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作者

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牛卵母细胞玻璃化冷冻保存影响因素的研究

牛卵母细胞玻璃化冷冻保存影响因素的研究

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中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十四届学术研讨会

作者：谭秀文刘晓牧游伟黄金明宋思亮万发春山东省农业科学院畜牧兽医研究所山东省畜禽疾病防治与繁育重点实验室济南 250100

本研究采用毛细玻璃管法对牛卵母细胞进行玻璃化冷冻保存，解冻后再进行体外受精(IVF)和早期胚胎的体外培养(IVC)。在此技术的基础上，分别对冷冻前平衡时间、解冻处理、卵丘细胞层数以及卵母细胞所处的减数分裂阶段等影响卵母细胞冷冻... 详细信息

本研究采用毛细玻璃管法对牛卵母细胞进行玻璃化冷冻保存，解冻后再进行体外受精(IVF)和早期胚胎的体外培养(IVC)。在此技术的基础上，分别对冷冻前平衡时间、解冻处理、卵丘细胞层数以及卵母细胞所处的减数分裂阶段等影响卵母细胞冷冻保存的因素进行研究，以期筛选出适合牛卵母细胞冷冻保存的方法。结果发现，处于MⅡ期卵母细胞在10％二甲基亚砜(DMSO)+10％乙二醇(EG)液(VS1)中平衡1-3min，然后进行玻璃化冷冻保存。解冻时将卵母细胞先移入VS1液中处理15s，然后移入蔗糖稀释液中。另外发现，冷冻保存时部分卵丘细胞对卵母细胞有保护作用。而减数分裂阶段不影响解冻后卵母细胞形态正常率，但对胚胎发育率有严重影响。

关键词：卵母细胞玻璃化冷冻体外受精冷冻保存胚胎发育牛

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sFat-1基因转染猪胎儿成纤维细胞及转基因克隆胚胎的生产

sFat-1基因转染猪胎儿成纤维细胞及转基因克隆胚胎的生产

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中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十四届学术研讨会

作者：冯冲龙川刘晓周艳荣陈红星潘登科张莉李奎邓继先中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京 100193 军事医学科学院生物工程研究所北京 100071

[目的]利用体细胞核移植技术生产转sFat-1基因胚胎。[方法]脂质体介导的方法将来源于线虫***的ω-3脂肪酸去饱和酶基因即sFat-1基因转染大白猪胎儿成纤维细胞，G418筛选建立转sFat-1基因细胞系。然后以体外成熟(in vitro maturation，I... 详细信息

[目的]利用体细胞核移植技术生产转sFat-1基因胚胎。[方法]脂质体介导的方法将来源于线虫***的ω-3脂肪酸去饱和酶基因即sFat-1基因转染大白猪胎儿成纤维细胞，G418筛选建立转sFat-1基因细胞系。然后以体外成熟(in vitro maturation，IVM)的猪卵母细胞与转基因细胞构建重构胚，生产转sFat-1基因克隆胚胎。[结果]共获得48个细胞克隆，PCR和RT-PCR检测转基因阳性细胞克隆为20个，阳性率为42％。转基因克隆胚胎的卵裂率和囊胚率分别为76.7％和9.7％，与非转基因克隆胚胎的卵裂率81.6％及囊胚率9.8％相似。[结论]建立了大白猪胎儿成纤维细胞转sFat-1基因细胞系，并以该细胞系为核供体生产了转sFat-1基因克隆猪胚胎;以转基因与非转基因细胞为核供体，胚胎的囊胚率并无显著差异;利用该技术能够有效的生产转sFat-1基因克隆胚胎。

关键词：成纤维细胞体细胞核移植体外受精基因转染猪克隆胚胎

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鹅黄病毒E蛋白的克隆与原核表达

鹅黄病毒E蛋白的克隆与原核表达

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：黄欣梅李银赵冬敏刘宇卓张敬峰韩凯凯钮慧敏江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心

禽黄病毒是新发现的一种可引起家禽产蛋和采食量下降及死亡的黄病毒属病毒。本研究选取鹅黄病毒囊膜蛋白(E蛋白)基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断和可作为亚单位疫苗的重组蛋白。根据鹅黄病毒JS804株全基因序列设计... 详细信息

