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广西新型蝙蝠汉坦病毒的全基因组序列分析

广西新型蝙蝠汉坦病毒的全基因组序列分析

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：徐琳吴建敏何彪夏乐乐涂长春军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病防控重点实验室广西壮族自治区兽医研究所

引言汉坦病毒(Hantaviruus,HV)属于布尼亚病毒科(Family Bunyaviridae)汉坦病毒属(Genus Hantavirus),为有包膜的单股负链RNA病毒。HV能够感染人引起两种严重疾病,肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒心肺综合征(HCPS),平均每年有60,000-150... 详细信息

引言汉坦病毒(Hantaviruus,HV)属于布尼亚病毒科(Family Bunyaviridae)汉坦病毒属(Genus Hantavirus),为有包膜的单股负链RNA病毒。HV能够感染人引起两种严重疾病,肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒心肺综合征(HCPS),平均每年有60,000-150,000例HFRS的病例,90%以上发生于亚洲,而我国占了绝大多数。啮齿动物是HV主要的自然宿主。然而近年来随着蝙蝠病毒研究的增加,越来越多的HV在蝙蝠中被检测出。但蝙蝠HV全基因组序列的空缺严重阻碍了HV跨宿主传播的研究。本研究采集广西部分地区的蝙蝠样品,对其进行了HV特异性检测,并进行HV的全基因组序列扩增及病毒粒子的电镜观察,以期为HV的研究提供基础性科学数据。材料与方法 2012年,从广西的来宾市、百色市和桂林市共采集7种蝙蝠153只,对其肠道和肺脏进行收集并按照已发表的方法进行病毒宏基因组学处理。根据高通量测序结果,提取相关阳性样品的RNA并进行HV特异性RT-PCR检测,随后设计引物进行HV的全基因组扩增,并进行系统进化分析,原始阳性样品同时进行扫描电镜观察。结果通过检测,从广西来宾市采集到的一份肺脏组织中检测到HV,命名为来宾病毒(Laibin virus,LBV),阳性率为3.1%(1/32)。电镜负染观察HV阳性的原始肺脏组织样品,发现直径约100hm的HV样病毒粒子。设计引物进行PCR扩增,成功得到其全基因组序列,包括S、M、L三个片段,长度依次为1935nt,3908nt和6531nt,其中LBV的M基因序列长于其他已知的汉坦病毒M序列。利用部分基因序列进行系统进化分析发现,与中国发现的两株蝙蝠HV(龙泉病毒和黄陂病毒)相比,LBV与越南的一株蝙蝠HV(XSV)同源性更高,达到60.8%-75.3%,与其他5株蝙蝠携带HV同源性为46.4%-71.5%,而与其他宿主携带的HV同源性仅为44.6-67.4%,确定其为一株新型HV。讨论随着越来越多的HV在蝙蝠中被发现,揭示蝙蝠作为HV另一重要自然宿主在保存和传播HV过程中具有重要的作用。根据目前的数据显示,蝙蝠源HV同其它宿主的HV在遗传进化关系上形成独特的一支,这可能是因为HV在蝙蝠群体中进行了长期的封闭性进化。目前人的汉坦病毒病,主要是由啮齿动物传播而来,但考虑到蝙蝠HV的多样性,以及人与蝙蝠接触的机会愈来愈大,同时目前所发现的蝙蝠HV潜在的致病性尚不明确,蝙蝠同样可能是人汉坦病毒病的另一个重要威胁,未来仍需加大蝙蝠HV的监测和研究力度。

关键词：全基因组序列分析啮齿动物汉坦病毒阳性样品来宾市

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小反刍兽疫病毒GZL14株的全基因组序列测定与分析

小反刍兽疫病毒GZL14株的全基因组序列测定与分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：朱利塞郭昌明邢泽黎盖小春鲁海冰王明月涂长春王新平吉林大学动物医学学院中国人民解放军军事兽医研究所

