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高邮鸭胚胎发育后期及出雏初期胸肌组织基因组DNA甲基化分析

高邮鸭胚胎发育后期及出雏初期胸肌组织基因组DNA甲基化分析

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第十六次全国畜禽遗传标记学术研讨会

作者：朱春红陶志云刘宏祥宋卫涛章双杰徐文娟李慧芳江苏省家禽科学研究所江苏扬州225125

引言DNA 甲基化是基因组DNA 的一种最重要的表观遗传修饰方式，在高等动植物中普遍存在。本研究中，采用methyIC-seq 测序方法结合生物信息学分析技术，分析中国地方品种鸭——高邮鸭胸肌组织基因组DNA 甲基化，阐述DNA 甲基化对高邮鸭... 详细信息

引言DNA 甲基化是基因组DNA 的一种最重要的表观遗传修饰方式，在高等动植物中普遍存在。本研究中，采用methyIC-seq 测序方法结合生物信息学分析技术，分析中国地方品种鸭——高邮鸭胸肌组织基因组DNA 甲基化，阐述DNA 甲基化对高邮鸭胚胎发育后期、出雏初期胸肌发育的调控作用。

关键词：高邮鸭 methyIC-seq DNA甲基化胸肌发育

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樱桃谷种鸭鸭1型甲肝病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

樱桃谷种鸭鸭1型甲肝病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：陈红梅陈珍程龙飞傅光华施少华万春和傅秋玲黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心

前言鸭病毒性肝炎主要是由鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus,irus,DHAV）引起的一种急性、高度致死性传染病。DHAV主要从雏鸭中分离,而从种鸭中分离的较为少见。2014年1月,从某樱桃谷种鸭场的465日龄病死樱桃谷种鸭中分离到一株病毒... 详细信息

前言鸭病毒性肝炎主要是由鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus,irus,DHAV）引起的一种急性、高度致死性传染病。DHAV主要从雏鸭中分离,而从种鸭中分离的较为少见。2014年1月,从某樱桃谷种鸭场的465日龄病死樱桃谷种鸭中分离到一株病毒（命名为HeN1403）,经过RT-PCR检测与遗传进化分析,确定该分离毒株为鸭1型甲肝病毒。材料与方法（1）主要试剂（略）。（2）试验胚与试验动物（略）。（3）临床样品的采集、处理和病毒的分离（略）。（4）尿囊液毒的PCR检测（略）。（5）衣壳蛋白基因的克隆与序列分析（略）。（6）雏番鸭人工感染试验（略）。结果与讨论（1）病毒的分离:无菌条件下收集死亡番鸭胚的尿囊液毒（暂定名为HeN1403）。血凝试验结果显示,三代HeN1403株病毒都不凝集鸡的红细胞和鸭（番鸭）的红细胞,可排除有血凝活性的病毒。（2）分离毒株的PCR鉴定:PCR检测结果显示,扩增到鸭甲肝病毒约200bp的片段,即为DHAV阳性,其余病毒检测为阴性。将测序结果至Genbank中比对后,得出该序列与DHAV-1的同源性最高。（3）衣壳蛋白基因的序列测定与分析:通过衣壳蛋白基因特异性引物扩增得到700 bp左右的条带,测序结果得知,HeN1403株衣壳蛋白基因序列为714 bp,编码238个氨基酸。使用Lasergene V 7.1 DNAStar软件对HeN1403株病毒VP1基因序列与GenBank上发表的12株不同基因型DHAV的VP1基因序列进行核苷酸序列的同源性比对。结果表明,HeN1403株病毒的VP1基因核苷酸序列与DHAV-1的同源型很高,为90.7%7.2%,而与DHAV-2和DHAV-3的同源性很低,仅为64.9%6.5%;从遗传进化图上可清楚地看到两大分支,其中DHAV-1毒株形成一大分支,DHAV-2与DHAV-3各自独立联合形成另一支,显然地,HeN1403株病毒与DHAV-1的遗传关系很近,而与DHAV-2与DHAV-3遗传关系较远,由此可进一步推断出:所分离的HeN1403株为DHAV-1。（4）雏番鸭人工感染试验结果:经过两周的观察,试验组共死亡5只番鸭,死亡率为33.3%,而对照组雏番鸭均健康。采集病死鸭的肝脏,接种10日龄番鸭胚,回收到病毒,经鸭1型甲肝病毒特异性引物扩增能检测到目的条带。可见HeN1403分离分离株为鸭1型甲肝病毒。讨论众所周知,鸭1型甲肝病毒主要侵害3周龄以内的雏鸭,尤其是一周龄内的雏鸭,成年鸭可感染但不发病。2014年1月,从某樱桃谷鸭场的病死樱桃谷种鸭中分离得到1株病毒,经过RT-PCR检测方法鉴定为鸭1型甲肝病毒。通过动物的回归试验,雏番鸭的死亡率为33.3%并能重新从死亡的雏鸭肝脏分离到该病毒,动物试验表明分离株对雏番鸭具有一定的致病性。鸭甲肝病毒有三种功能性结构蛋白,分别是VP0、VP1和VP3,其中VP1蛋白位于病毒衣壳表面,编码主要的抗原位点,是个高度可变的区域,因此扩增与分析VP1基因对于DHAV的遗传变异研究提供了理论基础。经过对HeN1403株的VP1基因序列与GenBank上发表的12株不同基因型DHAV的VP1基因序列进行核苷酸序列的同源性比对,结果表明,HeN1403株病毒的VP1基因核苷酸序列与DHAV-1的同源型最高,由此可证明HeN1403分离株属于鸭1型甲肝病毒。

