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鸭呼肠孤病毒单克隆抗体的制备及鉴定

鸭呼肠孤病毒单克隆抗体的制备及鉴定

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：曹艳欣章丽娇李占鸿张清水安娜苏敬良中国农业大学动物医学院

引言 2006年,在我国许多地区的北京鸭发生以脾脏坏死为特征的雏鸭呼肠孤病毒感染,并引起雏鸭不同程度发病和死亡。目前该病在我国大部分地区均有发生,给养鸭业造成了严重的经济损失。现阶段,对于该病的诊断主要依据临床剖检、病毒分离... 详细信息

引言 2006年,在我国许多地区的北京鸭发生以脾脏坏死为特征的雏鸭呼肠孤病毒感染,并引起雏鸭不同程度发病和死亡。目前该病在我国大部分地区均有发生,给养鸭业造成了严重的经济损失。现阶段,对于该病的诊断主要依据临床剖检、病毒分离和病毒基因的检测,缺乏较为稳定和简便的免疫学检测方法。本研应用鸭呼肠孤病毒作为免疫原免疫小鼠,成功制备和获得能稳定分泌抗鸭呼肠孤病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,并以此单抗为基础建立了单抗阻断ELISA方法用于血清抗体的的检测,为鸭呼肠孤病毒的血清流行病学调查以及疫苗的评价奠定基础。材料与方法小鼠免疫及杂交瘤细胞的制备用本实验室分离到的鸭呼肠孤病毒感染鸭胚成纤维细胞,收集感染细胞经经高速离心和超速离心浓缩后制备病毒抗原免疫BALB/c小鼠,三次免疫后,利用间接ELISA检测小鼠血清的抗体水平,当抗体水平达到1:10000以上时,进行加强免疫,3天后,取小鼠脾脏,将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA和间接免疫荧光筛选阳性克隆,进行三次亚克,获得能稳定分泌抗鸭呼肠孤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体的制备及鉴定按常规方法将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔,然后进行腹水的收集和纯化。通过间接ELISA方法与噬斑减数中和试验测定腹水的效价。用间接免疫荧光、免疫组化、Western Blot对单克隆抗体的特异性进行鉴定,并利用Southernbiotech鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒进行抗体亚类分析。结果与讨论本研究筛选出1株能够稳定分泌抗鸭呼肠孤病毒的杂交瘤细胞,并命名为2F4,细胞上清的效价分别为1:3.2×103,腹水的效价分别为1:3.2×105,经硫酸铵法纯化后效价为1:1.6×105。经中和试验测定其不具有中和鸭呼肠孤病毒的活性。用Southernbiotech鼠单抗亚类分型试剂盒鉴定此株单抗为IgG2a亚型,轻链为Kappa链。免疫组化检测和间接免疫荧光试验表明,此株单抗可与胞浆内病毒结合,产生绿色的特异性荧光。与禽呼肠孤病毒S1133无交叉反应。经Western Blot鉴定,此单抗与34Kd左右的病毒蛋白反应。根据病毒编码蛋白的大小推测为病毒对δC蛋白。利用表达质粒pET-32a作为载体表达表达病毒δC蛋白并进行Western Blot鉴定结果进一步表明此株单抗是针对鸭呼肠孤病毒的δC蛋白。以此单抗为基础初步建立阻断ELISA结果表明,该方法可用于鸭血清呼肠孤病毒抗体的检测,检测条件的优化正在进行中。结论本研究利用鸭呼肠孤病毒全病毒作为免疫原,采用间接ELISA和免疫荧光染色方法进行筛选获得1株能稳定分泌抗鸭呼肠孤病毒δC蛋白特异性抗体杂交瘤细胞。该单抗可用于病毒抗原的免疫组化检测,并可以此为基础建立阻断ELISA用于血清抗体的检测。

关键词：鸭呼肠孤病毒免疫原杂交瘤细胞单克隆抗体

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坦布苏病毒对鸭的致病性和传播特性研究

坦布苏病毒对鸭的致病性和传播特性研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：刘青涛李银赵冬敏刘宇卓黄欣梅杨婧韩凯凯安凤娇江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

