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中山病病毒广西分离株的分离鉴定及基因组序列分析

中山病病毒广西分离株的分离鉴定及基因组序列分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王芳吴健敏林俊曹颖颖覃绍敏于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队广西兽医研究所

繁殖障碍性疾病是影响牛羊养殖业发展的重要传染病,其病因复杂众多,虫媒病毒是一类重要的病原。虫媒病毒经由媒介昆虫传播,可以感染多种动物和人类,对畜牧业生产和人类健康构成严重的威胁,同时导致动物的出口贸易受到限制。引起牛羊繁... 详细信息

繁殖障碍性疾病是影响牛羊养殖业发展的重要传染病,其病因复杂众多,虫媒病毒是一类重要的病原。虫媒病毒经由媒介昆虫传播,可以感染多种动物和人类,对畜牧业生产和人类健康构成严重的威胁,同时导致动物的出口贸易受到限制。引起牛羊繁殖障碍的虫媒病毒病主要有阿卡斑病、中山病和茨城病。中山病(Chuzan disease)又称牛异常分娩病,是由中山病病毒(Chuzan virus,CHUV)引起的牛异常分娩病毒性传染病。CHUV是呼肠孤病毒科环状病毒属Palyam病毒群的成员。成年牛呈隐性感染,不表现任何临诊症状。妊娠母牛受到感染后,产出积水性无脑和脑发育不良的犊牛。主要临床表现为流产、早产、死产或畸形产。异常分娩的犊牛少数病例出现头顶部稍微突起,但体形和关节不见异常,多数表现为哺乳能力丧失(人工帮助也能吸孔)、失明和神经症状。该病是OIE于20世纪90年代规定的B类传染病,主要分布在日本、韩国和澳大利亚。在我国,这是中山病病毒的分离鉴定的首次报告。根据虫媒分布特点,虫媒病毒病的流行具有一定的周期性和地方流行性。因此,为了解我国虫媒病毒病流行情况,我们在广西马山县设立监控点,筛选血清学阴性的5只羊和10头牛建立哨兵动物群,每周采集全血、抗凝血并收集虫媒。对抗凝血样品进行病毒分离,目前已经分离获得蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血热病毒(epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)和CHUV。其中CHUV病毒是我国首次获得分离,将其命名为GX871。对GX871株进行全基因组序列测定,结果显示,基因组全长18915bp,分10个节段:S1(3930bp)、S2(3055bp)、S3(2774bp)、S4(1967bp)、S5(1764bp)、S6(1610bp)、S7(1151bp)、S8(1059bp)和S10(728bp),分别编码VP1、VP2、VP3、VP4、NS1、VP5、VP7、NS2、VP6和NS3/NS3a蛋白。对结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7的进化分析显示,与日本CHUV参考毒株K-47的核苷酸同源性分别为98.1%、97.2%、96.0%、96.6%,氨基酸同源性分别为99.0%、99.9%、99.6%、100%,与已发表的日本毒株在均同一分支。与其他毒株的序列比对发现,S1基因节段有碱基缺失和插入,导致5个氨基酸移码,S5基因节段的非编码区也出现碱基缺失和插入。以上结果表明,CHUV广西分离株GX871可能来源于日本,但编码结构蛋白S1的基因和编码非结构蛋白S5的基因存在独特的变异,说明该病毒在我国已发生长时间的演化。该毒株的致病性及其毒力,有待进一步的研究。

关键词：中山病基因组序列分析分离鉴定分离株

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禽戊型肝炎病毒类病毒样颗粒的表达及鉴定

禽戊型肝炎病毒类病毒样颗粒的表达及鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王鑫杰赵钦孙亚妮刘宝元陈宜阳党露李慧霞周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

2001年禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）被首次从患有肝炎脾大综合症的病鸡中分离获得,其主要导致鸡大肝大脾病或肝炎脾大综合征,引起鸡死淘率升高和产蛋量下降。禽HEV感染给养禽业造成严重经济损失,而且可能具有公共卫生学意... 详细信息