关键词：樱桃谷种鸭核苷酸序列人工感染试验雏番鸭 VP1 同源性比对甲肝病毒序列分析分离鉴定

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猪IFN-γ、IL-2及GM-CSF对猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白亚单位疫苗的免疫增强作用

猪IFN-γ、IL-2及GM-CSF对猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白亚单位疫苗...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：王一平刘丹郭龙军危艳武吴洪丽刘建波李胜斌黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

引言猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,该病原现已在世界各地广泛流行,给养猪业造成巨大经济损失。PCV2 Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能诱导产生PCV2特异性中和抗体和保护性免疫力,是研制PCV2... 详细信息

引言猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,该病原现已在世界各地广泛流行,给养猪业造成巨大经济损失。PCV2 Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能诱导产生PCV2特异性中和抗体和保护性免疫力,是研制PCV2基因工程疫苗的理想靶抗原。研究表明,IFN-γ、IL-2和GM-CSF等细胞因子佐剂对疫苗具有免疫增强作用,可显著增强疫苗的免疫保护效力。本研究采用细胞因子佐剂与PCV2-Cap蛋白组合的策略来研制预防PCV2感染的新型基因工程亚单位疫苗,目的是验证猪源IFN-γ(PoIFN-γ)、IL-2(PoIL-2)和GM-CSF(PoGM-CSF)这3种细胞因子能否增强PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫效力。方法采用杆状病毒表达系统表达PCV2-Cap蛋白、PoIFN-γPoIL-2、PoGM-CSF及这3种细胞因子与PCV2-Cap蛋白的融合蛋白Cap-PoIFN-γ、Cap-PoIL-2和Cap-PoGM-CSF,制备几种不同形式的PCV2亚单位疫苗,并经鼠体模型鉴定其免疫原性;采用IPMA和阻断ELISA方法测定免疫及攻毒后PCV2特异性抗体滴度,通过监测淋巴细胞增殖反应和细胞因子分泌水平评价细胞免疫应答;采用常规PCR检测PCV2病毒血症,并经定量PCR检测攻毒后鼠肺脏中PCV2病毒载量。结果采用杆状病毒表达系统成功地表达了PCV2-Cap蛋白、PoIFN--γ及Cap-PoIFN-γ融合蛋白,制备了3种PCV2亚单位疫苗:Cap-poIFN-γ疫苗、PCV2-Cap+PoIFN-γ疫苗及PCV2-Cap疫苗,并经鼠体试验证实,PCV2-Cap+PoIFN-γ疫苗能诱导产生更高水平的PCV2特异性IPMA抗体和中和抗体滴度,明显提高T淋巴细胞的增殖能力,并显著降低攻毒后鼠肺脏中PCV2病毒核酸载量。以杆状病毒表达系统成功地表达了PoIL-2、PoGM-CSF、Cap-PoIL-2融合蛋白及Cap-PoGM-CSF融合蛋白,制备了5种PCV2亚单位疫苗:Cap-PoIL-2疫苗、PCV2-Cap+PoIL-2疫苗、Cap-PoGM-CSF疫苗、PCV2-Cap+PoGM-CSF疫苗及PCV2-Cap疫苗,并经鼠体试验证实,PCV2-Cap+PoIL-2疫苗、Cap-PoGM-CSF疫苗和PCV2-Cap+PoGM-CSF疫苗均可明显提高T淋巴细胞的增殖能力,刺激淋巴细胞分泌更高水平的IFN-γ和IL-2,并显著降低攻毒后鼠肺脏中PCV2病毒核酸载量。结论研究表明,用PoIFN-γ与PCV2-Cap蛋白混合免疫时,PoIFN-γ能显著增强PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫保护效力,但以Cap-PoIFN-γ融合蛋白免疫时,PoIFN-γ对PCV2-Cap蛋白无免疫增强作用;用PoIL-2或PoGM-CSF与PCV2-Cap蛋白混合免疫或以Cap-PoGM-CSF融合蛋白免疫时,PoIL-2和PoGM-CSF对PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的抗体应答均无增强作用,但可促进免疫应答向Th1型免疫应答转变,从而增强疫苗的免疫保护效力,然而以Cap-PoIL-2融合蛋白免疫时,PoIL-2对PCV2-Cap蛋白无免疫增强作用。

关键词： CSF 亚单位疫苗 PCV2)Cap 猪圆环病毒免疫增强作用 IFN GM-CSF

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我国牛羊疫病防控的难点、研究现状和对策

我国牛羊疫病防控的难点、研究现状和对策

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：于力常继涛王芳姜志刚周国辉王海伟杨德成中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队

本文阐述当前我国牛羊传染病防控的难点、研究的现状、存在的问题、以及应采取的对策,内容包括重大疫病、新发疫情、人畜共患病、梭菌类疾病、呼吸/消化/繁殖系统疾病。1)口蹄疫病毒的毒力明显增强,加之O型变异株的出现,如果畜群的免疫... 详细信息