2010年春季,在我国东部省份主要养鸭地区的鸭群中暴发了由坦布苏病毒（Tembusu Virus,TMUV）引起的疫情,主要表现为种鸭、蛋鸭采食量和产蛋率迅速下降,肉鸭拉稀、神经症状和死亡,此次疫情一直持续到2010年冬季。此后,在江苏、山东、河... 详细信息

2010年春季,在我国东部省份主要养鸭地区的鸭群中暴发了由坦布苏病毒（Tembusu Virus,TMUV）引起的疫情,主要表现为种鸭、蛋鸭采食量和产蛋率迅速下降,肉鸭拉稀、神经症状和死亡,此次疫情一直持续到2010年冬季。此后,在江苏、山东、河南等地多次出现鸭坦布苏病毒病的流行,目前该病仍在不断发生,给我国养鸭业造成了巨大经济损失。据不完全统计,鸭坦布苏病毒病仅2010年造成的经济损失就达数十亿元。但是TMUV对鸭的致病机理和传播特性仍不清楚。为此,我们以21日龄樱桃谷鸭为动物模型,对TMUV（JS804株）的致病性和传播特性进行了研究。结果显示,通过滴鼻途经攻毒(10ELD/只),病毒JS804可以引起鸭的发病;攻毒后第3天攻毒鸭均表现出采食下降,拉绿色水样粪便和精神不振等症状;随着时间的推移,有些攻毒鸭还表现出步态不稳和鼻液增多等症状;而在攻毒后第9天发病鸭逐渐恢复正常,但是偶尔还会出现拉绿色稀粪的症状。此外,体重称量的结果显示,JS804攻毒组鸭的体重增长明显慢于对照组。增殖能力和炎性细胞因子的荧光定量RT-PCR测定结果显示,病毒JS804可以在鸭的心、肝、脾、肺、肾、脑内进行增殖,并且在心、脾、肺内的增殖能力要高于其它脏器;另外,对口腔拭子和泄殖腔拭子的测定结果显示,在攻毒后的第1天攻毒鸭就可以通过其口腔和泄殖腔向外排毒,并且至少可以持续1个月;而细胞因子的测定结果显示,在攻毒后的第3天和第5天病毒JS804可以引起鸭肺、脾、脑内的促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8的过度应答;此外,病毒JS804在鸭肺、脑内同时也诱发了抑炎性细胞因子IL-10的过度应答,而脾内的IL-10仅仅在攻毒后第3天出现了上调表达,在攻毒后第5天又恢复至正常水平。鉴于TMUV在鸭群中的快速传播特性,我们对病毒JS804的传播途径也进行了研究。结果显示,病毒JS804可以在鸭之间进行直接触传播,这与先前的研究结果一致;此外,除了直接接触传播外病毒JS804还可以在鸭之间进行有效的粪-口传播和空气传播。因此,虽然基因系统进化树的分析结果将TMUV归属于蚊媒传播黄病毒,蚊媒传播也被认为是TMUV的一个主要传播途径,但是我们不应该忽视其它传播途径特别是粪-口途径和空气传播途径在该病毒传播过程中的作用,因为这可能与该病毒的快速传播和秋冬季节的流行有关。

关键词：坦布苏病毒测定结果鸭坦布苏病毒病传播特性

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牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗在动物体内抗体消长规律的研究

牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗在动物体内抗体消长规律的研究

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：索朗斯珠旦巴次仁曾群辉查果朱国玉西藏农牧学院动物科技学院

研究牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗对牦牛的免疫原性,将24头试验牦牛随机分成3组,1组牦牛接种批号"200501"疫苗,2组牦牛接种批号"200502"疫苗,3组牦牛接种批号"200503"疫苗。每批疫苗按接种方法又分为两组,... 详细信息