2001年禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）被首次从患有肝炎脾大综合症的病鸡中分离获得,其主要导致鸡大肝大脾病或肝炎脾大综合征,引起鸡死淘率升高和产蛋量下降。禽HEV感染给养禽业造成严重经济损失,而且可能具有公共卫生学意义。禽HEV不稳定易降解,很难从载毒样品中分离得到,而且迄今为止也仍没有高效的体外细胞培养体系,这在一定程度上阻碍了对其抗原性、致病性及传染性等相关研究。禽HEV与人、猪HEV在抗原性和遗传性上具有一定的相关性并且禽HEV的ORF2蛋白与人和猪HEV的同源性为50%左右,据此我们假设:禽HEV的衣壳蛋白可能会像人、猪HEV的类似,通过杆状病毒表达系统表达可以自我组装成VLPs,并且VLPs能够模拟天然禽HEV颗粒的表面空间结构及病毒抗原性和对宿主细胞的吸附性等生物学活性。此外,我们前期利用生物信息学软件对国内外已在真核和原核表达系统成功获得病毒样颗粒的人源HEV毒株的氨基酸区段比对分析,发现禽HEV（CaHEV毒株）ORF2蛋白与其相对应的氨基酸区域分别为（56-554aa）和（313-549aa）,同时利用三维结构预测数据库构建两段区段三维结构模型,验证其很有可能组装形成VLPs。对于真核表达系统:我们利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen）构建获得包含上述潜在区段重组杆状病毒N55C52（56-554aa）,分别以10 MOI接毒量感染昆虫细胞系sf9和Tn5,通过SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定细胞培养上清中存在55kDa、53k)a和371kDa的单体蛋白。CsCl密度梯度离心在1.286g/cm左右存在白色条带,在Western blot检测中该条带复合物能与禽HEV单克隆抗体1B5特异性反应,说明该多聚体包含N55C52区段。而针对原核表达系统:我们利用大肠杆菌表达系统无融合标签表达p237蛋白（313-549aa）,获得34kDa左右包涵体蛋白,将该包涵体蛋白透析复性液体进行液相色谱鉴定,在分离峰中存在大于400kDa多聚体峰带,Western blot鉴定该多聚体能与禽HEV单抗1B5特异性反应,推测p237蛋白可自我组成病毒样颗粒。本课题的研究为下一步利用纳米粒度仪及透射电镜观察鉴定上述两种复合物是否为禽HEV-VLPs,进而利用病毒颗粒研究禽HEV抗原性及免疫学生物学特性提供了材料支撑。

关键词：禽戊型肝炎病毒复合物 HEV 病毒样颗粒多聚体

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Induction of sheep pulmonary adenomatosis in lambs and detection of the pathological changes

Induction of sheep pulmonary adenomatosis in lambs and detec...

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：幺宏强斯日古楞郑秉武马学恩 College of Animal Science and Medicine Inner Mongolia Agricultural University

Sheep pulmonary adenomatosis(SPA) is a naturally occurring pulmonary neoplasm of *** establish the experimental model of SPA in native lambs and to gain insight into the differences in pathogenesis between naturally occurring and experimentally induced SPA,two naturally occurring cases(Poll Dorset sheep,3-years old)found in Inner Mongolia were investigated and seven native neonatal lambs were inoculated intratracheally with pulmonary tumor *** cases were examined by X-ray of thorax and the dynamic changes of immunocytes were examined in their peripheral blood by flow ***,histological and ultrastructural pathology studies were *** results showed that the natural cases produce watery nasal fluid and the experimentally induced cases were showed the relative classical clinical signs of *** results for the number of lymphocytes in both cases presented a fluctuation under the continuous effect of *** results indicate that we had induced the SPA by experimentally in the native newborn lambs *** the changes of immunocytes of induced sheep,therefore,may play an important role in the pathogenesis of SPA.

关键词： Clinical signs Experimentally induced case Naturally occurring case Pathological changes Sheep pulmonary adenomatosis

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Alteration of cy toskeletal components in ROCK inhibition-induced human embryonic stem cell survival

Alteration of cy toskeletal components in ROCK inhibition-in...