本文阐述当前我国牛羊传染病防控的难点、研究的现状、存在的问题、以及应采取的对策,内容包括重大疫病、新发疫情、人畜共患病、梭菌类疾病、呼吸/消化/繁殖系统疾病。1)口蹄疫病毒的毒力明显增强,加之O型变异株的出现,如果畜群的免疫力不坚强或者无免疫力,会导致幼畜发生轻度或高度死亡,这就对疫苗的免疫效力及其免疫覆盖率提出了更高的要求;2013年以来,A型口蹄疫在猪群中流行,不但给A型非免疫的猪群带来严重的危害,非典型感染的A型病毒潜伏在猪群中也成为牛群的持久威胁。2)新发疫情是危害我国牛羊养殖业发展的大敌,需要实时应对、即时研究、及时献策,才能化解危机:荚膜A型巴氏杆菌引起的牛纤维素性化脓性肺炎,是2008年以来对我国养牛业尤其是肉牛业危害最大的传染病,尽快将疫苗推向市场是当务之急;牛leachii支原体病主要通过污染的精液传播,用污染精液繁育的所有新生犊牛发生死亡或被淘汰,一旦发生损失巨大,有效的预防办法是检测精液控制传染源;小反刍兽疫是对养羊业危害最大的疾病,2013年传入我国大部分地区,因及时引进并使用高效的减毒活疫苗得到有效控制,未来的清除计划要求建立该减毒疫苗株与野毒株的鉴别诊断方法;2014年以来,我国许多省和周边国家发生羊痘疫情,是山羊痘减毒活疫苗的效力出现了问题还是流行毒株发生了变化,有待证实。3)牛羊来源人畜共患病的主要难题是牛羊布病和牛结核,关系到人畜健康和食品安全:近年来我国人畜的布病和结核感染呈现明显的上升趋势,已引起广泛的关注,我国和世界上控制和消灭这两种疾病的有效经验是检疫和淘汰;由于我国一些地区牛羊群的布病感染率高,采用检疫淘汰方法难以奏效,因此国家制定政策允许使用布病疫苗;存在的问题是,我国现有疫苗株均残存毒力,而且与野毒株感染的鉴别诊断也缺乏有效性,从免疫预防考虑引进更加安全有效的布病疫苗株是当前的迫切问题;实施检疫淘汰策略的关键是补贴额到位和严格执法,检疫方法的提升可缩短清群计划的时间。4)梭菌类疾病,包括牛羊肠毒血症、羔羊痢疾、羊快疫、羊猝狙、羊黑疫,是由梭状芽孢杆菌属的细菌引起的以毒血症为特征的一类传染病,发病急死亡率高、对牛羊危害严重,当前问题是疫苗的效力和质量需要改进。5)呼吸系统疾病,指牛羊呼吸道病综合征(RDC),牛RDC由BRSV、IBRV、BPIV3和几种继发性细菌感染引起,羊RDC的病原尚不明确。6)消化系统疾病,主要指G6/G10轮状病毒引起的犊牛和羔羊腹泻,已完成G6/G10基因重配二价减毒疫苗的研究,急需产业化并投放市场;犊牛腹泻的另两类主要病原是产毒素性大肠杆菌和冠状病毒,前者用抗生素可有效控制,后者对环境因素高度敏感、不常发生。7)繁殖系统疾病,指引起牛羊流产的传染病,近年来呈明显上升的趋势;除布病外,其他可能的病因包括IBRV、BVDV、几种虫媒病毒(阿卡斑病毒、中山病病毒和茨城病病毒),这些病原在我国流行广泛,与牛羊流产的因果关系尚待确定。8)未来的威胁:国外发生的疯牛病、痒病、蓝舌病8型和施马伦贝格病,一旦传入将对我国牛羊产业造成严重的损失,需严加防范并做好储备性研究。