研究牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗对牦牛的免疫原性,将24头试验牦牛随机分成3组,1组牦牛接种批号"200501"疫苗,2组牦牛接种批号"200502"疫苗,3组牦牛接种批号"200503"疫苗。每批疫苗按接种方法又分为两组,1组在每头牦牛颈部皮下初次免疫接种1mL,14日时再次免疫接种疫苗2mL。2组在每头牦牛颈部皮下免疫接种1mL,不进行二次免疫。疫苗接种前、接种后和再次接种疫苗后3、6、9、12个月分别在试验和对照牦牛耳静脉采血,分离血清,采用微量凝集试验,测定疫苗在牦牛体内的抗体效价,观察免疫牦牛血清中抗体效价持续时间和规律;其结果是再次免疫组牦牛免疫至12个月,抗体效价为2.408～3.010,抗体效价仍然很高,牦牛体内抗体水平下降速度较慢。牦牛对大肠埃希氏菌病灭活疫苗的免疫持续期可达12个月以上。而一次免疫组抗体效价有所下降,到12个月时效价很低;牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗对牦牛的免疫原性确实,为制定科学的免疫程序提供理论基础。

关键词：牦牛大肠埃希氏菌病灭活疫苗免疫抗体消长规律

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猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的发生、检测与免疫

猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的发生、检测与免疫

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：冯志新白昀牛青青王丽马庆红韦艳娜熊祺琰刘茂军邵国青江苏省农业科学院兽医研究所

目的创制一种气溶胶形态的猪支原体肺炎新型活疫苗及雾化免疫新方法,为实现猪支原体肺炎以及其它猪呼吸道疫病的自动、高效免疫防控提供新方法与借鉴。材料与方法以猪支原体肺炎活疫苗（168株）为研究模型,根据水力式、吹气式、离心式... 详细信息

目的创制一种气溶胶形态的猪支原体肺炎新型活疫苗及雾化免疫新方法,为实现猪支原体肺炎以及其它猪呼吸道疫病的自动、高效免疫防控提供新方法与借鉴。材料与方法以猪支原体肺炎活疫苗（168株）为研究模型,根据水力式、吹气式、离心式、超声波法等不同雾化方法与原理,设计气溶胶疫苗发生设施。对疫苗株进行荧光标记后,采用激光粒度仪与激光共聚焦显微镜对产生的气溶胶疫苗分别进行空气动力学粒径检测及形态学观察。通过比选5种不同系列,共12种疫苗稀释液配方对猪肺炎支原体168株的耐雾化能力,选择最佳雾化疫苗稀释液,保证气溶胶疫苗的有效活性。将制备成功的猪支原体肺炎气溶胶活疫苗通过雾化方式免疫7-15日龄试验猪,采用定量PCR方法动态监测免疫猪肺泡灌洗液（BALF）中疫苗株的存留时间与剂量;用ELISA方法和流式细胞仪分别检测免疫猪呼吸道局部特异性sIgA抗体分泌规律与外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+细胞数量与比值。结果与讨论根据吹气式雾化方法与原理,设计成功气液两相分离式气溶胶疫苗发生装置。产生的气溶胶疫苗平均空气动力学粒径为4.8μm,激光共聚集显微镜对疫苗气溶胶观察,选取20个视野进行统计分析,所产生的气溶胶颗粒中平均有61.32%的颗粒包含疫苗株,每个气溶胶颗粒中平均含1.68±0.87个菌体。为了保持气溶胶疫苗的活性,设计了A（去离子水溶液）、B（生理盐水溶液）、C（磷酸盐缓冲液）、D（Tris缓冲液）4种不同系列的稀释液,共12种（A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、B5、C、D1、D2）配方,经猪肺炎支原体168株在各稀释液中的耐雾化能力测试,选择B3配方为吹气式雾化疫苗的最佳稀释液,雾化疫苗损失<0.5个滴度。将制备的气溶胶疫苗通过雾化方式免疫猪肺炎支原体阴性的健康仔猪,免疫后的第1周内BALF中疫苗株数量急剧增加,但第2周即出现较快的下降,从免疫后第14天开始至试验监测期结束（免疫后56天）,BALF中疫苗株数量稳定维持在10～30～4个拷贝/mg总蛋白。免疫后第28天,免疫猪鼻腔中特异性sIgA抗体开始转阳,并持续至监测期结束。与未免疫对照组试验猪相比,免疫猪外周血淋巴细胞中CD4+细胞比例以及CD4/CD8比值显著增加。结论利用吹气式雾化原理,成功设计了气溶胶疫苗的发生设施,并制备出具备高活力,可进入猪下呼吸道的猪支原体肺炎气溶胶活疫苗。通过雾化免疫,疫苗株可在猪下呼吸道持续定植,并显著激活机体免疫功能,在呼吸道局部产生长期稳定的特异性黏膜抗体。

