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小鼠肝炎病毒在长爪沙鼠消化系统的分布及其组织病理学研究

小鼠肝炎病毒在长爪沙鼠消化系统的分布及其组织病理学研究

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中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十四次学术研讨会

作者：吴旧生浙江大学动物科学学院

长爪沙鼠由于其独特的生物学特性被广泛应用于生物医学方面的实验动物,为了弄清长爪沙鼠感染小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)后所引起的消化道病理变化及其在消化道复制和分布情况,本文利用MHV免疫组织化学方法对其进行了全面... 详细信息

长爪沙鼠由于其独特的生物学特性被广泛应用于生物医学方面的实验动物,为了弄清长爪沙鼠感染小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)后所引起的消化道病理变化及其在消化道复制和分布情况,本文利用MHV免疫组织化学方法对其进行了全面的研究,以资为长爪沙鼠MHV 组织病理学积累资料。取来自某实验动物中心21日龄、90日龄、360日龄和720日龄长爪沙鼠各 20只,麻醉后摘眼球采血至死,采集胃、十二指肠、空肠、结肠、盲肠、肝等器官,立即固定于 10％福尔马林,全血置冰箱中静置2hr后离心分离血清,利用MHV多价抗原包板,利用间接ELISA 进行血清学MHV抗体检测,对MHV血清阳性者,取上述固定标本进行常石蜡包埋,连续切片 5-8um,切片下行入水后,经内源性过氧化酶阻断、微波抗原修复、5％羊血清封闭后,用小鼠MHV 多价阳性血清(1:40)37度孵育1 hr后,再用生物素标记兔抗小鼠IgG(北京鼎国)作用1hr,ABC 法显色,苏木精复染1min,常规脱水、透明、中性树胶封片。另一组切片进行HE染色。同时取 3例血清学阴性沙鼠材料作为对照。HE染色结果表明:在全部组别的沙鼠均出现肝脏的弥漫性坏死,肝细胞界限不清晰,细胞核大小状态不一,部分细胞崩解,并可见到合胞体。在21日龄组, 有较多的动物出现炎性细胞浸润表现,肝细胞的病变相对较轻微。在720D组偶见有炎性细胞浸润, 但肝细胞病变较明显。肠道的病变主要表现在固有层内的炎性细胞浸润,粘膜上皮变薄,偶见上皮细胞融合成合胞体,以结肠和盲肠部分较为明显。MHV免疫组织化学染色显示,全部MHV阳性沙鼠肝中均出现MHV染色阳性反应细胞,对照组小鼠全部阴性,符合率100％。肝中MHV阳性反应主要表现肝血窦内皮细胞和枯否氏细胞,呈片状集中分布,MHV阳性肝细胞数量较少,呈散在分布,均在胞质中出现棕黄色阳性产物。阳性细胞以门管区周围分布较多,中央静脉周围少见MHV阳性细胞。在720D组中可见到炎性细胞浸润部位MHV强阳性细胞,多数炎性细胞浸润部位并不呈现MHV的阳性反应。在肠道MHV的阳性反应主要见于粘膜上皮细胞和肠腺的腺腔中。以结肠和盲肠较为严重。以上实验结果表明,MHV自然感染引起的消化系统病理变化,主要表现在肝、结肠和盲肠等器官的炎性细胞浸润和出现合胞体,病毒主要分布在肝血窦内皮细胞、枯否氏细胞和肠粘膜上皮细胞中。由此认为,通过MHV免疫组织化学检测长爪沙鼠的消化系统的病理变化可作为MHV诊断和检测的辅助方法。

关键词：组织病理学小鼠肝炎病毒长爪沙鼠免疫组织化学

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两株不同时期IBV地方分离株核衣壳蛋白基因的遗传变异性分析

两株不同时期IBV地方分离株核衣壳蛋白基因的遗传变异性分析

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会

作者：磨美兰李孟陈秋英范文胜王秀英韦平廖晓红赵夏宇广西大学动物科学技术学院

鸡传染性支气管炎(Infectious bron- chitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性高度接触传染性的呼吸道疾病,严重危害整个世界养禽业。IBV的主要结构蛋白为纤突(S)蛋白、膜(M)蛋白、核衣壳... 详细信息

