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RHDV VP60蛋白与受体HBGAs结合位点的初步分析

RHDV VP60蛋白与受体HBGAs结合位点的初步分析

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李珊珊胡波宋艳华范志宇魏后军王芳江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言兔出血症是由免出血症病毒(RHDV)引起的高度致死性传染病。VP60是RHDV的主要结构蛋白,真核表达VP60能够形成与天然病毒类似的病毒样颗粒(VLPs),可作为研究该病毒的模型。组织血型抗原(HBGAs)是由O-或N-末端连接到蛋白或糖脂上的多糖... 详细信息

引言兔出血症是由免出血症病毒(RHDV)引起的高度致死性传染病。VP60是RHDV的主要结构蛋白,真核表达VP60能够形成与天然病毒类似的病毒样颗粒(VLPs),可作为研究该病毒的模型。组织血型抗原(HBGAs)是由O-或N-末端连接到蛋白或糖脂上的多糖,研究证实RHDV侵染机体时能够特异性识别HBGAs受体。本文通过VP60截短蛋白与HBGAs结合试验,分析受体的结合位点。材料与方法(1)蛋白样品:杆状病毒表达的VP60蛋白、大肠杆菌表达的VP60截短蛋白P250-350、P330-440、P470-579、P330-350和P559-579,均由本实验室表达。(2)H型HBGAs的检测:采集O型血志愿者的唾液并进行处理。利用血凝抑制试验筛选含H型HBGAs个体的唾液样品。(3)VP60与HBGAs结合试验:筛选最佳唾液包被浓度、VP60蛋白浓度、mAbs稀释度及酶标二抗稀释度。结合试验步骤:PBS稀释的唾液包被于酶标板上;封闭后加入VP60,mAbs 3D11为一抗;HRP标记羊抗鼠IgG为二抗;TMB显色,测定OD450nn。(4)截短蛋白与HBGAs结合试验:将VP60和截短蛋白进行SDS-PAGE,转印于NC膜上,以3D11为一抗,HRP标记羊抗鼠IgG为二抗,ECL显色。HBGAs结合试验:将VP60及截短蛋白分别按终浓度10μg/mL4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL稀释。HBGAs结合试验步骤按2.3操作。结果与讨论(1)唾液中HBGAs的测定:采集的O型人唾液原液能够完全抑制红细胞与抗H试剂的凝集,表明唾液样品为分泌O型。(2)SDS-PAGE和Westem-blot:VP60及截短蛋白SDS-PAGE电泳显示,在60ku、30ku、28ku左右处有明显条带,与预期大小一致。Westem-blot表明,VP60及截短蛋白均与相应的mAbs有特异性反应。(3)HBGAs结合试验:试验显示,VP60、截短蛋白P250-350、P330-440、P330-350与HBGAs结合反应均为阳性,且随蛋白浓度升高结合值升高;而P470-579、P559-579与HBGAs结合的值与空白对照无差异,说明不与HBGAs结合。结论本研究成功建立了VP60与唾液中HBGAs受体结合的方法,并对VP60截短蛋白进行分析,最终获得330-350aa是VP60与HBGAs受体结合的关键区域之一。该研究有助于了解病毒与宿主相互作用的机制,为病毒的吸附、感染及抗病毒药物的研究奠定基础。

关键词： RHDV VP60 HBGAs 受体结合结合位点初步分析

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宠物源大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析

宠物源大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘果纪雪孙洋刘哲祝令伟刘军周伟郭学军冯书章军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室

引言越来越多的证据表明细菌及其携带的耐药性能够在人和动物之间水平传播。宠物因其与人类的密切关系,其携带细菌耐药性的问题得到愈加广泛的关注。宠物源耐药菌的流行,不仅限制了抗生素临床治疗的效果,而且威胁到人类健康,给公共卫生... 详细信息