关键词：猪支原体肺炎呼吸道猪肺炎支原体稀释液气溶胶颗粒

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不同浓度重组鸡白细胞介素-6(rChIL-6)蛋白在鸡体内外活性研究

不同浓度重组鸡白细胞介素-6(rChIL-6)蛋白在鸡体内外活性研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：曹伟伟吴志明闫若潜赵雪丽谢彩华王淑娟马震原王东方李勤楠河南省动物疫病预防控制中心河南科技大学

引言细胞因子作为免疫佐剂可有效提增强疫苗的免疫作用。IL-6是Th2型细胞,有极好的免疫增强效果,可提高体液免疫,促进抗体的分泌,研究表明人、小鼠、猪、鸡的IL-6可作为疫苗免疫佐剂有效增强疫苗的免疫反应。本文研究了重组鸡白细胞介... 详细信息

引言细胞因子作为免疫佐剂可有效提增强疫苗的免疫作用。IL-6是Th2型细胞,有极好的免疫增强效果,可提高体液免疫,促进抗体的分泌,研究表明人、小鼠、猪、鸡的IL-6可作为疫苗免疫佐剂有效增强疫苗的免疫反应。本文研究了重组鸡白细胞介素-6（rChIL-6）蛋白在SPF鸡体内外活性相关性,从而为开发以rChIL-6蛋白为主要成分的基因工程免疫增强剂研究提供科学依据。材料与方法本研究采用间接ELISA法和MTS法分别测定不同浓度的rChIL-6蛋白与抗rChIL-6单抗发生特异性免疫反应活性以及体外促鸡脾脏、外周血T淋巴细胞增殖活性;筛选出4个浓度的rChIL-6蛋白进行体内活性比较实验。将160只37日龄SPF鸡随机平均分为20组,进行以上4个浓度的rChIL-6蛋白对传染性法氏囊病毒（IBDV）灭活疫苗、活疫苗免疫增强实验研究;通过检测分析接种后不同时间实验组鸡的IBDV抗体水平、不同细胞因子（ChIL-2、ChIL-4、ChIL-6、ChIFN-α、ChIFN-γ）表达水平、脾脏和外周血T淋巴细胞增殖活性、外周血T淋巴细胞亚群含量等指标,筛选出可在鸡体内发挥好的免疫增强作用的rChIL-6蛋白最佳剂量。结果与讨论rChIL-6蛋白可与抗rChIL-6单抗发生特异性免疫反应,其蛋白相对含量约为121.57pg/mL;稀释度≤1:2的rChIL-6蛋白具有明显促鸡脾脏淋巴细胞增殖活性,其OD值极显著高于细胞对照（P<0.01）,且当稀释度为1:2～7时测定的OD值达到峰值,而稀释度≤1:2～5时,不同稀释度的rChIL-6蛋白与原液相比差异不显著（P>0.05）;相对而言,rChIL-6蛋白对鸡脾脏淋巴细胞的增殖活性显著高于外周血T淋巴细胞。与IBDV灭活疫苗、弱毒活疫苗对照组相比,7dpi5 dpi期间,筛选出4个浓度的rChIL-6蛋白（原液、1:2～3稀释、1:2～5稀释、1:2～7稀释）与IBDV灭活疫苗、弱毒活疫苗同时应用后均能显著提高IBDV抗体水平,提高ChIL-2、ChIL-4、ChIL-6、ChIFN-α和ChIFN-γ在鸡体内的表达水平,提高鸡脾脏和外周血T淋巴细胞增殖活性和CD4/CD8比值;与PBS对照组相比,不同浓度rChIL-6蛋白对照组均能显著提高鸡体ChIL-2、ChIL-4、ChIL-6的表达水平,但对ChIFN-α、ChIFN-γ表达水平无明显影响（P>0.05）;可显著提高鸡脾脏和外周血T淋巴细胞增殖活性、CD4/CD8比值;稀释度≤1:2～5的rChIL-6蛋白以上各项检测指标与原液相近,但1:2～7倍稀释的rChIL-6蛋白显著低于原液;相对而言,rChIL-6蛋白与IBDV灭活疫苗共同使用组鸡的以上各项指标优于与弱毒活疫苗组共同使用组鸡。本研究为后期rChIL-6蛋白作为免疫增强剂应用于生产实践奠定了基础。