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中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会

作者： Xiangyun Li, Guoliang Meng Shiying Liu Roman Krawetz Derrick Rancourt Department of Molecular Biology University of Calgary Faculty of Animal Science and Technology Agricultural University of Hebei

Introduction The Rho kinase(ROCK) inhibitor,Y-27632,dramatically increases the survival rate of hES cells observed during single cell passaging and freezing without negatively effecting the pluripotency or proliferation capacity of hES *** was reported that Y-27632 significantly inhibits cellular apoptosis and then increases the survival of passaged single hES ***, based upon our preliminary data,we have suggested that the positive effects of ROCK inhibition on

关键词： ECM Alteration of cy toskeletal components in ROCK inhibition-induced human embryonic stem cell survival

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福州羊传染性脓疱病毒F1L、VIR和B2L部分基因的遗传变异分析

福州羊传染性脓疱病毒F1L、VIR和B2L部分基因的遗传变异分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：林裕胜江锦秀林甦江斌胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所

前言为了确定福州地区流行的ORFV毒株是否发生变异,本研究选取2014-2015年采自福州地区具有代表性的ORFV阳性病料进行F1L、VIR和B2L部分基因的克隆测序,在此基础上进行流行毒株的基因变异和遗传进化分析,以了解福州市流行ORFV毒株基因... 详细信息

前言为了确定福州地区流行的ORFV毒株是否发生变异,本研究选取2014-2015年采自福州地区具有代表性的ORFV阳性病料进行F1L、VIR和B2L部分基因的克隆测序,在此基础上进行流行毒株的基因变异和遗传进化分析,以了解福州市流行ORFV毒株基因变异特点,为科学防控ORF提供理论依据。材料与方法（1）组织样品与毒株:2014-2015年ORFV PCR检测为阳性的病料,从中选出具有代表性的6个毒株进行研究。（2）核酸提取及PCR反应:按照DNA提取试剂盒说明书进行。PCR反应条件:95℃预变性5min;94℃变形30s-60s,50～60℃复性lmin,72℃延伸1～2min,35个循环;72℃终延伸10min,4℃保存。（3）序列测定:回收PCR产物连接pMD18-T载体中,转入DH5a菌株,重组质粒经1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,阳性质粒送至生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。（4）序列分析:使用DNASTAR软件对获得的F1L、VIR基因和B2L部分基因与参考毒株进行序列比对,分析其同源性,构建遗传进化树。结果（1）ORFV F1L基因核苷酸同源性及遗传进化树分析:通过软件分析,发现6株ORFV的F1L基因除了FJ-YT2014株是由999个碱基组成,编码333个氨基酸,其它5株均由1029个核苷酸组成,编码343个氨基酸。6株ORFV毒株之间核苷酸的相似性为97.6%00%。遗传进化树表明6株ORFV福州分离株与新疆毒株、美国毒株亲缘关系比较近,与NZ2标准株亲缘关系较远。（2）ORFVVIR基因核苷酸同源性及遗传进化树分析:通过软件分析,6株ORFV毒株之间核苷酸的相似性为97.1%8.9%。遗传进化树表明,6株ORFV福州分离株与韩国毒株、美国毒株的亲缘关系较近,与NZ2标准株亲缘关系较远。（3）ORFVB2L部分基因核苷酸同源性及遗传进化树分析:通过软件分析,6株ORFV毒株B2L基因之间核苷酸的相似性分别为96.6%9.2%。从遗传进化树可以看出6株ORFV福州分离株与新疆毒株亲缘关系比较近,与NZ2标准株亲缘关系较远。讨论本研究结果显示,F1L基因上,6株病毒中有1株F1L基因存在核苷酸的缺失,缺失片段较大,与国内新疆变异株缺失片段较为相似;B2L基因方面,6个毒株仅存在个别核苷酸的突变,表明B2L基因仍较为保守,该结果与唐娜、Keshan等对国内外毒株B2L基因进行克隆测序分析的结果较为一致;VIR基因方面,6株ORFV毒株的VIR基因与韩国、美国流行毒株的亲缘关系较近,该结果与Haibo Yang等的结果一致,暗示福州地区当前流行的毒株可能与韩国、美国地区的毒株有共同的来源。

关键词：分离株羊传染性脓疱病毒 VIR B2L F1L 核苷酸同源性变异分析

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PCV2海南株全基因组的克隆与序列分析

PCV2海南株全基因组的克隆与序列分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：曹宗喜郑心力张艳叶保国林哲敏王峰海南省农业科学院畜牧兽医研究所