引言越来越多的证据表明细菌及其携带的耐药性能够在人和动物之间水平传播。宠物因其与人类的密切关系,其携带细菌耐药性的问题得到愈加广泛的关注。宠物源耐药菌的流行,不仅限制了抗生素临床治疗的效果,而且威胁到人类健康,给公共卫生带来严重影响。材料与方法本研究2015年从长春地区宠物医院采集135份宠物肛拭子样品(其中犬122份、猫12份、猴1份),通过麦康凯选择性培养基和科玛嘉显色培养基,以及大肠杆菌特异性16SrDNA PCR鉴定和细菌鉴定仪检测分离鉴定大肠杆菌,并对分离株进行多重PCR分群。通过全自动微生物鉴定/药敏系统检测这些分离株对19种共六大类抗生素的耐药谱,并确定超广谱β-内酰胺酶(ESBL)表型,统计耐药率,分析宠物源大肠杆菌耐药流行特点。结果与讨论共分离获得95株大肠杆菌,对氨苄西林和哌拉西林的耐药率最高,分别为78.9%和76.8%;其次是四环素,耐药率高达61.6%;对头孢唑林(56%)、头孢噻肟(52.6%5)、庆大霉素(56%)、复方新诺明(50.5%)、环丙沙星(51.6%)和左氧氟沙星(50.5%)耐药严重;对氟霉素(37.9%)和氨苄西林-舒巴坦(30.5%)中度耐药;对阿米卡星(17.9%)、头孢他啶(12.6%)、氨曲南(23.2%)、阿莫西林-克拉维酸(2.1%,)相对敏感;仅对亚胺培南和美罗培南全部敏感。有15株大肠杆菌分离株对所有抗生素全部敏感(15.8%),9株大肠杆菌对1～3种抗生素耐药(9.47%),其余全部表现出对3种及以上的抗生素耐药。多重耐药菌为63株(66.3%),其中对五类抗生素耐药的菌株最多,为27株(28.4%),对所检测的六类抗生素全部耐药的有11株(11.6%)。ESBL表型的大肠杆菌占53.7%。结果显示,宠物源大肠杆菌对早期抗生素如氨苄西林和四环素耐药情况都相当严重,而对目前宠物临床上的常用抗生素一头孢噻肟、庆大霉素、磺胺类、喹诺酮类抗生素的耐药率也都超过了50%。本研究中宠物源大肠杆菌对各种抗生素的耐药率均远高于国外同类研究中的报道,整体上略低于国内其它地区。而ESBL表型菌株比例高于国内其他地区相关报道。结论第三四代头孢菌素、氨基糖苷类以及氟喹诺酮类抗生素是目前人类临床上最为常用的抗生素,本研究发现宠物源大肠杆菌对这些抗生素耐药率显著上升,鉴于宠物多与人类密切接触,这将会对人类健康造成严重威胁。本研究调查了长春地区宠物源大肠杆菌的耐药流行本底,也为宠物临床抗生素的使用提供了参考。

关键词：长春地区耐药率氨苄西林大肠杆菌分离鉴定耐药性分析

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亚洲首株蝙蝠丝状病毒的鉴定

亚洲首株蝙蝠丝状病毒的鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：何彪张海林涂长春军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病防控重点实验室云南省地方病防治所

引言丝状病毒（Filovirus）是单链负股RNA病毒,目前包括三个属,分别是经典的埃博拉病毒属（Ebolavirus）、马堡病毒属（Marburgvirus）以及新近从西班牙蝙蝠体内发现的库瓦病毒属（Cuevavirus）,其中埃博拉病毒和马堡病毒是目前最为烈... 详细信息