禽黄病毒是新发现的一种可引起家禽产蛋和采食量下降及死亡的黄病毒属病毒。本研究选取鹅黄病毒囊膜蛋白(E蛋白)基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断和可作为亚单位疫苗的重组蛋白。根据鹅黄病毒JS804株全基因序列设计了一对引物,采用RT-PCR方法扩增出了鹅黄病毒的E基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组表达质粒pET32a-E,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达。结果表明,鹅黄病毒E基因在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子量约为70kDa,主要以包涵体形式存在于菌体中。WesternBlot和间接免疫荧光试验发现,重组E蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。鹅黄病毒E蛋白的原核表达为进一步研究该蛋白功能、建立血清学检测方法及研制亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：重组蛋白原核表达全基因序列间接免疫荧光试验大肠杆菌亚单位疫苗禽黄病毒重组表达质粒包涵体黄病毒属病毒反应原性抗组氨酸抗体囊膜蛋白免疫原性重组质粒产蛋下降

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妊娠期奶山羊下丘脑GnRH和OT免疫反应双标记细胞分布

妊娠期奶山羊下丘脑GnRH和OT免疫反应双标记细胞分布

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十四次学术研讨会

作者：陈树林林磊蒋田园李颖曾明华赵慧英范光丽张艳西北农林科技大学动物科技学院西北农林科技大学动物科技学院西北农林科技大学动物科技学院西北农林科技大学动物科技学院西北农林科技大学动物科技学院西北农林科技大学动物科技学院西北农林科技大学动物科技学院西北农林科技大学动物科技学院

为了探讨妊娠期山羊下丘脑中催产素和促性腺激素释放激素在同一细胞共存,本实验采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法对催产素(OT)和促性腺激素释放激素(GnRH)免疫反应物在妊娠3 个月奶山羊下丘脑的分布进行了双重酶标记研究。... 详细信息

为了探讨妊娠期山羊下丘脑中催产素和促性腺激素释放激素在同一细胞共存,本实验采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法对催产素(OT)和促性腺激素释放激素(GnRH)免疫反应物在妊娠3 个月奶山羊下丘脑的分布进行了双重酶标记研究。结果显示:在室旁核、视上核、视前交叉上核、弓状核、下丘脑外侧区、乳头体内侧核、乳头体后核分布有GnRH-OT双标记免疫反应阳性细胞。阳性细胞的形态有圆形、卵圆形、多角形;有的阳性细胞突起明显。根据细胞中阳性物质的多少和核团中阳性细胞数量,可分为强阳性、中等阳性、弱阳性核团。提示催产素与促性腺激素释放激素在这些核团的某些细胞有共存现象, 二者在功能上可能有密切关系。

关键词：促性腺激素释放激素催产素下丘脑妊娠奶山羊免疫组化SP法

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肉鸡屠宰加工生产链中沙门氏菌污染与溯源及耐药性分析

肉鸡屠宰加工生产链中沙门氏菌污染与溯源及耐药性分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：朱恒文方艳红王元兰魏建忠刘军军占松鹤赵洪武孙裴王桂军李郁安徽农业大学动物科技学院安徽省兽医工作站

了解肉鸡屠宰加工过程中沙门氏菌的污染状况、污染源及其耐药性,为肉鸡屠宰加工厂沙门氏菌污染的有效防控及合理使用抗生素提供科学依据。分别采集三家肉鸡屠宰加工厂(FX、LA、GZ)生产链中的肉鸡胴体表面、肉鸡泄殖腔、嗉囊内容物、环... 详细信息

了解肉鸡屠宰加工过程中沙门氏菌的污染状况、污染源及其耐药性,为肉鸡屠宰加工厂沙门氏菌污染的有效防控及合理使用抗生素提供科学依据。分别采集三家肉鸡屠宰加工厂(FX、LA、GZ)生产链中的肉鸡胴体表面、肉鸡泄殖腔、嗉囊内容物、环境、设备及器具表面样品,应用常规法及PCR进行沙门氏菌分离鉴定,通过ERIC-PCR对沙门氏菌分离株进行基因分型,并采用标准K-B纸片法对分离菌株进行20种抗生素敏感试验。三家加工厂的沙门氏菌总检出率为1.78%(24/1349),FX的检出率较低(0.18%),与LA(4.49%)、GZ(2.39%)间差异极显著(P<0.01);LA肉鸡嗉囊内容物与冷却后肉鸡胴体体表检出沙门氏菌基因型一致;GZ肉鸡泄殖腔、嗉囊内容物与屠宰、煺毛及净膛后的肉鸡胴体体表、脱毛指及净膛工人手套表面检出的部分菌株基因型一致;在13株耐药沙门氏菌中,耐9种以上抗生素的占76.9%,常见的多重耐药谱为STR-DO-TC-AM-AMC-CFZ-TM。肉鸡产品是多重耐药沙门氏菌的重要载体,其宰前及煺毛、净膛与冷却过程为沙门氏菌污染的重要环节,改进传统养殖模式,提倡有机养殖有利于降低沙门氏菌耐药性的产生与发展。

