DAP的情况下仍能够存活,可以保证减毒沙门氏菌携带外源抗原能够持续稳定表达。本研究以鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB株为研究对象,采用接合转移的方法将含有缺失315bp的asd基因的重组自杀性质粒导入鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB中,通过同源重组、抗性筛选标记和PCR检测技术,最终筛选出不含任何抗性的鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB△asd基因缺失突变株。并对它们的生物学特性进行了比较,缺失菌株和与亲本菌株相比没有发生太明显的变化。生长速度及生化特性与sipB单缺失株基本保持一致,细菌流动性检测结果表明缺失株仍然具有运动性的能力,说明该基因缺失后不会影响细菌鞭毛相关蛋白的表达。经小鼠毒力测试,SL1344△sipB△asd(pYA3493)双缺失株毒力较亲本株SL1344明显下降约700倍,与SL1344△sipB单缺失株毒力相当,说明△asd作为营养缺陷型基因,由于与含有asd基因的无抗性质粒互补,可能不影响其毒力,因此其作为疫苗载体具有良好的安全性,并且其构成的宿主载体平衡致死系统,可用于外源基因的稳定表达,为将鼠伤寒沙门菌开发为一种安全高效的口服多价疫苗活载体奠定了基础。

关键词：缺失株 SL1344 asd 平衡致死系统鼠伤寒沙门菌

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石墨烯负载金纳米粒子构建电化学免疫传感器检测H7亚型禽流感病毒的研究

石墨烯负载金纳米粒子构建电化学免疫传感器检测H7亚型禽流感病毒...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：黄娇玲谢芝勋罗思思刘加波谢丽基谢志勤庞耀珊邓显文范晴广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室

引言 H7亚型禽流感病毒（AIV H7）不仅严重的影响养禽业的发展,而且危害人类的健康。为了有效地控制H7亚型禽流感病毒的传播,各国学者正致力于研发各种检测H7亚型禽流感病毒的方法。电化学免疫传感器既具备了电化学分析特有的灵敏、快... 详细信息

引言 H7亚型禽流感病毒（AIV H7）不仅严重的影响养禽业的发展,而且危害人类的健康。为了有效地控制H7亚型禽流感病毒的传播,各国学者正致力于研发各种检测H7亚型禽流感病毒的方法。电化学免疫传感器既具备了电化学分析特有的灵敏、快速、简单及潜在的仪器可微型化等优点,同时也具备免疫分析法中特异性强的特点。近年来,电化学免疫传感器在病原微生物快速检测中的应用受到各国学者的重视,目前已经成功应用于环境分析、食品工业和临床医学等。本文将石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子（G-Chi-AuNP）纳米复合物固定在金电极表面,然后用于吸附固定H7亚型禽流感病毒单克隆抗体,制备免疫传感器用于检测H7亚型禽流感病毒。材料与方法根据Hummer方法改进后制得氧化石墨烯（GO）。将GO加入到甲壳胺溶液超声2h,得到稳定的G-Chi悬浊液,加入HAuCl溶液80℃下还原,得到G-Chi-AuNP纳米复合物。将金电极打磨并清洗后。置于HSO溶液中进行循环伏安扫描,取出用去离子水清洗干净待用。取G-Chi-AuNP纳米复合物涂到金电极表面,固定H7亚型禽流感病毒单克隆抗体（MAb/H7）,再滴涂BSA溶液37℃下封闭,最后滴涂15μL待测样品37℃下反应30min,最后进行循环伏安测试（CV）。结果与讨论本研究所构建的电化学免疫传感器对目标病毒H7的检测敏感度为10EID/mL,对非目标禽病病原体,如禽流感病毒（H1、H2、H3、H4、H5、H6、H8、H9、H10、H11、H12和H13亚型AIV）、新城疫病毒（NDV）、鸡白痢沙门氏菌（SP）、喉气管炎病毒（LTV）和传染性支气管炎病毒（IBV）等检测时其特征吸收峰没有发生改变。研究建立的H7亚型禽流感病毒电化学免疫传感器,具有特异性好和灵敏度高的优点,在H7亚型禽流感病毒快速检测领域具有良好的应用前景。

关键词：禽流感病毒单克隆抗体电化学免疫传感器金纳米粒子石墨烯

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