引言丝状病毒（Filovirus）是单链负股RNA病毒,目前包括三个属,分别是经典的埃博拉病毒属（Ebolavirus）、马堡病毒属（Marburgvirus）以及新近从西班牙蝙蝠体内发现的库瓦病毒属（Cuevavirus）,其中埃博拉病毒和马堡病毒是目前最为烈性的病原体之一。非洲是丝状病毒病最重要的疫源地,丝状病毒中的绝大多数成员也都集中在非洲,除了菲律宾的雷斯顿型（Reston ebolavirus）和西班牙的库瓦病毒。蝙蝠被认为是丝状病毒的自然宿主,目前已经从非洲和欧洲的果蝠和食虫蝠体内通过核酸检测、血清学检测和病毒分离找到了丝状病毒的证据。在亚洲,尤其是东南亚的菲律宾、孟加拉国和我国,有研究表明这些地方的蝙蝠也有不同程度的血清学阳性,但缺乏关键的核酸证据证明该地区蝙蝠携带丝状病毒。材料与方法 2013年,本课题组从云南省采集了29只健康的棕果蝠（Rousettus leschenaultia）,分别收集器肠、肺、肝和脑组织,并对其进行病毒宏基因组学（Sword of Viral Metagenomics,SVM）分析;根据病毒宏基因组学结果设计针对新型丝状病毒的特异性RT-PCR检测引物,并用于所有样品的检测;检测阳性的样品进行全基因组的扩增。结果与讨论通过SVM分析,从该批蝙蝠中发现了3条重叠序列（Contig）与目前的丝状病毒具有70%左右的同源性,将其中最长的一条354 nt的序列用于检测引物的设计,结果我们从一只蝙蝠的肺脏中检测出了该病毒。根据目前所有丝状病毒设计扩增全基因组的兼并引物,结果获得了两条长度分别为2750 nt（F1）和2682 nt（F2）的片段,通过分析发现F1对应丝状病毒NP基因的3'端到整个VP35基因,F2对应丝状病毒L基因的中间部分;对其进行遗传演化分析发现两个片段同埃博拉病毒的同源性为46-49%和66-68%,同库瓦病毒的同源性为44%和64%,同马堡病毒的同源性为<40%和0%,较低的同源性可能是阻碍我们获得全基因组的主要原因。本发现首次在核酸水平上证明亚洲蝙蝠携带丝状病毒,遗传分析表明该丝状病毒与目前所有的丝状病毒具有较大的差异性,可能是一种新型的丝状病毒,这提示蝙蝠所携带的丝状病毒远比我们想象的复杂和多样,也说明蝙蝠在丝状病毒的保存和循环中具有重要的作用。棕果蝠在东南亚、我国南部地区和整个印度次大陆具有非常广泛的分布,并且由于其特殊的生活习性使其很容易与人和其它动物发生接触,从而将其携带的病毒传播给人类。由于本发现数据的限制,我们无法了解该新型丝状病毒的潜在公共卫生威胁,但为了防患于未然,在未来我们需要加大该病毒在蝙蝠中的监测力度。

关键词：丝状病毒病毒宏基因组学全基因组

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猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗接种剂量对猪免疫应答的影响

猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗接种剂量对猪免疫应答的影响

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：张鹤王晓波李丽敏孙泰然逯继成宋勤叶河北农业大学动物医学院河北省兽用生物制品工程技术研究中心保定市动物疫病预防控制中心

引言/目的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是危害养猪业最重要的免疫抑制病之一。疫苗接种是当前预防PRRS主要措施之一,但临床上常出现免疫效果与理想结果相背离的情况,最终导致免疫失败。本研究旨在评价PRRS弱毒疫苗（致弱VR-2332株和JXA1-... 详细信息