关键词：肉鸡屠宰加工沙门氏菌污染与溯源耐药性

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2010-2011年华中地区猪流行性腹泻病毒流行毒遗传进化分析

2010-2011年华中地区猪流行性腹泻病毒流行毒遗传进化分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：霍金耀陈陆赵军常洪涛王新卫杨霞郑逢梅刘红英姚惠霞王川庆河南农业大学牧医工程学院

2010年,猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)再次在中国出现严重暴发。为探明该病再次流行的原因,对2010年10月至2011年12月之间收集的15份来自中国中部不同地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒... 详细信息

2010年,猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)再次在中国出现严重暴发。为探明该病再次流行的原因,对2010年10月至2011年12月之间收集的15份来自中国中部不同地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株M和ORF3基因进行RT-PCR扩增、克隆、测序及分析。序列分析显示,与参考毒株相比,15株PEDV毒株M和ORF3基因部分核苷酸及氨基酸位点发生改变。基于M和ORF3基因的遗传进化分析显示,这些流行毒株和参考株可以分为3个群(G1、G2、G3),15株中国中部毒株均属于第3群,与2007年韩国株、2007-2008年泰国株、2010年越南株及2010-2011年中国其它地区流行毒株亲缘关系密切,而与欧洲株(CV777、Brl/87)及中国现用疫苗株亲缘关系较远。另外,15株中国中部毒株与2003-2007年中国分离株(LJB-03、JS-2004-2、DX、QH、LZC)不在同一亚群,推测PEDV在近年呈现快速变异和进化的趋势,最近在华中地区广泛流行的PEDV是一个新的基因型。

关键词：猪流行性腹泻病毒分子流行病学系统进化分析 ORF3基因 M基因

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口服生长抑素基因疫苗对小鼠免疫的初报

口服生长抑素基因疫苗对小鼠免疫的初报

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十四次学术研讨会

作者：严婷杜念兴杨倩南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室

目的研究口服生长抑素(SS)基因疫苗对小鼠生长的影响以及在体内表达HBsAg/SS融合蛋白的情况。方法用生长抑素基因疫苗灌胃小鼠,用姬姆萨染色后观察细菌在体内的分布;观察体重增长情况;应用亲和免疫组化的方法(ABC法)分别显示十二指肠和... 详细信息

目的研究口服生长抑素(SS)基因疫苗对小鼠生长的影响以及在体内表达HBsAg/SS融合蛋白的情况。方法用生长抑素基因疫苗灌胃小鼠,用姬姆萨染色后观察细菌在体内的分布;观察体重增长情况;应用亲和免疫组化的方法(ABC法)分别显示十二指肠和空肠中乙肝表面抗原(HBsAg)阳性细胞和生长抑素阳性细胞的分布及数量变化。结果空肠细菌数量从免疫后16-20h达到高峰;脾脏在免疫4天后出现少量细菌。小鼠体重从首次免疫第7周起有一定增加,但两个试验组与对照组相比均不显著。首次免疫后第3周两个试验组小肠内出现HBsAg阳性细胞并维持至第7周;首次免疫后第5周和第7周两个试验组小肠内SS 阳性细胞数量比对照组极显著减少(P<0．01)。结论口服型SS基因疫苗免疫小鼠后小肠中一些细胞可表达 HBsAg/SS融合蛋白,同时SS阳性细胞数量也减少,推测该基因疫苗刺激机体表达蛋白后能产生SS抗体。