前言猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）为单股负链环状无囊膜的DNA病毒,主要侵害机体的免疫系统,能造成免疫抑制,给养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2根据基因遗传距离的大小划分为3个基因型,分别为PCV2a,PCV2b,PCV2c。... 详细信息

前言猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）为单股负链环状无囊膜的DNA病毒,主要侵害机体的免疫系统,能造成免疫抑制,给养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2根据基因遗传距离的大小划分为3个基因型,分别为PCV2a,PCV2b,PCV2c。根为了研究猪圆环病毒2型海南株的分子特征,本试验克隆了8株PCV2海南株的全基因组并进行序列测定,分析了当前PCV2海南株的生物信息学特征,丰富了我国PCV2分子流行病学资料。材料与方法收集疑似PCV2样品,采用PCR方法扩增基因并进行序列分析。引物参照何逸民等。结果与讨论为了解不同地域PCV2毒株基因组之间的亲缘关系,利用MEGA5.1软件绘制了PCV2全基因组进化树。结果表明,本研究的8个毒株中,有7株属于PCV2b-1C亚型,1株属于PCV2b-1A/1B亚型,均属于PCV2b型。序列分析结果表明,PCV2海南株的ORF2基因的长度均为705 bp,编码234个氨基酸。8个PCV2海南株的ORF2基因之间核苷酸序列相似性及推导的氨基酸序列相似性分别为95.3%9.7%和93.696～100%。海南株与国内分离株（AY682994,AF381175,JX945577,JX682407,AY180397）的核苷酸序列相似性为91.0%9.9%,推导的氨基酸相似性为91.0%9.6%。海南株与疫苗株SH的核苷酸序列相似性为98.2%00%,推导的氨基酸相似性为94.9%00%。海南株与疫苗株LG的核苷酸序列相似性为90.6%1.7%,推导的氨基酸相似性为89.7%1.0%。这些数据为我省PCV2疫苗株的选择提供了理论依据。在Cap蛋白的B细胞表位区A（47-63）、B（65-87）、C（113-139）、D（165-200）和E（C端最后4个氨基酸）中,8株PCV2 ORF2编码的氨基酸序列发生一定变化:53 F→I、68A→N、134T→N。对Cap蛋白的T细胞表位F（61-160）、G（210-230）进行分析,发现68 A→N、134 T→N。对Cap蛋白核定位信号区（N端41个氨基酸）进行氨基酸变异分析,结果发现HN8的第30（V→L）位氨基酸发生了变化;对Cap蛋白的唯一糖基化位点（第143-145位氨基酸）进行氨基酸分析,发现该糖基化位点（NYS）未发生变化。在Cap蛋白的其他区域,其氨基酸序列基本没有变化,序列相对保守,仅个别毒株发生单个氨基酸的变化,如154 E→P、176 P→L、206 I→K。这些位点的变化对致病力的影响还有待进一步研究。结论目前我省流行的PCV2以PCV2b-1C亚型为主,流行株与疫苗株SH的相似性较高,为我省PCV2疫苗株的选择提供了理论依据。

关键词：克隆与序列分析疫苗株核苷酸 ORF 序列相似性全基因组

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禽戊型肝炎病毒中国分离株跨种系感染兔子致病性分析

禽戊型肝炎病毒中国分离株跨种系感染兔子致病性分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘宝元赵钦孙亚妮陈宜阳李慧霞王鑫杰周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

禽、人和猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)同属于戊型肝炎病毒家族。虽然猪HEV仅引起猪的亚临床感染,但是目前越来越多的数据证实猪HEV具有人畜共感染性。而禽HEV,流行病学调查发现其感染能够导致鸡肝脾肿大和产蛋量率下降(20-40... 详细信息