引言/目的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是危害养猪业最重要的免疫抑制病之一。疫苗接种是当前预防PRRS主要措施之一,但临床上常出现免疫效果与理想结果相背离的情况,最终导致免疫失败。本研究旨在评价PRRS弱毒疫苗（致弱VR-2332株和JXA1-R株）的接种剂量对猪免疫应答的影响,为PRRS有效防控措施的制定提供科学依据。材料与方法从规模化猪场A和B分别随机选取9窝2 w健康哺乳仔猪,各分为3组,每组31头。猪场A的3组分别经颈部肌肉接种1、2、3头份(10TCID/头份)弱毒疫苗（VR-2332株）;猪场B的3组猪,分别经颈部肌肉接种1、2、3头份(10TCID/头份)PRRS弱毒疫苗（JXA1-R株）。免疫前和免疫后2、4、6、9 w采血,检测PRRSV抗体动态;免疫后9周检测猪瘟病毒（CSFV）和伪狂犬病毒（PRV）抗体水平,分析不同接种剂量的PRRS弱毒疫苗对其他疫苗免疫效果的影响;免疫后2 w测定各组血清中IFN-γ、-2、IL-4、IL-10的水平。结果与讨论PRRSV弱毒疫苗VR-2332株和JXA1-R株,均没有引起猪不良临床反应。2头份VR-2332株免疫猪的抗体产生动态优于用1头份和3头份;2头份或3头份JXA1-R株免疫后诱导的抗体动态优于1头份,2头份与3头份剂量之间的抗体动态无显著差异。3头份VR-2332株或JXA1-R株免疫会明显影响CSFV抗体产生,1头份和2头份对猪瘟疫苗免疫应答的影响无明显区别;2头份和3头份VR-2332株和JXA1-R株免疫猪的PRVgB抗体水平高于1头份免疫猪,且组内个体之间的抗体水平离散度小。免疫后2w,在3个剂量VR-2332株免疫猪的血清中,没有检测到IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10四种细胞因子,而3个剂量JXA1-R株免疫猪的血清中检测到了不同水平的上述四种细胞因子,并且3头份剂量JXA1-R株免疫猪血清中的IFN-γ、IL-4和IL-10的平均水平显著高于1和2头份剂量免疫组。结论 PRRSV弱毒疫苗的毒株与接种剂量明显影响机体的免疫应答,致弱的JXA1-R株会引起明显的细胞因子反应;2头份PRRS弱毒疫苗VR-2332株或JXA1-R株能够诱导机体产生良好的免疫效果,时猪瘟弱毒疫苗、伪狂犬弱毒疫苗免疫效果的影响最小。

关键词：弱毒疫苗猪繁殖与呼吸综合征 PRRSV 接种剂量免疫应答

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以CMV启动子驱动鹅源基因Ⅶ型NDV拯救与弱毒疫苗候选株的构建

以CMV启动子驱动鹅源基因Ⅶ型NDV拯救与弱毒疫苗候选株的构建

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王建忠冯娜王化磊杨松涛夏咸柱丁壮吉林大学动物医学学院军事医学科学院11所

引言新城疫（Newcastle disease,ND）是危害世界养禽业的重要传染病之一,当前在世界范围内NDV的流行以基因Ⅶ型为主,而国内外广泛使用的弱毒疫苗株均为基因Ⅱ型,由于基因型与抗原性的不匹配,当前广泛应用的弱毒疫苗株不能完全阻止病毒感... 详细信息

引言新城疫（Newcastle disease,ND）是危害世界养禽业的重要传染病之一,当前在世界范围内NDV的流行以基因Ⅶ型为主,而国内外广泛使用的弱毒疫苗株均为基因Ⅱ型,由于基因型与抗原性的不匹配,当前广泛应用的弱毒疫苗株不能完全阻止病毒感染,并且受到强毒流行株攻击后排毒现象严重。反向遗传操作技术的发展,尤其是理想的病毒拯救系统,为研发与流行毒株相一致的基因Ⅶ型NDV弱毒疫苗候选株及候选疫苗载体提供了新思路。材料与方法BHK-21细胞由本实验室保存;SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。全长转录质粒与辅助质粒构建:采用分段克隆、体外拼接的策略构建NDVNA-1株基因组全长cDNA克隆,并在两端分别引入锤头核酶和丁型肝炎病毒核酶序列,插入到载体pCI-neo的CMV启动子下游,构成全长转录质粒pCI-NA-1。将NP、P和L基因ORF克隆至载体pcDNA3.1中构建辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L。重组病毒的拯救:将转录质粒pCI-NA-1及辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L按4:2:1:1比例共转染BHK-21细胞,将转染产物接种SPF鸡胚尿,成功获得子代重组病毒rNA-1。重组病毒的鉴定:经间接免疫荧光、电镜观察、RT-PCR及测序分析对重组病毒rNA-1进行鉴定,以确定其完全来源于所构建的cDNA克隆。致弱株的构建:将NDVNA-1株天然强毒株特征的F裂解序列RRQKR↓F替换为弱毒特征基序GRQGR↓L,拯救获得突变致弱株rmNA-1。免疫原性评价:以此鹅源基因Ⅶ型NDV致弱株按2×10～6 EID/0.2mL/只的剂量通过皮下免疫4日龄雏鹅,间隔三周后,加强免疫一次,并于免疫前和免疫后每周采血一次,分离血清。结果与讨论通过血凝及血凝抑制检测证实重组病毒rNA-1拯救成功,电镜观察可见典型副黏病毒形态特征,以NDV抗血清进行免疫荧光染色在荧光显微镜可见特异的绿色荧光反应,RT-PCR鉴定结果表明重组病毒rNA-1完全由cDNA质粒拯救而来排除野毒污染。突变修饰株rmNA-1致病力显著降低,致病表型从强毒变为弱毒;以rmNA-1免疫雏鹅后,可诱导产生坚实的NDV特异中和抗体,加强免疫三周后最高抗体水平可达10.5log,并且直到免疫后12周抗体水平仍维持在6.75log2。结论成功构建由CMV启动子控制不依赖传统T7 RNA聚合酶的NDV拯救系统,并成功获得基因Ⅶ型NDV致弱株,免疫雏鹅后显示出良好的免疫原性,为新型弱毒疫苗候选株的研制奠定了基础。