关键词：弱毒活疫苗免疫增强剂灭活疫苗 rChIL-6 稀释度不同浓度白细胞介素体内外活性研究

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1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫IBD活毒疫苗效果观察

1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫IBD活毒疫苗效果观察

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：张渊魁詹先强刘玉云郦晓琼王泽霖郑鹿平福州大北农生物技术有限公司乾元浩生物股份有限公司南京厂河南农业大学禽病研究所

引言为预防鸡传染性法氏囊病通常给雏鸡免疫活毒疫苗,但活毒疫苗常受母源抗体干扰,影响病毒复制、导致免疫失败;如用毒力较强的疫苗免疫,则会引起法氏囊损伤,造成免疫抑制。本研究探讨1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫活毒疫苗后3～4周IBD... 详细信息

引言为预防鸡传染性法氏囊病通常给雏鸡免疫活毒疫苗,但活毒疫苗常受母源抗体干扰,影响病毒复制、导致免疫失败;如用毒力较强的疫苗免疫,则会引起法氏囊损伤,造成免疫抑制。本研究探讨1～10日龄SPF鸡和商品肉鸡免疫活毒疫苗后3～4周IBD的抗体水平和攻毒保护,旨在与高效法氏囊灭活联苗进行比较,为生产上准确选用疫苗提供科学依据。材料与方法试验用疫苗:IBD中等毒力NF8活苗由乾元浩生物有限公南京厂提供,批号:20140101,有效期至2015.07.08;IBD复合冻干苗(含高毒力2512株)购自梅里亚有限公司美国精选大药厂,批号:LZ097,有效期至2014.08.06。试验用鸡:1日龄SPF鸡135只,分为3大组,每大组45只;1日龄带有母源抗体的商品肉鸡135只,也分为3大组,每大组45只。上述鸡均在各隔离器中喂养,每大组再分成3个小组,各1、2小组于1、5、10日龄分别免疫NF8和2512活毒疫苗,第3小组不免疫做对照。抗体测定:免前、免后20、25天定期采血测定抗体,IBD微量中和试验按常规方法进行。攻毒试验:免疫后25天,从各免疫组和对照组取出5只扑杀检查法氏囊病变,如未见法氏囊明显病变,则进行攻毒。攻毒时免疫组各取10只,连同的对照鸡10只,经口接种IBDVBC6-85株强毒,每只0.2ml,72小时后剖杀,检查法氏囊病变,判定各组保护率。结果与讨论1、5、10日龄SPF鸡免疫NF8活毒疫苗、复合冻干苗(2512株)后IBD中和抗体上升缓慢,免后25天NF8活毒疫苗组的中和抗体依次为6.5、6.8、7.2(1og2),复合冻干苗(2512株)组的中和抗体依次为5.8、9.5、9.9(1og2),均未达到保护临界水平。因剖解检查NF8免疫组部分鸡法氏囊已偏小,复合冻干苗(2512株)免疫组全部鸡法氏囊已高度萎缩,故未再进行攻毒。1日龄有母源抗体(11.3 log2)的商品肉鸡免疫NF8活毒疫苗、复合冻干苗(2512株)后IBD中和抗体持续下降,5、10日龄商品肉鸡免疫NF8、2512活毒苗抗体先下降,而后略有上升。免疫后25天1、5、10日龄免NF8活毒疫苗组的中和抗体依次为4.6、5.7、6.5(1og2),攻毒保护为0/10、1/10、1/10;免复合冻干苗(2512株)组的抗体依次为7.0、8.0、9.3(1og2),攻毒保护为1/10、1/10、2/10(大部分囊萎缩)。未免疫对照组抗体依次为3.9、4.0、3.91og2,毒保护为0/10、0/10、0/10。结论本实验与以往的实验一样,再次证实(1)中等毒力NF8活苗,尤其是高毒力的复合冻干苗(2512株)免疫1、5、10日龄SPF鸡后,可造成鸡法氏囊的部分/全部萎缩,且抗体上升缓慢,免后25天未能达到免疫临界水平;(2)免疫有母源抗体的商品肉鸡后,因受母源抗体干扰,1日龄免疫组抗体持续下降,5、10日龄免疫组抗体先下降而后略有上升,免后25天未能达到免疫临界水平,攻毒均不能很好保护。