关键词：生长抑素基因疫苗 SS阳性细胞 HBsAg阳性细胞小肠

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小鼠早期胚胎发育过程中细胞凋亡及凋亡基因表达的检测

小鼠早期胚胎发育过程中细胞凋亡及凋亡基因表达的检测

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十四次学术研讨会

作者：李威王连卿苏静艳袁丽丽严云勤东北农业大学动物组织胚胎教研室东北农业大学动物组织胚胎教研室东北农业大学动物组织胚胎教研室东北农业大学动物组织胚胎教研室东北农业大学动物组织胚胎教研室

早期胚胎发育过程当中伴随着大量的发育异常的细胞,细胞凋亡是体细胞中清除发育异常细胞的重要途径之一,早期胚胎当中异常细胞的清除也是通过细胞凋亡的途径实现的。凋亡现象在早期胚胎发育过程中普遍存在,大比率的胚胎细胞凋亡势必会... 详细信息

早期胚胎发育过程当中伴随着大量的发育异常的细胞,细胞凋亡是体细胞中清除发育异常细胞的重要途径之一,早期胚胎当中异常细胞的清除也是通过细胞凋亡的途径实现的。凋亡现象在早期胚胎发育过程中普遍存在,大比率的胚胎细胞凋亡势必会对胚胎的发育能力造成影响,对小鼠早期胚胎发育过程中的凋亡基因表达研究对于揭示早期胚胎发育的机制有重大的意义。本实验在国内同类研究中率先使用彗星电泳的方法检测早期胚胎凋亡情况,结果发现早期胚胎发育过程中广泛存在凋亡现象,不同发育时期的形态正常的胚胎中也存在凋亡细胞。随着胚胎的发育, 彗星电泳阳性比率逐渐增大,并在桑椹胚期达到高峰。实验还应用巢式RT-PCR、免疫组化的方法检测了体内发育形态正常的小鼠早期胚胎当中Bcl-2家族成员Bax、Bcl-2、Bak、Bcl-xl的表达变化情况,结果发现这些基因在小鼠胚胎早期发育过程中均有表达,Bax表达量在整个过程中无明显变化,Bcl-2表达量逐渐上调,Bak、Bcl-xl的表达量则逐渐降低。

关键词：早期胚胎发育细胞凋亡彗星电泳小鼠

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H5N1亚型AIV HA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

H5N1亚型AIV HA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：庞耀珊谢芝勋谢丽基邓显文谢志勤刘加波谢体三广西壮族自治区兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室南宁市蓝光生物技术有限公司

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码... 详细信息

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1 mmol/L IPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1 kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。

关键词：禽流感病毒(AIV) H5N1亚型抗原表位表达

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牛支原体、巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌多重PCR快速检测方法的建立

牛支原体、巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌多重PCR快速检测方法的建立

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：肖淦文陈颖钰彭清洁胡长敏崔朋巴晓亮陈焕春郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院华中农业大学动物科技学院武汉科前动物生物制品有限公司

本实验旨在建立一种多重PCR方法,用于同时鉴别牛支原体和两种常见混合感染菌。分别针对多杀性巴氏杆菌A型特异的hyaC-hyaD基因区段、化脓隐秘杆菌的16S rRNA基因上保守区段和牛支原体的UvrC基因设计特异性引物,多重PCR的最佳扩增条件确... 详细信息

本实验旨在建立一种多重PCR方法,用于同时鉴别牛支原体和两种常见混合感染菌。分别针对多杀性巴氏杆菌A型特异的hyaC-hyaD基因区段、化脓隐秘杆菌的16S rRNA基因上保守区段和牛支原体的UvrC基因设计特异性引物,多重PCR的最佳扩增条件确定为:95℃10分钟预变性后;95℃1min,56℃50s,72℃1min,循环30次;72℃10分钟进行延伸反应。特异性试验证明,该多重PCR可同时扩增出以上三种致病菌的特异性片段,不能扩增出其他病原菌的相关片段;敏感性试验证明可检测到多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和牛支原体的最低浓度分别为8×105CFU/mL,8×105CFU/mL和4×106CFU/mL,用该方法检测了牛支原体肺炎患牛的鼻拭子与肺组织,发现12 h预增菌后肺组织检测与牛支原体培养的阳性符合率为92%。鉴于对临床样本进行牛支原体分离培养需要3-4天时间,而该多重PCR结合12h预增菌,能在24h内出结果,显著加快了临床诊断速度,具有推广应用价值。

关键词：多重PCR 牛支原体多杀性巴氏杆菌A型化脓隐秘杆菌牛呼吸疾病综合征

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