关键词：传染病野毒株鉴别诊断疫病防控疫苗株人畜共患病现状和对策

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牛病毒性腹泻病毒石河子株的分离与基因型鉴定

牛病毒性腹泻病毒石河子株的分离与基因型鉴定

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：任艳陈创夫乔军杨霞张辉王鹏雁盛金良倪伟石河子大学动物科技学院新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室石河子大学动物科技学院石河子大学生命科学学院

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)不同的基因型在抗原性方面存在差异,使疫苗免疫难以收到预期效果。本实验对分离到的BVDV石河子株和其它石河子分离株进行基因型鉴定,通过对病毒的遗传分类研究,为该病的防治和开发... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)不同的基因型在抗原性方面存在差异,使疫苗免疫难以收到预期效果。本实验对分离到的BVDV石河子株和其它石河子分离株进行基因型鉴定,通过对病毒的遗传分类研究,为该病的防治和开发新的基因工程疫苗提供一定依据。采用免疫学实验、电镜观察、理化特性测定以及PCR技术、同源性比较等方法分离、鉴定一株BVDV石河子分离株,命名为BVDV shz132株,并应用系统发生分析方法鉴定该株与其它石河子分离株Manasi、shihezi148和Letuyi株的基因型。将免疫学鉴定为阳性的样品进行病毒分离,电镜观察分离的BVDV shz132株病毒直径为40nm-60nm,为有囊膜的球形颗粒。理化鉴定结果与参考株BVDV Oregon C24V一致。根据BVDV基因组5′-UTR基因设计引物在发病牛淋巴结、肠道分泌物制备的悬液及其分离的病毒细胞培养物中均扩增得到了大小为267bp的片段。核苷酸同源性分析结果表明BVDV shz132株与BVDV Osloss株的同源性最高(97.5%),BVDV Manasi株等与BVDV NADL株的同源性最高(97.8%);系统发生分析表明上述所有石河子分离株均属于BVDV-Ⅰ型。