关键词：基因Ⅶ型 NDV 疫苗候选株启动子 CMV

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猪气管原代上皮细胞的气液培养模型建立

猪气管原代上皮细胞的气液培养模型建立

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：张峥嵘冯志新何丽娜王海燕甘源马庆红熊祺琰刘茂军邵国青江苏省农业科学院兽医研究所

引言猪的呼吸道粘膜形成一道天然屏障,保护呼吸道和肺免受感染,构成机体防御的重要组成。为了研究呼吸道上皮细胞的复杂机理和不同功能,人呼吸道上皮细胞分离培养模式,即气管原代黏膜上皮细胞气液界面培养模型已被研究成功。这种体外模... 详细信息

引言猪的呼吸道粘膜形成一道天然屏障,保护呼吸道和肺免受感染,构成机体防御的重要组成。为了研究呼吸道上皮细胞的复杂机理和不同功能,人呼吸道上皮细胞分离培养模式,即气管原代黏膜上皮细胞气液界面培养模型已被研究成功。这种体外模型与气管黏膜上皮细胞在体内生长的形态类似,同时又排除了动物活体由于环境因素产生的不确定性,可以作为研究病原体感染呼吸道机制的模型。本研究即为了建立一个体外猪原代呼吸道上皮细胞气液界面培养模型。材料与方法以人呼吸道气管黏膜上皮细胞气液界面培养方法为参考,分别对供体猪的选择标准、原代细胞分离消化时间、培养基配方的种类等方面进行筛选确定。结果与讨论在供体猪健康状态方面发现,供体猪在感染猪肺炎支原体等呼吸道病原时会严重影响原代气管上皮细胞的活性与体外增殖能力;3月龄猪较0.5月龄猪虽然活的纤毛细胞比例接近,但细胞总数多。因此,我们推荐使用2-3月龄,无猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒或猪肺炎支原体等呼吸道病原感染的健康仔猪作为合适的供体猪。2-3月龄猪的气管上皮细胞的最佳消化时间为24-30小时。对于培养基的选择,根据细胞生长贴壁及分化能力,分别从BEGM、BEGM/5%FCS、DMEM/F12/2%USG和DMEM/F12/5%FCS四种培养基中筛优选出BEGM/5%FCS配方;再优化BEGM/5%FCS培养基配方中表皮生长因子浓度为10ng/ml,视黄酸的浓度为10M。利用上述优化的培养基培养猪原代呼吸道上皮细胞,在细胞接种至插入式细胞培养小室24小时后,细胞贴壁率高,细胞增殖速度较快。一般2-4天可以迅速铺满整个插入式培养小室的膜表面,并形成气液界面培养;细胞生长4-6天后,扫描电镜可见大多数细胞表面覆盖有微绒毛,少数部分有纤毛分化;气液界面培养7天后,细胞结构呈现立体圆形,细胞电阻值达280Ω/cm;14天后,扫描电镜观察可见有分化成熟的纤毛;但当细胞生长到21天时,大部分细胞开始脱落,细胞间空隙增大,存活的细胞仍可见生长成熟的纤毛。结论本研究成功建立了猪原代气管黏膜上皮细胞的气液培养模型。下一步的工作将着重于该模型在体外的持续期研究。