关键词：商品肉鸡冻干苗法氏囊病 SPF IBD 疫苗效果

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新型β-发夹肽Z-d14CFR增强小鼠乳腺炎模型中多重耐药菌的清除

新型β-发夹肽Z-d14CFR增强小鼠乳腺炎模型中多重耐药菌的清除

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中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第十六次学术研讨会

作者：王思宇王雪李淑贤刘宁单强邹云婧王九峰朱要宏中国农业大学动物医学院

引言抗生素在畜禽养殖业广泛使用所导致的超级细菌不断涌现以及动物源性食品药物残留等问题严重威胁着人类健康,给全球公共卫生安全带来了巨大的隐患。研发新型抗生素替代品,实现畜禽养殖绿色、安全、高效及可持续发展迫在眉睫。抗菌肽...

引言抗生素在畜禽养殖业广泛使用所导致的超级细菌不断涌现以及动物源性食品药物残留等问题严重威胁着人类健康,给全球公共卫生安全带来了巨大的隐患。研发新型抗生素替代品,实现畜禽养殖绿色、安全、高效及可持续发展迫在眉睫。抗菌肽具有抗菌活性广谱、

关键词：

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Solexa sequencing of novel and differentially expressed microRNAs in testicular and ovarian tissues in Holstein cattle

Solexa sequencing of novel and differentially expressed micr...

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中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会

作者： Jinming Huang Zhihua Ju Qiuling Li Changfa Wang Qinlei Hou Jianbin Li Rongling Li Minghai Hou Jifeng Zhong Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Sciences

Introduction The posttranscriptional gene regulation mediated by microRNA plays an important role in the development and function of male and female reproductive organs and germ cells in mammals[1-2], including cattle[3],although the understanding of this regulatory process is very *** number of the known cattle miRNAs is continuously increasing,but information on miRNAs from bovine reproductive organs,such as testis and ovary,remains scant.

关键词： miRNAs Solexa sequencing of novel and differentially expressed microRNAs in testicular and ovarian tissues in Holstein cattle microRNAs

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cDNA cloning and expression of the bovine Factor In the Germline alpha(FIGLA) gene in oocytes and ovarian follicles

cDNA cloning and expression of the bovine Factor In the Germ...

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中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会

作者： K.L.Yi C.J.Li H.Lei Q.L.Qin L.Chen Y.L.Sun H.H.Chen H.F.Yan D.S.Shi X.Zhou Hunan Institute of Animal and Veterinary Science College of Animal Science and Veterinary Medicine and Jilin Provincial Key Laboratory of Animal Embryo EngineeringJilin University Animal Reproduction Institute Guangxi University

The Factor In the Germline alpha(FIGLA) is a basic helix-loop-helix transcription factor that is essential for folliculogenesis and regulates expression of zona pellucida genes in mouse and human. But bovine homologue... 详细信息