关键词：牛病毒性腹泻病毒分离基因型鉴定

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上海地区规模化猪场中多种病毒和细菌感染状况的调查研究

上海地区规模化猪场中多种病毒和细菌感染状况的调查研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：石坤魏建超黎倩倩吴亚玲李伦峰邵东华邱亚峰马志永中国农业科学院上海兽医研究所

前言由于当前猪场存在多种病毒和细菌感染的情况,给养猪产业带来巨大经济损失。为了了解目前上海地区猪场疫病混合感染情况,我们从2014年6月到2015年1月期间,分别从上海浦东、闵行、嘉定、奉贤的所有规模化中对有呼吸症状的临床发病猪... 详细信息

前言由于当前猪场存在多种病毒和细菌感染的情况,给养猪产业带来巨大经济损失。为了了解目前上海地区猪场疫病混合感染情况,我们从2014年6月到2015年1月期间,分别从上海浦东、闵行、嘉定、奉贤的所有规模化中对有呼吸症状的临床发病猪进行采样。通过PCR方法检测手段,分别对圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)进行检测,同时进行细菌分离。材料与方法(1)病料处理:分别取有呼吸症状的发病猪的心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结以及肺门淋巴结,进行研磨破碎组织,反复冻融3次后贮存于-70℃。(2)引物设计:参考GenBank中已发表的基因序列,分别设计PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、PPV,这5种待检病毒的特异性引物。PCV2的特异性引物,扩增片段为1154bp;PRRSV的特异性引物扩增片段为677bp;CSFV的特异性引物扩增片段为800bp;PRV的特异性引物扩增片段为348bp;PPV的特异性引物扩增片段为472bp。引物均由上海桑尼有限公司合成。(3)病毒DNA/RNA提取:依据TaKaRa DNA MiniBEST viral RNA/DNA extraction Kit的操作说明从反复冻融3次的病料中提取病毒的DNA和RNA混合物,最后保存于-70℃。(4)RNA反转录:取1μg病毒的DNA和RNA混合物为模板,依次加入1μL 100pmol/μL 6 bp随机引物、0.5μL Oligo dT寡聚核苷酸、4μL 2.5 mmol/L dNTPs、4μL 5×First buffer、2μL 0.1mol/L DTT、1μL RNA酶抑制剂、1μLM-MLV,加DEPC水至20μL。离心后反应程序按照25℃10 min、37℃60 min、75℃15min、4℃10min进行反应。(5)PCR反应:取2μL病毒DNA和RNA的混合物为模板,分别用PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、PPV,这5种待检病毒的特异性引物进行PCR扩增,反应体系为引物各0.5μL,10×buffer 5μL,10 mmol/L dNTP 1μL,Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),加超纯水至总体积50μL。反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度依次为58℃/55℃/55℃/57℃/48℃,退火40s,72℃延伸60 s,35个循环;然后72℃再延伸7min,10℃保存。取5μLPCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。结果与讨论本次实验结果显示没有阴组织性样品,但是没有检测到CSFV、PRV。PCV2感染阳性率为64%,PPV感染阳性率为76%,PRRSV阳性率为48%,并发现所有感染PCV2的组织同时也感染PPV,感染PRRSV的组织同时感染PCV2和PPV。同时对这些收集到的病料中通过细菌分离发现化脓链球菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等细菌与这些病毒共存。通过此次实验结果发现当前猪场多种病毒共感染情况严重,同时存在病毒与细菌共感染的状况。我们这次实验选取的猪均有呼吸症状推测可能感染了能引起此症状的病毒和细菌,结果也证明了这一点。PCV2和PRRSV均能引起猪的呼吸系统疾病,副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等细菌会加重肺炎的症状。PCV2是一种猪场常在病毒,虽然上海地区的猪场均有使用PCV2的疫苗,但是PCV2的基因型变异快,不能得到有效的保护,并且PCV2具有免疫抑制,为其他病毒和细菌的入侵提供了便利条件。结论本次调查研究发现上海地区规模化猪场中存在PCV2、PPV和PRRSV共感染现象同时继发了多种细菌感染。