关键词：呼吸道上皮细胞气管上皮细胞细胞生长呼吸道病原猪肺炎支原体培养模型

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Viperin对猪瘟病毒的抑制作用研究

Viperin对猪瘟病毒的抑制作用研究

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李文良毛立杨蕾蕾郝飞张纹纹江杰元江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言干扰素是先天免疫的重要组成成分,其中Ⅰ型干扰素与特异受体结合后可以诱导产生多达300种的干扰素刺激基因（ISGs）。Viperin是近年来新发现的一种ISG,已有研究证明它对多种病毒具有抗病毒活性,如HCMV、流感病毒、丙型肝炎病毒（HC... 详细信息

引言干扰素是先天免疫的重要组成成分,其中Ⅰ型干扰素与特异受体结合后可以诱导产生多达300种的干扰素刺激基因（ISGs）。Viperin是近年来新发现的一种ISG,已有研究证明它对多种病毒具有抗病毒活性,如HCMV、流感病毒、丙型肝炎病毒（HCV）、西尼罗河病毒（WNV）、登革热病毒等。猪瘟是危害养猪业发展的重要病毒病。本研究扩增猪Viperin基因,构建真核表达质粒,转染PK-15细胞构建稳定表达Viperin的细胞系,在此基础上研究Viperin对猪瘟病毒复制的抑制作用,丰富了Viperin抗病毒谱,为猪瘟的防控提供新的思路。材料与方法设计引物扩增猪Viperin完整基因序列,克隆入pEGFP-C1中构建真核表达质粒,转染PK-15细胞,经G418筛选克隆传代,获得稳定表达Viperin的细胞系PK-Vi,同时使用空质粒构建对照细胞系PK-C1,通过Western blot和IFA鉴定蛋白的表达情况。将两种细胞铺于24孔细胞培养板,接种100 TCID猪瘟石门株病毒,在12、24、48、72h后分别收获细胞,通过荧光定量RT-PCR和TCID检测比较病毒复制水平的差异。进而构建表达CSFV蛋白E2、NS3、NS5B的真核表达质粒,与Viperin表达质粒共转染BHK21细胞,通过激光共聚焦检测蛋白的共定位情况。结果与讨论RT-PCR成功获得猪Viperin编码基因,克隆入pEGFP-C1中,转染PK-15细胞后绿色荧光主要表达在细胞浆中,且表达蛋白定位于内质网上。质粒转染PK-15细胞后经过G418筛选、克隆、检测、传代获得稳定表达Viperin的细胞系PK-Vi,与对照细胞系PK-C1共同进行Western blot鉴定,分别获得28ku和70ku的目的条带,表明重组蛋白以正确的形式表达。接种CSFV后,PK-Vi组在12、24、48、72h病毒基因组相对含量比对照组分别降低1.5、3.2、4.8、3.5倍,TCID检测也显示相似的结果,病毒含量分别降低2、3.2、6.3、5倍。激光共聚焦检测结果表明Viperin与病毒E2和NS5B蛋白存在共定位。结论本研究成功克隆猪Viperin基因序列,并构建稳定表达Viperin的PK-15细胞系。接种猪瘟病毒后能够显著抑制病毒的增殖,且Viperin与CSFV E2、NS5B蛋白存在共定位,说明Viperin主要影响病毒基因组的复制,与病毒蛋白的相互作用可能介导其抗病毒作用的发挥。

关键词： Viperin 真核表达质粒基因序列猪瘟病毒细胞系抑制作用

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土拉弗朗西斯菌greA基因表达对相关毒力基因转录水平的调控

土拉弗朗西斯菌greA基因表达对相关毒力基因转录水平的调控

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：崔国林苏敬良中国农业大学动物医学院

引言土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)是一种革兰氏阴性胞内寄生菌,它所引起的土拉热(野兔热)是一种重要的自然疫源性人畜共患病。本研究以土拉弗朗西斯菌新杀亚种(***)为模式株,通过定向基因缺失突变筛选和鉴定影响细菌胞内繁... 详细信息