禽、人和猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)同属于戊型肝炎病毒家族。虽然猪HEV仅引起猪的亚临床感染,但是目前越来越多的数据证实猪HEV具有人畜共感染性。而禽HEV,流行病学调查发现其感染能够导致鸡肝脾肿大和产蛋量率下降(20-40%),是危害养禽业尤其是蛋鸡和种禽养殖业发展的重要疾病之一。此外,禽HEV与人、猪HEV在遗传性和抗原性上具有相关性,因此禽HEV是否也像猪HEV能够感染人或其它哺乳类动物是研究的热点。最近,兔HEV的分离证明HEV感染宿主范围广泛,同时动物实验证实,猪和人HEV可以跨种系感染兔子。据此,我们推测兔子或许可以作为禽HEV跨种系研究的理想的动物模型。从某医学院实验动物中心购买6-8周龄新西兰兔16只,随机分为两组(8只/组)。其中一组每只兔子耳缘静脉注射实验室制备保存的1 rnLCaHEV悬液(GenBank accession number:GU954430;10sGE/mL);另一组注射PBS作为空白对照。攻毒后3、7、10、14、21、28、35、42、49、56、63、70和77天收集血清和粪便样品,第84天剖杀所有兔子。通过检测粪便排毒、病毒血症、血清中谷丙转氨酶(ALT)的量和抗体消长规律及观察肝脏的病理学损伤等致病性表现,分析CaHEV是否能够跨种系感染兔子。RT-PCR检测的粪便排毒结果显示在攻毒后第10天3只兔子开始排毒,其中1只兔子排毒持续到攻毒后第63天;荧光定量RT-PCR检测病毒血症结果显示在攻毒后28天所有攻毒兔子血液中病毒拷贝数达到峰值,随后开始下降;生化分析仪检测血清中ALT含量结果显示在攻毒后第14天4只兔子血清中ALT含量显著升高,随后迅速下降恢复到正常值;间接ELISA检测血清中抗禽HEV抗体结果显示3只兔子在攻毒后第14天检测到禽HEV特异性抗体,其余兔子在攻毒后第21天检测到;攻毒后第84天剖杀所有兔子,组织病理学观察结果显示所有攻毒兔子肝脏均无明显病理学损伤;通过对粪便中的病毒全基因测序结果揭示CaHEV跨种系感染兔子后,其ORF1,2和3基因均发生了部分非沉默突变,并且突变主要集中在ORF1上。对照组的所有兔子没有出现粪便排毒,病毒血症,抗体转阳,血清中ALT升高和肝脏的病理学损害。综上结果所示,CaHEV悬液耳缘静脉感染兔子后,可以成功引起兔子粪便排毒,病毒血症,血清中ALT的瞬时升高和抗体转阳的HEV感染宿主的致病表现,但其并没有引起任何的肝脏的病理学损伤。因此上述结果说明,禽HEV可以成功在兔子体内复制,但其可能仅引起亚临床感染。

关键词： HEV 中国分离株病毒血症禽戊型肝炎病毒

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猪繁殖与呼吸综合征病毒类似microRNA的病毒小RNA的预测验证及功能分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒类似microRNA的病毒小RNA的预测验证及功...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：李娜肖书奇闫云欢张冲张昂克周恩民西北农林科技大学动物医学院兽医免疫研究所农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害世界养猪业的重要病毒性传染病,其主要特征为妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍、各年龄阶段猪的呼吸道症状,对于该病迄今仍无确实有效... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害世界养猪业的重要病毒性传染病,其主要特征为妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍、各年龄阶段猪的呼吸道症状,对于该病迄今仍无确实有效的防制措施。病毒进入细胞以及复制增殖的过程,触发和调控了宿主细胞的抗病毒免疫反应等一系列相互作用。microRNA是一类小的单链非编码RNA,其在病毒与宿主的相互作用中发挥着极其重要的转录后调控作用。一方面,病毒感染能够导致宿主编码的microRNA表达水平的改变,后者通过靶向病毒或者自身的基因,对病毒生命过程的诸多环节进行调控,有利于病毒的持续感染或发挥抗病毒作用。另一方面,许多病毒同样可以编码microRNA调节病毒及宿主基因的表达,在病毒感染宿主细胞的过程中发挥重要的作用。对于PRRSV病毒能否编码vsRNA/microRNA目前尚未有报道。本研究旨在探索PRRSV感染过程中是否存在PRRSV编码的vsRNA/microRNA调控自身的感染。通过生物信息学预测和实验验证,本研究首次证明了PRRSV编码类似microRNA的病毒小分子RNA（vsRNAs）,四个vsRNAs分别位于PRRSV基因组的ORF1a、ORF1b以及GP2a区域。利用茎环引物的实时定量PCR方法检测vsRNAs在PRRSV感染周期中的动态变化,发现PRRSV-vsRNA4感染期间显示较高的表达水平。利用人工合成的PRRSV-vsRNAs模拟物并构建相应的荧光素酶活性检测报告系统,检测发现PRRSV-vsRNA4能够特异性地结合到PRRSV基因组中非结构蛋白3（NSP3）区域。进一步利用PRRSV-vsRNAs的模拟物转染PRRSV易感细胞后进行病毒感染检测,通过观察细胞病变情况,流式细胞术,检测上清液中的病毒TCID,PRRSV的ORF7基因的mRNA转录水平,间接免疫荧光检测以及Western blot检测PRRSV的N蛋白的表达,从转录水平和转录后水平综合分析PRRSV-vsRNAs在PRRSV感染过程中对病毒复制及抗病毒免疫反应均存在负调控作用,转染PRRSV-vsRNA4模拟物能够显著抑制PRRSV在PAM细胞以及Marc-145细胞中的复制。研究发现并验证了PRRSV-vsRNA4能够靶向PRRSV不同毒株的Nsp3基因从而负调控PRRSV的感染进程,结果揭示了PRRSV能够利用病毒感染过程中所产生的vsRNAs调节自身基因的表达,进而调控病毒复制和增殖,这为我们深入了解PRRSV感染过程中病毒与宿主的相互作用以及PRRSV病毒的防控提供了全新的视角和策略。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒模拟物 PRRSV RNA 宿主细胞 microRNA 功能分析