鸡传染性支气管炎(Infectious bron- chitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性高度接触传染性的呼吸道疾病,严重危害整个世界养禽业。IBV的主要结构蛋白为纤突(S)蛋白、膜(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白和E蛋白。以前认为IBV S1基因是最容易发生变异的,而N基因则相对保守,但最近的研究表明IBV N基因在不同毒株间存在变异,并且这些差异存在于推测的抗原表位和功能相关区域。为了探讨IBV遗传变异的机理,本研究对两株不同时期IBV广西分离株的核衣壳基因进行遗传变异性分析,旨在为我国IBV的分子流行病学研究奠定基础,为IBV的防控提供参考。本研究利用反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对1988年和2005年从免疫过的发病鸡群中分离到的2株IBV毒株GX-XD和GX-YL3的N基因进行扩增克隆并测定其核苷酸序列,并应用DNAstar软件将测定的广西分离株的核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank发表的其它13个IBV参考株进行进化关系分析。结果表明2株IBV的N基因均含有一个长1230bp的ORF,编码由409个氨基酸组成的N蛋白。2株不同时期广西IBV分离株之间的N基因核苷酸序列同源性为86.5%,推导的氨基酸序列同源性为91.7%,低于以前报道的94%以上的同源性。1988年的分离株GX-XD与常用疫苗株H120、H52、M41的核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别介于87.8%-89.0%和92.0%- 93.2%之间,与其它IBV参考株核苷酸序列及推导出的氨基酸序列同源性分别介于86.5%-89.1%和91.2%-93.7%之间。2005年分离的GX-YL3毒株除与国内报道的嗜肾IBV-X株同源性较高(核苷酸序列为96.9%,氨基酸序列为97.3%)外,与其它IBV参考株核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性较低,分别介于86.0%-87.6%和90.5%-92.2%之间,其中与常用疫苗株H120、H52、M41的核苷酸序列及推导出的氨基酸序列同源性分别介于和86.0%-87.4%和90.0%-91.2%。2株广西分离毒株与参考株相比较,除了极少数连续3个核苷酸突变外,整个N基因核苷酸序列共发生100多处点突变,N基因的突变特点为散在的点突变,无缺失和插入现象,这些呈散在分布的点突变涉及整个ORF,与国内其他学者的报道一致。本研究结果表明了IBV的N基因并不是严格保守的,N基因点突变普遍存在,这些单碱基突变对病毒的生物学特性有何影响,还有待进一步研究;2005年分离株GX-YL3的N蛋白的变异程度比1988年分离株GX-XD大,但N蛋白的变异程度是否呈越来越大的趋势,N基因分子遗传变异是否存在一定的规律性及其生物学特性上发生的变化有待进一步深入研究。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒核衣壳基因序列测定遗传变异

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利用抑制性差减杂交筛选禽流感病毒感染相关基因

利用抑制性差减杂交筛选禽流感病毒感染相关基因

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十三次学术研讨会

作者：张万坡程国富毕丁仁胡薛英谷长勤华中农业大学动物医学院华中农业大学动物医学院华中农业大学动物医学院华中农业大学动物医学院华中农业大学动物医学院

利用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)成功构建了禽流感病毒感染和正常对照鸡肾组织差异表达的双向差减cDNA文库,通过斑点杂交筛选到包括干扰素刺激基因(ISG12)、淋巴细胞抗原复合体基因(LY6E)、基质Gla... 详细信息

利用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)成功构建了禽流感病毒感染和正常对照鸡肾组织差异表达的双向差减cDNA文库,通过斑点杂交筛选到包括干扰素刺激基因(ISG12)、淋巴细胞抗原复合体基因(LY6E)、基质Gla蛋白基因 (MGP)、溶菌酶基因、IFN诱导的跨膜蛋白基因及一个没有任何同源信息的EST等6个表达上调基因;KIAA1259、谷光苷肽转移酶基因(GST)、酒精脱氢酶基因(ADH1)、突触结合蛋白基因(SytVx)、葡萄糖6磷酸酶催化哑基基因(G6PC)、钠／二羧酸转运蛋白基因(SDCT)、 MGC4504基因、MGC69686基因和一个没有任何同源信息的EST等9个表达下调基因。通过半定量RT-PCR和Northern杂交对其中8个基因的差异表达进行了验证,并利用Northern杂交对干扰素相关基因ISG12在鸡的不同组织中的表达进行了分析。试验结果初步阐明了高致病性禽流感病毒致病机制和鸡的抗病毒机制。