前言小反刍兽疫(peste des petits ruminants PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒属中的小反刍兽疫病毒引起的一种急性、亚急性高度接触性传染病,也是国际动物卫生组织(OIE)规定的通报行疫病和我国法定的一类疫病。该病首次在1942年报道于西非... 详细信息

前言小反刍兽疫(peste des petits ruminants PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒属中的小反刍兽疫病毒引起的一种急性、亚急性高度接触性传染病,也是国际动物卫生组织(OIE)规定的通报行疫病和我国法定的一类疫病。该病首次在1942年报道于西非的象牙海岸。本病在国内于2007年首次暴发于西藏自治区阿里地区,之后于2013年冬至2014年春在全国各地爆发流行。2014年春,本实验室从吉林省某地羊群爆发的临床上以腹泻、发热、流涎、口腔黏膜严重溃疡、呼吸困难为主要特征的疫病中分离检出小反刍兽疫病毒,并对分离的pPRV毒株的基因组序列进行了测定与分析。材料与方法用无菌的绵拭子采集发病羊的鼻腔分泌物,并用无菌的磷酸盐缓冲溶液处理,离心后取上清液,其中一部分用于电镜负染观察,一部分用于RNA的提取,并采取RT-PCR的方法对其进行鉴定,同时根据GeneBank上提交的PRRV序列设计引物,扩增全长基因组序列。结果与讨论电镜负染观察病料中存在大量的大小为130-150nm的副黏病毒粒子。应用PPRV特异性的引物,扩增出与预期目的片段大小相似的基因片段,经过序列测定与对比分析,发现扩增出片段为PPRV的特异性序列,证明该病毒粒子为PPRV,并将该毒株命名为GZL14。扩增出的N基因序列与国外PPPV分离株INDIA-1994和PRADESH-95的核苷酸同源性最高,为99.3%,而与国内分离株China/Tib/07的同源性为99%;F基因序列与国外分离株Izatnagar-94和Morocco-2008毒株的同源性最高,为98.1%,而与国内分离株Clina/Tib/07的同源性为97.2%。为了进一步验证该毒株其他基因的变异情况,我们对GZL14毒株的全基因组序列进行扩增,结果显示该毒株基因组全长为16058bp,其中5'UTR包含107个核苷酸,3'UTR包含109个核苷酸,且存在个别碱基的突变和插入。与其他PPRV毒株不同,GZL14毒株的M和F基因之间的非编码区,存在一段连续重复的序列,共103个碱基,该重复序列是否对PPRV的生物学特性及其致病性产生影响,还有待进一步研究。结论分离鉴定一株引起吉林省小反刍兽疫爆发的PPRV毒株GZL14。基因组序列测定与分析发现GZL14毒株的M和F基因之间的非编码区存在一段连续重复的序列,这与其他报道的PPRV毒株不同,该结果将为病毒的致病机理及本病的诊断和防治提供理论依据。

关键词：小反刍兽疫病毒基因组序列 GZL14 全基因组序列测定与分析

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山西省一起牛、羊狂犬病疫情分析

山西省一起牛、羊狂犬病疫情分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：于明洋丁来喜冯烨许炜迪李文婧涂忠忠陈英杰张卫忠涂长春军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室

引言 2015年4月初山西省忻州市宁武县一只家养犬咬伤同村多头牛、羊,牛被患病犬咬伤一周后,出现神经系统症状,表现为流涎,狂躁不安,惊恐乱跑,口吐白沫,磨牙目视前方,撞墙壁和有色物体,原地转圈,最后呼吸困难倒地死亡。被咬伤的羊的症状... 详细信息