引言土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)是一种革兰氏阴性胞内寄生菌,它所引起的土拉热(野兔热)是一种重要的自然疫源性人畜共患病。本研究以土拉弗朗西斯菌新杀亚种(***)为模式株,通过定向基因缺失突变筛选和鉴定影响细菌胞内繁殖和致病力的基因,并进一步探讨毒力基因对细菌致病力影响的分子机制。greA基因编码的GreA蛋白是一种基因转录延长因子,它可以增强转录保真性,抑制转录暂停,刺激RNA聚合酶从启动子逃逸和加快转录起始至延伸的过渡等。苏敬良等前期通过转座子随机突变技术已经证实greA基因插入突变株对小鼠毒力显著下降,本研究通过转录组测序比较分析greA基因缺失对土拉弗朗西斯菌相关基因转录水平的影响,表明greA基因的表达对细菌毒力岛等相关基因的表达具有显著影响,毒力岛关键基因的表达下调可能是引起该菌致病力下降的重要因素之一。材料与方法(1)greA基因缺失菌株构建:分别设计引物扩增greA基因的上下游同源臂及抗卡那霉素基因,利用重叠PCR将这三个基因片段连接,然后通过电转化将其转入土拉弗朗西斯菌新杀亚种U112中,利用卡那霉素筛选获得greA突变株。(2)转录组测序及分析:分别将过夜培养的greA突变株及亲本株转接入新鲜的TSB培养基(添加0.1%L-半胱氨酸),37℃200 rpm培养6 h至对数期,利用细菌RNA提取试剂盒(康为世纪,CW0539)分别提取RNA,并将其送至上海翰宇生物科技有限公司进行转录组测序和分析。结果与讨论本研究成功构建了greA基因缺失菌株,然后将之与其亲本菌株进行转录组测序分析比较。与亲本菌相比,greA基因缺失菌中共有193个基因转录发生了改变(下调基因145个,上调基因48个),它们主要参与能量代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、碳水化合物代谢、脂代谢、信号转导和蛋白转运等通路,这表明greA基因参与细菌的全局转录调控。毒力决定因子(转运蛋白)、毒力相关代谢通路(氨基酸、核酸或辅因子生物合成)的基因转录均发生了显著下调。其中,已知的土拉弗朗西斯菌17个毒力岛基因(FPI)转录均下调,这可能与greA基因缺失菌对小鼠致病力下降有关;另外,与毒力岛基因调节相关基因(如fevR、sspA、mglA、pmrA等)的转录均未发生显著性改变,这表明greA基因可能直接通过调节毒力岛基因发挥作用。嘧啶代谢通路的pyrB、carB、carA基因发生显著下调,这些基因均已证实可以影响土拉弗朗西斯菌在巨噬细胞中的增殖,它们的转录下调可能导致本菌在宿主细胞中增殖减缓,进而导致致病力下降。结论 greA基因参与土拉弗朗西斯菌基因的全局转录调控,对其毒力岛基因有重要的调节作用。

关键词：毒力岛基因基因转录水平土拉弗朗西斯菌基因缺失基因表达

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禽呼肠孤病毒蛋白启动PI3K/Akt信号通路的研究

禽呼肠孤病毒蛋白启动PI3K/Akt信号通路的研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：谢丽基谢芝勋黄莉谢志勤邓显文刘加波罗思思黄娇玲曾婷婷张艳芳王盛广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室

引言研究表明,病毒蛋白或细胞蛋白通过PXXP(P为脯氨酸,X为任意氨基酸)或YXXXM/YXXM(Y为酪氨酸,X为任意氨基酸,M为蛋氨酸)基序与P85结合,从而激活PI3K/Akt信号通路,使磷酸化的Akt(P-Akt)表达量升高,实现抑制细胞凋亡的发生。Lin等使用AR... 详细信息