关键词： PRRSV PPV PCV 细菌分离副猪嗜血杆菌 PRV 细菌感染

来源：评论

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伪狂犬病病毒(PRV)UL42蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

伪狂犬病病毒(PRV)UL42蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：杜文娟王一平黄立平危艳武陈冬杰孙建慧吴洪丽冯力刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

引言伪狂犬病病毒（PRV）是引起伪狂犬病的主要病原。伪狂犬病广泛存在于世界范围内的猪场中,给养猪业造成巨大的经济损失,不同年龄段的感染猪临床症状不同。PRV UL42蛋白,又被称为DNA的辅助性亚基,由PRV的UL42基因编码,在RRV的复制过... 详细信息

引言伪狂犬病病毒（PRV）是引起伪狂犬病的主要病原。伪狂犬病广泛存在于世界范围内的猪场中,给养猪业造成巨大的经济损失,不同年龄段的感染猪临床症状不同。PRV UL42蛋白,又被称为DNA的辅助性亚基,由PRV的UL42基因编码,在RRV的复制过程中发挥重要的作用。关于UL42蛋白的体外作用,在1995年已经有所报道。而到目前为止,关于PRV UL42蛋白的B细胞的抗原表位仍未见有报道。在本研究中,我们制备了6株针对PRV UL42蛋白的单抗,利用这些单抗,希望能对UL42蛋白在PRV复制过程中的亚细胞定位进行描述并能从感染PRV的PK-15细胞中将UL42蛋白沉淀出来以方便研究与UL42相互作用的蛋白。从而达到利于UL42功能研究的目的。方法利用原核表达系统表达了UL42蛋白,将其免疫6周龄的BALB/c小鼠,经过细胞融合和亚克隆,成功的筛选到6株能够稳定分泌UL42抗体的杂交瘤细胞。利用这些单抗,通过Western Blotting和间接ELISA方法,鉴定出了三个不同的抗原表位。利用DNA star软件对所鉴定的三个不同的抗原表位的保守性和特异性进行分析。通过间接免疫荧光方法对UL42蛋白的亚细胞定位进行描述,利用免疫共沉淀将UL42蛋白从感染PRV的PK-15细胞中沉淀出来,利用IPMA建立了一种新的测定PRV梯度的方法。结果 SDS-PAGE和Western Blotting结果表明UL42蛋白获得了正确表达。将切胶纯化的蛋白免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,成功筛选到6株UL42的单抗。通过Western Blotting和间接ELISA方法,鉴定出了UL42蛋白的三个不同的线性抗原表位,其中SGGVLDALK位于UL42的N端,KRPAAPR和RMYTPIAAK位于UL42的C端。序列比对发现,三个抗原表位在不同的PRV毒株间具有很高的保守性,而在疱疹病毒属的其它成员所对应的部分中有较高的特异性。间接免疫荧光表明UL42蛋白在PRV的复制中定位于细胞核中。免疫共沉淀表明这些单抗能够将UL42从感染PRV的PK-15细胞中沉淀出来。所建立的检测PRV梯度的IPMA方法比传统的只观察细胞病变的方法有更高的敏感性且更容易观察。结论所鉴定的三个不同的抗原表位中,其中一个位于UL42蛋白的N端,另两个位于UL42蛋白的C端,这种现象和同属于疱疹病毒属的人的单纯疱疹病毒1型的UL42蛋白的抗原表位相似。而序列比对发现这些抗原表位在不同的PRV毒株间保守性很高,这将有利于建立以抗原表位为基础的PRV的诊断方法。这些单抗能够被应用于UL42蛋白功能的研究中,比如对UL42蛋白的核定位,发现UL42定位于细胞核中,这从侧面反映了UL42蛋白作为DNA聚合酶的辅助因子的作用。此外我们还可以利用这些单抗将UL42蛋白从感染了PRV的细胞中沉淀出来,这对于研究与UL42蛋白相互作用的蛋白打下了基础。所建立的用于测定PRV病毒梯度的IPMA方法比传统的只看细胞病变的方法具有更高的敏感性和较易观察。这些单抗在PRV UL42蛋白的功能研究中将会是非常有用的工具。