引言 2015年4月初山西省忻州市宁武县一只家养犬咬伤同村多头牛、羊,牛被患病犬咬伤一周后,出现神经系统症状,表现为流涎,狂躁不安,惊恐乱跑,口吐白沫,磨牙目视前方,撞墙壁和有色物体,原地转圈,最后呼吸困难倒地死亡。被咬伤的羊的症状与牛类似。截止2015年5月底,共有10余头牛、60余只羊发病死亡。其中1只死亡牛的脑组织送狂犬病参考实验确诊。方法采用荧光抗体实验(FAT)对送检牛脑组织进行狂犬病实验室确诊,采用PCR方法扩增该毒株全长N基因,使用DNAStar 5.0对该毒株和我国流行毒株进行同源性分析,使用MEGA6.1绘制G基因系统进化树。结果检测结果表明该样品为狂犬病病毒阳性,毒株命名为SXXZC15。将该毒株N基因序列与我国近年来流行毒株比较,该毒株与2010年分离自山西省太原市阳曲县的羊源毒株SXTYS01(Genbank号:KT221128)同源性为100%;与2010年分离自山西省大同市天镇县的犬源毒株SXDTD01(Genbank号:KT221129)同源性为99.9%。系统进化分析结果表明该毒株属于亚洲1群,该群毒株主要分布在我国中部和南部各省市,目前在山西省分离的流行毒株均属于该进化群。讨论山西省地处我国华北西部,近年来当地狂犬病频发。据历史疫情报告,1956-1964年山西省共发生狂犬病137例,呈散在发生。1983-1992年10年间共发生狂犬病患者454例。山西省的主要流行区域为大同市及雁北,忻州,吕梁地区,累计发病数为305例,占总发病数的64.35%。2010年山西省太原市阳曲县发生犬引发的大规模羊狂犬病疫情,超过50只羊发病死亡。此次牛、羊狂犬病疫源地宁武县距阳曲县仅100余公里,此次宁武县狂犬病病毒流行毒株与阳曲县犬源毒株N基因序列同源性高达100%,说明这些毒株已在上述地区的犬群中形成传播圈。狂犬病不仅对当地家畜形成持续的威胁,而且已经给当地的畜牧业养殖带来巨大的经济损失。因此建议在上述地区乃至山西全省范围内,开展犬只大规模免疫,提高当地犬狂犬病免疫覆盖率。另外,应加强对狂犬病防治知识宣传教育工作力度,宣传狂犬病防治工作的重要性和紧迫性,提高群众的参与意识。

关键词：羊狂犬病阳曲县同源性狂犬病病毒山西省疫情分析

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表达小反刍兽疫病毒流行株H蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

表达小反刍兽疫病毒流行株H蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：杨蕾蕾李文良毛立郝飞张纹纹江杰元江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副黏病毒科、麻疹病毒属的成员,因主要感染小反刍动物而得名,特别是山羊高度易感。国际动物卫生组织(OIE)将PPRV感染列为必须上报的A类疾病,我国也将其列为一类动物疫病。2... 详细信息