引言研究表明,病毒蛋白或细胞蛋白通过PXXP(P为脯氨酸,X为任意氨基酸)或YXXXM/YXXM(Y为酪氨酸,X为任意氨基酸,M为蛋氨酸)基序与P85结合,从而激活PI3K/Akt信号通路,使磷酸化的Akt(P-Akt)表达量升高,实现抑制细胞凋亡的发生。Lin等使用ARV感染Vero细胞后,通过Western lot检测P-Akt的表达量,从病毒的角度证实了ARV感染的早期激活了PI3K/Akt信号通路,从而抑制了感染细胞的凋亡,以有利于ARV完成其复制周期。但ARV是通过哪一个蛋白来启动PI3K/Akt信号通路,实现抑制感染细胞的凋亡,目前还不清楚。材料与方法本研究对ARV15个蛋白的氨基酸序列进行了分析,表明其中σA、σNS、μA、μB和μNS共5个蛋白具有PXXP和YXXXM/YXXM基序(即这5个蛋白具有潜在激活PI3K/Akt信号通路的活性),并且这些氨基酸序列在ARV不同毒株之间都是保守的。因此本课题选取这5个蛋白作为研究对象,构建了重组质粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN,转染Vero细胞后,分析Vero细胞P-Akt表达量的差异。结果与讨论将构建的重组质粒转染Vero细胞,采用间接免疫荧光和Westernblot检测目的蛋白的表达,检测结果显示,转染6小时后,目的蛋白σA、σNS、μA、μB和μNS均得到了较好的表达,而空载体pcAGEN组和阴性细胞对照组均为阴性。通过流式细胞术和Western-blot,检测转柒后Vero细胞磷酸化Akt(P-Akt)的表达量。结果显示,σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN在转染细胞4h,6h和12h后,阳性率均高于阴性对照组和pcAGEN空载体组(P<0.01),表明转染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN的Vero细胞P-Akt的表达量,明显高于阴性对照组和pcAGEN空载体组(表2)。而μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN转染细胞后,阳性率与阴性对照组和pcAGEN空载体组差异不大(P>0.05),表明P-Akt的表达量未产生明显变化。在σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN转染的不同时间里(4h,6h和12h),Vero细胞P-Akt的表达量差异不大。流式细胞术检测结果显示,转染LY294002+σA-pcAGEN和LY294002+σNS-pcAGEN的细胞,P-Akt的表达量明显少于转染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN的细胞(P<0.05),而与pcAGEN和空白细胞对照组差异不大(P>0.05),说明细胞P-Akt表达的升高,依赖于σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN对PI3K激活。结果说明,ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活PI3K/Akt信号通路,使细胞P-Akt的表达量增高。

关键词：禽呼肠孤病毒 PI3K/Akt ARV 信号通路

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多肽PrP106-126对巨噬细胞迁移效应的影响

多肽PrP106-126对巨噬细胞迁移效应的影响

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：周海云周向梅尹晓敏张仲秋赵德明中国农业大学国家动物传染性海绵状脑病实验室中国动物疫病预防控制中心

本文采用趋化试验的方法,将PrP106-126倍比稀释作用于巨噬细胞,计算趋化指数来研究PrP106-126对巨噬细胞的趋化活性,确定PrP106-126对巨噬细胞的最佳趋化浓度.结果发现PrP106-126对巨噬细胞有明显的趋化作用,趋化浓度在160ng/mL～640ng... 详细信息

本文采用趋化试验的方法,将PrP106-126倍比稀释作用于巨噬细胞,计算趋化指数来研究PrP106-126对巨噬细胞的趋化活性,确定PrP106-126对巨噬细胞的最佳趋化浓度.结果发现PrP106-126对巨噬细胞有明显的趋化作用,趋化浓度在160ng/mL～640ng/mL之间,最佳趋化浓度是640ng/mL.用不同的激酶抑制剂作用于细胞,同时与巨噬细胞趋化因子fMLP和P物质进行比较,结果表明PrP106-126作用于巨噬细胞引发多种信号转导途径,这些作用途径与P物质作用途径相似.这些研究结果揭示了异常朊蛋白在从外周向中枢传播的过程中,巨噬细胞在朊蛋白病的发病过程中具有一定作用,PrP106-126诱导巨噬细胞的信号转导路径可能与P物质相关.这为传染性海绵状脑病的发病机制研究提供了新的思路和研究数据.

关键词： PrP106-126 巨噬细胞趋化作用激酶抑制剂 P物质信号转导

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