关键词： PRV)UL42 保守性抗原表位伪狂犬病病毒单克隆抗体制备

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17株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传分析

17株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：黄欣梅李银刘宇卓赵冬敏杨婧韩凯凯江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

引言禽流感（Avian Influenza,AI）是由正黏病毒科,流感病毒属的A型流感病毒引起的以禽类呼吸系统和全身败血为特征的禽类传染病。H9N2亚型禽流感病毒（AIV）虽然属于低致病性AIV,但是因为分布广泛,能造成宿主的免疫抑制,并能引起人类感... 详细信息

引言禽流感（Avian Influenza,AI）是由正黏病毒科,流感病毒属的A型流感病毒引起的以禽类呼吸系统和全身败血为特征的禽类传染病。H9N2亚型禽流感病毒（AIV）虽然属于低致病性AIV,但是因为分布广泛,能造成宿主的免疫抑制,并能引起人类感染,其危害性不容忽视。血凝素（hemagglutinin,HA）是流感病毒表面主要的囊膜糖蛋白,变异频率高,同时也是AIV抗原性、致病性的主要决定因素。本研究对江苏、安徽、浙江等地2008～2013年分离的17株H9N2亚型AIV的HA基因进行了遗传分析,从而了解各毒株间的遗传差异和变异规律,为H9N2亚型禽流感的防控提供参考依据。材料与方法（1）病毒:17株H9N2亚型AIV毒株均由本实验室于2008年至2013年间从江苏、安徽、浙江等地的家禽中分离,经鉴定为H9N2亚型。（2）引物:参考H9亚型AIV HA基因序列,设计流感病毒通用反转录引物Uni12和一对用以扩增HA全基因序列的特异性引物。（3）HA基因RT-PCR扩增及测定:按照体液病毒RNA抽提试剂盒说明书,从含病毒尿囊液中提取病毒RNA,以Unil2为反转录引物进行反转录获得cDNA,然后以此cDNA为模板进行PCR扩增。将获取的HA基因与pMD18-T载体连接并转入DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆菌送南京金斯瑞公司测序。（4）HA基因序列比较分析:应用DNAStar软件对获得的HA基因核苷酸和推导的氨基酸序列进行同源性比对,并对HA裂解位点,受体结合位点以及潜在的糖基化位点进行分析。用MEGA5.05软件进行序列比对,绘制遗传进化树。结果与讨论（1）HA基因系统进化分析:测序结果表明,17株H9N2亚型AIV的HA基因序列均长1742 bp,编码560个氨基酸。HA基因核苷酸序列同源性为84.6%9.3%,推导的氨基酸同源性为86.0%9.5%。17株分离毒株均属于欧亚分支,其中2株鸭源毒株属于G1-like亚系,其余15株鸡源病毒属于Y280-like亚系。G1-like亚系的毒株被认为可能对哺乳动物具有潜在致病性。此次从鸭体内分离到该亚系毒株,说明G1-like亚系毒株已在水禽中流行,鉴于该亚系病毒的公共卫生意义,应加强对该类病毒的监测。（2）HA蛋白氨基酸序列分析:本研究毒株中的HA裂解位点处氨基酸残基均为非连续碱性氨基酸,符合低致病性AIV的特征。对17株病毒的受体结合位点及其左右侧缘序列进行分析,发现198位氨基酸存在较大差异,受体结合部的右侧缘序列较为保守。有1株鸡源病毒和2株鸭源病毒在234位为Q,其余14株病毒均为L,表现出人流感病毒受体结合特性。在本研究中,HA蛋白的糖基化位点具有较明显的差异,7株病毒有7个糖基化位点,10株病毒有8个糖基化位点。结论本研究证实了H9N2亚型AIV在江苏、安徽、浙江等地区家禽中持续流行感染,鸭源病毒与鸡源病毒存在较大差异。本地区鸡群中的H9N2亚型AIV随着时间推移,其遗传关系与疫苗株愈来愈远,在今后的防控工作中应考虑现行流行毒株与疫苗株之间的基因差异。