引言小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副黏病毒科、麻疹病毒属的成员,因主要感染小反刍动物而得名,特别是山羊高度易感。国际动物卫生组织(OIE)将PPRV感染列为必须上报的A类疾病,我国也将其列为一类动物疫病。2007年西藏自治区首次报道该病疫情。2013年底开始PPRV再次传入我国并迅速传播至全国二十多个省区,造成巨大经济损失,严重威胁我国畜牧业的健康发展。PPRV H基因全长1852bp,开放阅读框大小为1830bp,编码的糖蛋白H有609个氨基酸,H糖蛋白具有神经氨酸酶活性和血凝素活性,且含有T细胞决定簇,在病毒与细胞膜结合过程中作为受体,是重要的保护性抗原。因此,利用H蛋白研制基因工程疫苗将在控制小反刍兽疫中发挥重要的作用。此次新传入的毒株与先前流行毒株相比,出现一定程度的变异,本研究克隆该流行株H基因,构建重组杆状病毒,获得重组蛋白,为后续研究提供有力工具。材料方法根据Genbank中上传的病毒基因组序列合成H蛋白基因序列,3'末端引入HA标签序列,克隆入Bac-to-Bac表达系统质粒pFastBacHT B中,经PCR、酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒转化DH10Bac,经两次蓝白菌落筛选,挑取白色菌落提取Bacmid,将PCR鉴定正确重组的Bacmid(rBac-H)转染Sf9昆虫细胞,连续传代观察细胞病变情况并采用PCR鉴定目的基因的存在,从而获得重组杆状病毒。进一步使用His和HA标签单抗进行Western blot试验鉴定重组蛋白的表达情况。结果讨论合成H基因,成功克隆入pFastBacHT B中,转化DH5t后,挑取菌落经PCR、酶切鉴定为阳性的质粒进一步经测序鉴定序列正确无误,符合阅读框。经两次蓝白菌落筛选,挑取白色菌落提取Bacmid,正确重组的Baemid经M13引物扩增获得约4300bp的条带。转染Sf9细胞后连续传代观察,至第3代接种后4天开始出现细胞病变,细胞变大变圆、脱落,证明获得重组病毒,并将其继续传代扩增,细胞病变产生加快加剧。提取病毒DNA,通过H基因的引物进行PCR检测获得1830bp的目的条带。使用His标签单抗进行Westernblot检测可显示68ku的重组蛋白条带,但HA单抗未检出目的条带,原因有待进一步探究。说明目的蛋白获得正确的表达,具有良好的抗原性。结论成功构建表达2014年PPRV流行毒株H蛋白的重组杆状病毒,蛋白获得正确表达,这将为进一步研究该病毒H蛋白的功能及PPRV疫苗和诊断方法的研究提供基础和材料。

关键词：重组杆状病毒流行毒株小反刍兽疫病毒流行株

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GP5△84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

GP5△84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王晓红宋林林李亮亮袁传奇姜博周恩民穆杨西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西省科学观测实验站

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,俗称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的接触性传染病,以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍和各年龄阶段猪的呼吸道症状、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。由于PRRSV的嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用（ADE）和持续性感染等特征,目前对该病的致病机制和免疫机理都不完全清楚,对PRRS也无确实有效的防制措施。ORF5编码的GP5是一种糖基化囊膜蛋白,是PRRSV最主要的结构蛋白,在病毒的组装、入侵和诱导机体产生免疫应答方面发挥着重要作用。GP5分子质量约25ku,具有高度变异性,美洲型毒株和欧洲型毒株的GP5分别由200和201个氨基酸残基组成。成熟的GP5由氨基端信号肽（1-31aa）、胞外区、三次跨膜的疏水区和位于胞质中的亲水性羧基端组成。三次跨膜的疏水区在病毒囊膜上形成两个胞外区,美洲型毒株位于第一胞外区的氨基端的44和51位（在LV是46和53位）的糖基化位点在不同毒株间高度保守。在LV毒株,46位天冬酰胺（Asn）的糖基化对病毒的组装和感染性是绝对必须的,但Asn 53的糖基化似乎并不重要。有关第二胞外区与病毒复制的关系,目前还未见相关报道。本研究利用PiggyBac Transposon System Vectors构建了表达删除84-119氨基酸残基的截短型GP5的重组质粒(pPB-GP5),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆,获得了稳定表达GP5的Marc-145细胞系。经RT-PCR、Western blot和激光共聚焦显微镜分析,GP5在Marc-145细胞中获得稳定表达,并将此细胞命名为Marc-145-GP5;利用cck-8试剂盒对该细胞的增殖测定证实,Gp5的表达不影响细胞的增殖。用PRRSV SD16株感染Marc-145-GP5细胞,通过病毒基因拷贝数和病毒滴度检测发现,GP5表达可以抑制PRRSV复制;进一步采用Real-time PCR和ELISA检测病毒感染前后细胞IFN-α、β、γ的表达情况,发现GP5表达通过上调IFN特别是IFN-β的表达抑制病毒复制。表明GP5第二胞外区对PRRSV的复制可以发挥调控作用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5△84-119 稳定表达复制干扰素

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禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白与鸡肝脏组织中相互作用蛋白的筛选与鉴定

禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白与鸡肝脏组织中相互作用蛋白的筛选与鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李慧霞赵钦刘宝元王鑫杰陈宜阳王立珍周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是鸡肝炎脾大综合症或鸡大肝大脾病的主要病原。禽HEV主要感染蛋鸡,引起肝脾肿大出血等病变,并导致产蛋量下降,严重影响了蛋鸡养殖产业的发展。目前关于该病毒的感染机制尚未有明确报道,限制了该... 详细信息

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是鸡肝炎脾大综合症或鸡大肝大脾病的主要病原。禽HEV主要感染蛋鸡,引起肝脾肿大出血等病变,并导致产蛋量下降,严重影响了蛋鸡养殖产业的发展。目前关于该病毒的感染机制尚未有明确报道,限制了该病的防治。禽HEVORF2基因编码病毒的衣壳蛋白,在病毒感染宿主过程中发挥着重要的作用。在前期对衣壳蛋白的结构分析发现。该蛋白aa 313-549区域位于天然病毒颗粒的突起部分,参与病毒与宿主细胞的相互作用。因此,为了了解禽HEV感染宿主细胞的分子机制,本研究利用GSTpull down和蛋白质谱鉴定等技术首次筛选并鉴定了禽HEV衣壳蛋白与鸡肝脏组织中相互作用的蛋白,并通过体外共转染进行了验证,为研究病毒吸附或侵入细胞等过程及其致病机理奠定了基础。本研究通过分子生物学技术,构建了禽HEV衣壳蛋白截短区域(aa313-539)的原核表达载体pGEX-6P-1-ap237,并原核表达获得了可溶性重组蛋白GST-ap237。然后将将纯化的GST-ap237与鸡肝脏组织裂解产物进行GSTPulldown,将其互作产物进行蛋白质谱鉴定,结果显示与GST对照组相比,GST-ap237实验组中特异性的蛋白有四种:分别是ATP柠檬酸合成酶/裂解酶(ACLY),甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶(BHMT),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),溶质载体-有机阴离子转运蛋白家族成员1A2(SLCO1A2),并且四种蛋白可能参与禽HEV感染宿主靶细胞的过程。在此基础上,我们挑选了SLCO1A2蛋白进行了进一步体外互作的验证。通过构建pCAGEN-HA-ap237,pCAGEN-HA-ORF2和pCMV-SLCO1A2-3Flag重组真核表达质粒,然后将pCAGEN-HA-ap237和pCAGEN-HA-ORF2与pCMV-SLCO1A2-3Flag共转染293T细胞后,进行Co-IP实验,Western blot实验结果表明ap237与ORF2蛋白均可与SLCO1A2形成复合物,证明SLCO1A2与病毒衣壳蛋白存在相互作用。本研究为进一步探索SLCO1A2蛋白在病毒感染宿主细胞过程中的作用,以及研究禽HEV感染宿主细胞的机制奠定了基础。

关键词：戊型肝炎病毒衣壳蛋白 GST HEV 鸡肝脏宿主细胞相互作用蛋白筛选与鉴定

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鸡白细胞介素4(chIL-4)单克隆抗体的制备与鉴定

鸡白细胞介素4(chIL-4)单克隆抗体的制备与鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：关晓宇王永强李晓齐曹红郑世军中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室

引言白细胞介素4（IL-4）首次发现于20世纪80年代初,是具有多种免疫学调节功能的细胞因子。IL-4对B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、造血细胞及内皮细胞等都具有免疫调节作用,可通过与多种类型的细胞相互作用来调节宿主的防御能力及... 详细信息