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信号肽调节猪瘟病毒Erns蛋白、糖基化修饰和胞外分泌

信号肽调节猪瘟病毒Erns蛋白、糖基化修饰和胞外分泌

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：贾俊杰龚文杰蒋大良涂长春军事医学科学院军事兽医研究所湖南农业大学动物医学院

猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的以免疫抑制、高死亡率为主要特征的急性热性传染病,每年给养猪业带来巨大经济损失。CSFV囊膜蛋白E是一个高度糖基化的病毒结构蛋白,含有7个潜在的N-糖基化位点,具有RNase活... 详细信息

猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的以免疫抑制、高死亡率为主要特征的急性热性传染病,每年给养猪业带来巨大经济损失。CSFV囊膜蛋白E是一个高度糖基化的病毒结构蛋白,含有7个潜在的N-糖基化位点,具有RNase活性,能水解双链RNA,阻止其诱导产生IFN-β。E蛋白还可以分泌到细胞培养基中,抑制E蛋白的糖基化并不影响其RNase活性,但是会阻断E蛋白分泌到细胞外。在哺乳动物细胞中分泌蛋白的氨基端都有一段15-35个氨基酸的疏水性肽片段,其作用是引导后续蛋白质多肽链进入内质网腔内。在CSFV核心蛋白Core的羧基端和E蛋白之间存在一段20个氨基酸的信号肽序列,由于E蛋白在CSFV感染和致病中发挥重要作用,实验对该信号肽在E蛋白表达、糖基化修饰和胞外分泌中的作用进行了初步研究。首先克隆CSFV兔化弱毒疫苗株HCLV株E蛋白基因至含EGFP基因的pEGFP-N1质粒,再将E-EGFP基因克隆至有嘌呤霉素抗性基因的pIRES-puro3质粒中,重组质粒转染猪睾丸细胞系ST,构建了表达带有信号肽或去除信号肽的E-EGFP融合蛋白和ΔE-EGFP融合蛋白的细胞系PE-C-E和PE-C-ΔE。荧光显微镜观察发现,PE-C-E细胞荧光分布于胞质,荧光强度大,在局部聚集;而PE-C-ΔE细胞荧光分布于胞质,荧光强度微弱,分散于胞质中,结果表明信号肽调节E-EGFP融合蛋白的表达。Western Blot检测发现,PE-C-E细胞出现55KDa微弱蛋白条带(E-EGFP融合蛋白)和72KDa极强蛋白条带（糖基化的Erns-EGFP融合蛋白）,而PE-C-ΔE细胞仅出现55KDa微弱的E-EGFP融合蛋白条带。Imagej软件分析发现PE-C-E细胞中糖基化的E-EGFP融合蛋白表达量为PE-C-ΔE细胞中非糖基化E-EGFP融合蛋白的25倍,该结果进一步表明信号肽能促进E-EGFP融合蛋白的表达并介导该蛋白的糖基化修饰。利用外泌小体分离试剂盒分别提取PE-C-E和PE-C-ΔE细胞释放至培养上清中的含有E-EGFP融合蛋白的粒子,Western blot检测发现,PE-C-E细胞释放的E-EGFP融合蛋白为糖基化修饰的蛋白,除了72KDa的融合蛋白外,还有一个90KDa左右的高度糖基化融合蛋白,且主要以后者形式存在,而PE-C-ΔE细胞表达的非糖基化E-EGFP融合蛋白不能释放至培养上清中,结果表明信号肽介导的糖基化修饰决定了E-EGFP融合蛋白的胞外释放。综上所述,CSFV E蛋白信号肽正向调控该蛋白在细胞中的表达、糖基化修饰和胞外分泌,该研究发现有助于进一步解析E蛋白的生物学活性和表达调控机制,为研发抗CSFV化学药物和生物制品提供一定理论依据。