关键词： cDNA cloning and expression of the bovine Factor In the Germline alpha FIGLA gene in oocytes and ovarian follicles

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丁酸钠对猪卵母细胞体外成熟及后续发育能力的影响

丁酸钠对猪卵母细胞体外成熟及后续发育能力的影响

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第五次会员代表大会暨第十六次学术研讨会

作者：刘丽梅宋光启高飞花明关继羽汤黎娜唐博李子义吉林大学畜牧兽医学院动物胚胎工程吉林省重点实验室

卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation,IVM)培养是胚胎生物工程技术的重要组成部分,是转基因动物克隆与体外授精的基础。本试验旨在探讨去乙酰基转移酶抑制剂丁酸钠在生发泡期(germinal vesicle,GV)、生发泡破裂(germinal vesicle br... 详细信息

卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation,IVM)培养是胚胎生物工程技术的重要组成部分,是转基因动物克隆与体外授精的基础。本试验旨在探讨去乙酰基转移酶抑制剂丁酸钠在生发泡期(germinal vesicle,GV)、生发泡破裂(germinal vesicle breaking down,GVBD)和第一次减数分裂,及第二次减数分裂过程中对猪卵母细胞体外成熟及其后续发育能力的影响,为胚胎生物工程中筛选较好发育潜能的卵母细胞提供依据。实验材料猪卵巢取自干长春市聚源屠宰场,在2～3小时内送回实验室,用10mL的注射器和12号针头表面穿刺抽吸卵巢上面2～6mm卵泡内的卵丘一卵母细胞复合体(COCs)。在体视显微镜下捡取具有完整卵丘细胞层和均匀细胞质的COCs,在39℃、5%CO2和最大饱和湿度的培养箱中培养44小时至成熟。随机分为六组,分别在培养开始的前2小时(第一组)、前22小时(GV期至GVBD期)(第二组)、第22至24小时(第一次减数分裂前期)(第三组)及第22至44小时(MⅠ期至MⅡ期)(第四组)及全程(第五组)添加去乙酰基酶抑制剂丁酸钠培养,对照组(第六组)为全程添加相应量的PBS,通过计数核成熟率(以卵母细胞第一极体排出为标准),间接免疫荧光染色(观察组蛋白乙酰化水平变化);实时荧光定量PCR(检测丁酸钠对母源mRNA的影响);孤雌激活与囊胚计数(考察丁酸钠处理后的卵母细胞后续发育能力)。结果显示随丁酸钠添加时间的延长,终浓度为1μM的丁酸钠对卵母细胞核成熟有明显抑制作用,第一组、第二组、第五组核成熟率分别为59.57±5.29、46.99±1.22及26.94±2.66,而在GVBD期之后短时间加入丁酸钠(第三组),对卵母细胞的核成熟则呈促进作用(81.48±0.89),与对照组(66.39±5.84)相比差异显著(P<0.05)。孤雌胚胎发育结果显示在GV期添加1μM的丁酸钠作用两小时(第一组)的卵孤雌激活后囊胚率显著高于对照组(分别为33.93±2.51及27.16±2.10,P<0.05),但囊胚细胞数无显著差别。间接免疫荧光结果提示丁酸钠能明显改变核心组蛋白的乙酰化水平,即使GV期短时间加入(第一组),且在去除丁酸钠后继续培养20小时,仍高于对照组。五种处理方式对成熟促进因子(mature promoting factor,MPF)有关的两种基因CyclinB及Cdc2的母源RNA表达均有影响,但在GV期(第一组)及GVBD时期(第二组)作用影响更大(CyclinB为1.649±0.262及4.679±0.453;Cdc2为0.425±0.058及5.796±0.578),与对照相比差异显著(P<0.05)。结论:1.在GVBD时期及全程添加丁酸钠对卵母细胞减数分裂有明显抑制作用,而GVBD期之后添加丁酸钠对卵母细胞成熟有促进作用。2.仅GV期短时间添加1μM的丁酸钠对卵母细胞的后续发育能力有促进作用。

关键词：丁酸钠卵母细胞体外成熟胚胎发育猪

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