引言白细胞介素4（IL-4）首次发现于20世纪80年代初,是具有多种免疫学调节功能的细胞因子。IL-4对B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、造血细胞及内皮细胞等都具有免疫调节作用,可通过与多种类型的细胞相互作用来调节宿主的防御能力及宿主的免疫应答。IL-4属于Th2细胞因子,而Th2免疫应答在动物的寄生虫病等感染性疾病的发生发展过程中起着重要的作用,可作为某些疾病发生过程中免疫应答调控的重要指示因子。目前已有大量文献研究了人、小鼠、大鼠、猪等哺乳动物的IL-4基因及其生物学活性,但关于家禽Th2类细胞因子的研究较少。本研究成功制备了鸡IL-4的单克隆抗体,为临床上鸡IL-4的检测提供了条件,同时也为进一步研究家禽免疫信号通路及免疫应答的研究奠定基础。材料与方法利用本实验室保存的pMD19-T-IL-4构建重组质粒pET-28a-chIL-4和pGEX-6p-1-chIL-4,然后在BL21（DE3）中诱导重组蛋白HIS-chIL-4和GST-chIL-4的表达,分别作为免疫原和杂交瘤阳性克隆筛选蛋白。然后按照文献Current Protocol in Immunology介绍的方法进行细胞融合、阳性杂交瘤细胞的亚克隆与筛选。将阳性杂交瘤细胞注射BALB/c小鼠腹腔获得腹水,用正辛酸饱和硫酸铵法进行纯化,最后利用Western Blot和间接ELISA和等方法对单抗的识别的抗原表位区段和特性进行分析。结果与讨论免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合后,经过三次亚克隆,获得2株能稳定分泌鸡IL-4单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G11和2E5。经间接ELISA测定,这两株单抗的亚型均为IgG1,杂交瘤细胞腹水的效价均为1:8.0×10～5,单抗1G11和单抗2E5的亲和力解离常数（Kd）分别为2.8×10和1.7×10。利用Westem Blot,初步确定单抗1G11和单抗2E5的抗原识别区分别为鸡IL-4蛋白C端的40-80位氨基酸和1-40位氨基酸。目前,国内外对鸡IL-4的研究越来越关注,然而在学术研究和临床疾病分析中主要还是以RT-PCR技术来检测鸡IL-4的相对含量,缺少在蛋白水平上检测chIL-4试剂盒。本研究所制备的识别不同抗原表位的鸡IL-4单克隆抗体,为建立夹心ELISA以用于科研和临床上检测鸡IL-4提供条件,也为深入研究家禽Th2类细胞因子的生物学特性提供了重要的工具。

关键词：杂交瘤细胞 chIL-4 制备与鉴定单克隆抗体

来源：评论

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新城疫病毒JL02/2000株反向遗传辅助系统的构建

新城疫病毒JL02/2000株反向遗传辅助系统的构建

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：陈兴阎富龙鲁会军南福龙曹亮郭海宁金宁一赵权吉林农业大学动物科学技术学院军事医学科学院军事兽医研究所吉林大学动物医学学院

目的新城疫(ND)是一种高致病的禽类恶性传染病。由于其高发病率和高死亡率对社会生产造成巨大经济损失。而近些年,随着反向遗传学操作系统的发展,其为系统的操作和研究RNA病毒提供了操作平台,该方法可以重新设计和优化病毒的基因组,还... 详细信息