关键词：猪瘟病毒糖基化修饰 rns 信号肽胞外分泌

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兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)的研制

兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)的研制

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王芳薛家宾范志宇胡波魏后军宋艳华江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言目前,兔出血症组织灭活疫苗生产面临非免兔来源不足的问题,这严重地制约着疫苗的生产及养兔业的发展。我们通过分子生物学等技术构建了重组兔出血症病毒VP60杆状病毒(BAC-VP60株)。将该重组毒作为生产用毒种,进行了兔出血症病毒杆... 详细信息

引言目前,兔出血症组织灭活疫苗生产面临非免兔来源不足的问题,这严重地制约着疫苗的生产及养兔业的发展。我们通过分子生物学等技术构建了重组兔出血症病毒VP60杆状病毒(BAC-VP60株)。将该重组毒作为生产用毒种,进行了兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)的研制。材料与方法(1)毒种:制苗用重组兔出血症病毒VP60杆状病毒(BAC-VP60株)、检验用兔出血症病毒皖阜株由江苏省农业科学院兽医研究所构建及保存。(2)细胞:Sf9昆虫细胞由江苏省农业科学院兽医研究所保存。(3)毒种及细胞的鉴定及研究:对重组兔出血症病毒VP60杆状病毒(BAC-VP60株)、兔出血症病毒皖阜株以及生产用Sf9昆虫细胞进行传代,对它们进行全面的鉴定和研究。(4)实验室产品质量研究:实验室制备5批次疫苗,并对疫苗的安全性、免疫效力、免疫期、保存期等进行研究。(5)中试生产:按照疫苗的试行规程(草案)和质量标准,在疫苗生产企业进行中试生产。(6)临床试验:使用6批中间试制产品在6个规模化养兔场,对不同品种、不同日龄的家兔进行临床试验,通过疫苗注射后的临床观察、生产性能测定、攻毒保护等方法评估该疫苗的安全性及免疫效力。(7)新兽药注册申报:整理以上试验结果,撰写并递交兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)新兽药注册申请材料。结果与讨论(1)毒种及细胞的鉴定及研究:结果显示,疫苗毒传代稳定、免疫原性良好;检验用毒种传代、毒力均稳定;生产用Sf9细胞传代稳定、无致瘤性。(2)实验室产品质量研究:结果显示,实验室产品对所有品种的家兔均安全;疫苗具有较好的免疫效力,免疫期可达7个月;产品在2～8℃保存,保存期至少为24个月。(3)中试生产:在疫苗生产企业进行中试生产,连续生产10批,共计约110万头份。(4)临床试验:结果显示,该产品对不同品种、不同日龄的家兔均安全;试验期间,将家兔取回实验室进行攻毒。结果显示,疫苗免疫7个月后,免疫家兔能抵抗强毒的攻击,达到100%的保护,对照兔至少死亡4只。(5)新兽药注册申报:递交兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)新兽药注册申请材料。目前,该疫苗已通过初审。结论兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60株)安全性好、免疫效力确实。由于采用细胞培养的方式获得抗原,生物安全性比组织灭活苗好,同时有利于规模化生产,产品质量易于控制。

关键词：杆状病毒载体兔出血症病毒灭活疫苗 BAC-VP60

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