关键词：禽流感病毒糖基化位点 AIV

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Seven major genomic deletions of vaccinia virus Tiantan (VTT) is sufficient to decreased Pathogenicity

Seven major genomic deletions of vaccinia virus Tiantan (VTT...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者： LI Yi-quan LI Xiao JIN Ning-yi College of Animal Science and Technology Jilin Agriculture University Institute of Veterinary Science The Academy of Military Medical Sciences

Objective Attenuated strain TTVAC7 is a multi-gene-deleted vaccinia virus Tiantan strain constructed by knocking out parts of non-essential genes related to the virulence,host range and immunomodulatory of vaccinia virus Tiantan strain（VTT）,and combining the double markers screening and exogenous selectable marker knockout *** In this study,shuttle vector plasmids pTC-EGFP,pTA35-EGFP,pTA66-EGFP,pTE-EGFP,pTB-EGFP,pTI-EGFP and pTJ-EGFP were constructed,which contained seven pairs of recombinant arms,and bound to early and late strong composed promoter pE/L,and to enhanced green fluorescent protein（EGFP） as an exogenous selectable *** cells were co-transfected/infected successively with the above plasmids and VTT or gene-deleted VTT,and homologous recombination and fluorescence plaque screening methods were used to knock out the gene fragments（TC:TC7LK2L;TA35:TA35L;TA66:TA66R;TE:TE3L;TB:TB13RB14R;TI:TI4L;TJ:TJ2R）.Cre / Loxp system was applied to knock out the exogenous selectable marker.A series of in vivo and in vitro experiments were used to detect virulence of *** Ultimately,a gene-deleted attenuated strain TTVAC7 was obtained and A series of in vivo and in vitro experiments demonstrated that not only the host range of TTVAC7 could be narrowed and its toxicity might be weakened significantly,but also its high immunogenicity was maintained at the same *** TTVAC7 shows a more excellent safety and immunogenicity than the wild virus,and a potential to be developed into a new virus vector vaccine for the prevention or treatment of diseases caused by different pathogens.

关键词： Attenuated vaccinia virus vector Virulence Immunogenicity Tian Tan strain

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Characterization of Porcine APC13:Its Interaction with Transcription Factor Sp1 and Association with Immune Traits

Characterization of Porcine APC13:Its Interaction with Trans...

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第五次会员代表大会暨第十六次学术研讨会

作者：何文波彭克美 College of Animal Science and Veterinary Medicine Huazhong Agricultural University Institute of Animal Science Chinese Academy of Agricultural Sciences

APC13,a subunit of the anaphase-promoting complex(APC),plays an important role in cell cycle. In this study,we cloned partial cDNA,intronl and 5'-flanking sequences of porcine *** partial cDNA is 290bp long and has an open reading frame of 225bp which encodes 74 putative amino *** phylogenetic tree indicated that porcine APC13 has the closer genetic relationship with infrahuman, human dog and bovine APC13 than other selected animal ***-time PCR analysis revealed that the porcine APC13 mRNA expression shows a wide distribution and expression levels varies within a small different range in detected *** one-hybrid assay revealed Sp1 maybe interact with proximal promoter and intron1 regions of porcine *** frequencies determination in different pig breeds and association study were performed on the selected InDel in *** results showed that the InDel Fnu4H1 is significantly associated with the absolute lymphocyte count(ALC) of neonate piglets at 17 day(P=0.0457),and mean corpuscular hemoglobin concentration(MCHC) of pigs at 32 days(P= 0.0455).

关键词： Porcine Anaphase-promoting complex Molecular characterization Expression pattern Yeast one-hybrid assay Polymorphism Association analysis

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