目的新城疫(ND)是一种高致病的禽类恶性传染病。由于其高发病率和高死亡率对社会生产造成巨大经济损失。而近些年,随着反向遗传学操作系统的发展,其为系统的操作和研究RNA病毒提供了操作平台,该方法可以重新设计和优化病毒的基因组,还可以研发新的突变体和重组病毒疫苗,所以NDV的反向遗传操作平台为研究其生物学特点具有重大意义。方法本研究以新城疫病毒JL02/2000株为目标病毒,设计构建其反向遗传操作系统。由于新城疫病毒反向遗传操作病毒传拯救时必须同时共转染多个辅助质粒,并在T7 RNA聚合酶调控下转录、翻译后形成RNP核糖核蛋白复合体,包裹病毒全基因组,从而开始病毒复制程序。本实验以BL-21大肠杆菌为模板设计引物,应用PT-PCR方法获得T7基因,之后通过分子生物学方法构建痘苗病毒重组质粒pSTK-T7,将其转染至BHK-21细胞与痘苗病毒进行重组,筛选得到稳定表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒,用于提供T7 RNA聚合酶;根据新城疫病毒JL02/2000株全基因组设计引物,之后通过分子生物学方法构建辅助质粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P三个辅助质粒,其中L基因片段较大,所以采用分段克隆的方法,应用一步法克隆完成构建,通过这三个辅助质粒在细胞内表达形成RNP核糖核蛋白复合体。结果与讨论构建了表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒,经测序鉴定、细胞荧光显微镜观察、细胞内表达鉴定,确认其基因结构无误并成功表达;构建的三个辅助质粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P,经PCR检测、酶切鉴定、测序鉴定、转染BHK-21细胞检测,确认其基因序列准确并可以在BHK-21细胞内表达。L蛋白、P蛋白和NP蛋白都是病毒的骨架蛋白,其中L蛋白与依赖RNA的核糖核酸聚合酶结合形成P-L复合体,而N蛋白的氨基末端可以与病毒RNA作用,这三个蛋白相互作用形成RNP复合体并进行基因组的复制,形成正链RNA,在以正链RNA为模板合成负链RNA,从而完成病毒的基因组复制,而对于负链RNA病毒的反向遗传学操作平台的构建,这三个辅助质粒和表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒都是其构建的基础,也是前期准备。结论本实验成功构建了表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒、辅助质粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P,并经过验证有效,可以转入BHK-21细胞表达。成功完成了新城疫病毒JL02/2000株反向遗传辅助系统的构建,为该毒株的反向遗传构建奠定了基础。

关键词：新城疫病毒聚合酶 RNA 反向遗传重组痘苗病毒 JL02/2000

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出血性大肠杆菌O157:H7免疫磁性分离方法的建立

出血性大肠杆菌O157:H7免疫磁性分离方法的建立

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：梁冰纪雪孙洋祝令伟刘军周伟郭学军冯书章吉林农业大学动物科技学院军事医学科学院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室

引言磁性纳米粒子是近几年发展起来一种新型材料,与免疫学相结合,广泛应用于病理、药理、分子遗传学和微生物等领域。尤其在免疫检测方面,逐渐受到重视。出血性大肠杆菌(EHEC)主要存在O157、O26和O111等几种血清型,其中主要以O157:H7为... 详细信息

引言磁性纳米粒子是近几年发展起来一种新型材料,与免疫学相结合,广泛应用于病理、药理、分子遗传学和微生物等领域。尤其在免疫检测方面,逐渐受到重视。出血性大肠杆菌(EHEC)主要存在O157、O26和O111等几种血清型,其中主要以O157:H7为典型菌株,是一种动物源性传染病,牛和少数反刍动物为贮存宿主,对人有很强的致病力。本研究主要是建立一种灵敏性较高、特异性较好的分离O157:H7的免疫磁珠检测技术。材料与方法首先制备O157:H7单克隆抗体,并应用ELISA方法检测单克隆抗体效价。通过国内五种磁珠与国外两种磁珠的比较,优化磁珠与单克隆抗体的偶联条件,包括偶联时间、偶联温度和耦合缓冲液PH值等,选取最适磁珠和最佳偶联条件。磁珠与纯化后的单克隆抗体偶联制成O157免疫磁珠,通过测定偶联前后抗体蛋白浓度,计算磁珠蛋白偶联量。通过免疫磁珠捕获不同浓度的大肠杆菌O157:H7,利用涂板后计数,计算免疫磁珠的灵敏性;培养多种肠道常见菌株,与大肠杆菌O157:H7菌液等体积混匀,再进行免疫磁珠对混合菌液中目的菌的富集,然后将磁珠涂板于O157选择培养基,检测免疫磁珠的特异性。结果与讨论通过五种磁珠的比较,选取国内倍思乐羧基磁珠(直径0.5～1μm)。偶联条件为在振荡器上磁珠悬浮液37℃孵育2h,耦合液PH为7.4。通过免疫小鼠获得腹水,制备大肠杆菌O157:H7单克隆抗体效价达1:1.024×10～4;制备单抗免疫磁珠对大肠杆菌O157:H7的特异性好,捕获效率因细菌浓度的不同,捕菌效率也不同。在1.4×10～4CFU/mL细菌含量,磁珠的吸附率为53%;在1.4×10～2CFU/mL细菌含量,磁珠的吸附率为83%。大肠杆菌O157:H7细菌含量在1.4×10～4CFU/mL时,特异性集菌率为90%;在1.4×10～3 CFU/mL时,特异性集菌率为43%,而在140 CnU/mL时,特异性集菌率仅为7%。结论大肠杆菌O157:H7在人类感染疾病中的地位越来越突出,很多实验室对其检测方法都已进行深入研究。本研究通过制备单抗免疫磁珠对大肠杆菌O157:H7进行富集,具有较高的特异性和灵敏性,建立免疫磁珠富集鉴定大肠杆菌O157:H7的方法具有可行性。

