卵泡抑素(follistatin)又名F S H抑制蛋白,是一种单链糖蛋白。最初人们认为follistatin只是作为激活素(Activin,ACT)的结合蛋白,通过Activin/Follistatin系统来调节动物的生殖活动。但近年来的实验表明,Follistat n以旁分泌或自分泌的方...
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卵泡抑素(follistatin)又名F S H抑制蛋白,是一种单链糖蛋白。最初人们认为follistatin只是作为激活素(Activin,ACT)的结合蛋白,通过Activin/Follistatin系统来调节动物的生殖活动。但近年来的实验表明,Follistat n以旁分泌或自分泌的方式,与转化生长因子—β(TGF-β,transforming growth factor-13)超家族的许多成员,如骨形态发生蛋白(BMP,bone morphognic protein)、肌肉抑素(myostatin)等结合,在生殖系统以外的器官和组织中起重要作用。而且有研究结果发现其对动物的肌肉生长具有重要的调节作用,follistatin可与肌肉生长抑素(myostatin)的C端结合,从而抑制myostatin跟受体结合,进而促进骨骼肌发育。有研究表明敲除了follistatin基因的小鼠出生时肌肉重量显著减少。本实验从东北民猪克隆了猪follistatin基因,构建了其真核表达载体,并验证了该基因在真核细胞中的表达,为利用核移植技术生产follistatin转基因猪,提高猪的瘦肉率,培育家猪新品种奠定基础。实验根据GeneBank(NCBI)中的follistatin基因编码区序列,设计并合成了一对特异性引物。提取东北民猪的卵泡总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增。获得目的基因,将目的基因亚克隆到PMD-18T载体上扩增测序。克隆的东北民猪follistatin cDNA序列全长为1035bp,与GeneBank中报道的家猪follistatin同源性高达99.4%,与奶牛、家鼠、挪威鼠和马等其他物种的基因序列间同源性也大于89%,证明已成功地克隆到follistatin基因编码区序列;通过酶切一连接一转化一筛选一鉴定—测序等步骤与pEGFP-C1重组,以follistatin基因编码区序列替换EGFP,重组后的pEGFP-Fst质粒不再含EGFP基因,从而使该载体既充分利用pEGFP-C1载体的成熟筛选与表达特性,又避免了绿色荧光蛋白的表达;在脂质体介导下将pEGFP-Fst转染体外培养的猪胎儿成纤维细胞系,经过药物筛选稳定表达后,经RT-PCR,Western-blot鉴定,证明本试验已成功在猪胎儿成纤维细胞中表达follistatin蛋白。上述结果表明:本研究成功克隆了东北民猪follistatin基因编码区序列,构建了可以在猪成纤维细胞中稳定表达的重组真核表达质粒pEGFP-Fst,该结果为进一步开展利用核移植技术生产瘦肉型转基因猪奠定了基础。
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