关键词：出血性大肠杆菌灵敏性单克隆抗体免疫磁珠 O157:H7 特异性 CFU 免疫磁性分离

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牛传染性鼻气管炎病毒气溶胶荧光定量PCR方法的建立及初步应用

牛传染性鼻气管炎病毒气溶胶荧光定量PCR方法的建立及初步应用

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：宋玲玲王洪梅何洪彬山东省农业科学院奶牛研究中心

引言/目的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)可引起牛高热、上呼吸道及气管发炎、繁殖障碍等多种症状。在过分拥挤、封闭式环境中,IBRV可通过空气传播,对牛群肥育率、产奶量和繁殖影响极大。因此,亟待建立牛场IBRV气溶胶的检测技术,为IBRV的... 详细信息

引言/目的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)可引起牛高热、上呼吸道及气管发炎、繁殖障碍等多种症状。在过分拥挤、封闭式环境中,IBRV可通过空气传播,对牛群肥育率、产奶量和繁殖影响极大。因此,亟待建立牛场IBRV气溶胶的检测技术,为IBRV的流行病学调查及切断气溶胶传播途径的防控策略提供技术支持。材料与方法结合本实验室分离获得的IBRV和Genbank中的病毒全基因组序列,针对gD基因的保守区域,设计多对特异性引物,最终选择一对引物建立了IBRV实时荧光定量PCR检测方法,并应用冲击式采样器收集养殖场不同环境中的病毒气溶胶样本,富集病毒气溶胶样本,提取基因组DNA,并进行特异性、敏感性、重复性的检测。利用建立的方法对牛舍气溶胶样本进行IBRV检测。结果与讨论建立了IBRV实时荧光定量PCR检测方法,该方法在1.7×10～0-1.7×10～6拷贝/μL内有良好的线性关系,其相关系数为0.998;利用10倍稀释法检出灵敏度达1.7×10～0拷贝/μL,比常规PCR检测方法高10倍;该方法与牛病毒性腹泻病毒、牛副流感3型病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒均无交叉反应,具有较好的特异性;应用该诊断方法检测了35份临床血清样本,抗体阳性率为22.9%(8/35),检出阳性率较传统PCR方法高11%。说明所建立的荧光定量PCR方法特异性好,灵敏度高,稳定可靠。与传统PCR方法相比,实时定量PCR最大的优点是能实时监测反应早期到终点过程中PCR的扩增情况,同时还具有敏感性高、需要样品量少、特异性优良、能精确定量等特点。荧光定量PCR方法,对引物设计要求较高,操作时需要在冰上操作,否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性。因此,需要合理设计引物,优化反应体系和反应条件。结论成功建立了IBRV实时荧光定量PCR检测方法,可应用于IBRV病毒气溶胶的实时监测,为牛场IBRV的监测与评估提供了有力的技术支持。

关键词：实时荧光定量牛传染性鼻气管炎 PCR 初步应用气溶胶

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