关键词：禽流感病毒鸡抑制性差减杂交基因差异表达

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PCV-2感染仔猪淋巴结中的病毒定位与细胞凋亡的关系

PCV-2感染仔猪淋巴结中的病毒定位与细胞凋亡的关系

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十三次学术研讨会

作者：施旅娟韩惠利张书霞南京农业大学动物医学院南京农业大学动物医学院南京农业大学动物医学院

选用9头32日龄PCV-2抗体阴性的普通断奶仔猪,随机分为三组,即对照组、PCV-2 攻毒组(PCV-2组)、PCV-2攻毒后再用钥匙孔血蓝蛋白(KLH)刺激组(PCV-2+KLH组),每组3 头。感染后30天采集腹股沟浅淋巴结制作石蜡切片。采用免疫组织化学方法对... 详细信息

选用9头32日龄PCV-2抗体阴性的普通断奶仔猪,随机分为三组,即对照组、PCV-2 攻毒组(PCV-2组)、PCV-2攻毒后再用钥匙孔血蓝蛋白(KLH)刺激组(PCV-2+KLH组),每组3 头。感染后30天采集腹股沟浅淋巴结制作石蜡切片。采用免疫组织化学方法对病毒抗原进行定位,并用末端标记法(TUNEL)和流式细胞法对细胞凋亡进行定位和定量测定。结果表明, PCV-2感染仔猪后30天,PCV-2组和PCV-2+KLH组仔猪淋巴结的主要病变为皮质和副皮质区淋巴细胞严重缺失,上皮样巨噬细胞浸润,巨噬细胞胞浆内见有病毒包涵体,病毒主要存在淋巴小结的上皮样巨噬细胞中;PCV-2组和PCV-2+KLH组仔猪淋巴结中的淋巴细胞凋亡严重, 且主要是淋巴小结内的淋巴细胞发生凋亡,流式细胞仪检测PCV-2组和PCV-2+KLH组仔猪淋巴结的细胞凋亡率分别为3．34％、4．88％,明显高于对照组0．43％的细胞凋亡率(P<0．05和 P<0．01)。结果表明,PCV-2单独感染仔猪能导致淋巴结中淋巴细胞的凋亡,这可能是PCV-2 感染引起仔猪免疫抑制的机理之一。

关键词：猪圆环病毒Ⅱ型仔猪淋巴结病毒定位细胞凋亡

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Characterization of an attenuated TE3L and TE4L deficient vaccinia virus Tian Tan strain in vitro and in vivo

Characterization of an attenuated TE3L and TE4L deficient va...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者： Yuhang Wang Xiao Li Ningyi Jin Genetic Engineering Laboratory of PLA Academy of Military Medical Sciences of PLA Changchun bioxun biotech co.ltd

Vaccinia virus(VV) is a double-stranded DNA virus that replicates and multipli es in the cytoplasm of infected cells using both virally encoded proteins and resourc es of the host *** causes relatively mild symptoms in humans infected natural ***,it has been reported that VV results in several serious side effects,inc luding encephalitis,eczema after vaccination,generalized and progressive poxvirus in fections,as well as some less severe *** complications were recently

关键词： Characterization of an attenuated TE3L and TE4L deficient vaccinia virus Tian Tan strain in vitro and in vivo

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北京地区规模化猪场中禽流感和猪流感流行病学调查报告

北京地区规模化猪场中禽流感和猪流感流行病学调查报告

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十三次学术研讨会

作者：王金秀赵德明祝俊杰赵景义李秀敏中国农业大学国家动物传染性海绵状脑病实验室中国农业大学国家动物传染性海绵状脑病实验室北京市畜牧兽医总站北京市畜牧兽医总站北京市畜牧兽医总站

为了解北京地区猪群(种猪、商品猪和小型猪)在春、夏、秋、冬四季中是否携带禽流感H5、H7、H9亚型和猪流感H1、H3、H9亚型病毒以及血清中是否具有禽流感病毒和猪流感病毒相应亚型的抗体,2004年3月至2005年3月在北京8个区(县)18个猪场采... 详细信息

为了解北京地区猪群(种猪、商品猪和小型猪)在春、夏、秋、冬四季中是否携带禽流感H5、H7、H9亚型和猪流感H1、H3、H9亚型病毒以及血清中是否具有禽流感病毒和猪流感病毒相应亚型的抗体,2004年3月至2005年3月在北京8个区(县)18个猪场采集并检测了713份猪血清样品,所有检测血清样本中禽流感H5、H7和H9亚型HI抗体效价全部为0;713份血清样本中猪流感H1亚型的阳性率为11．78％、猪流感H3亚型的阳性率为11．36％、猪流感H9亚型的阳性率为0．98％。采自713头猪鼻、咽拭子的病毒分离结果为禽流感H5、H7和H9亚型和猪流感H1、H3、H9亚型病毒均为0。试验结果初步证实:在 2004年春季至2005年春季(1)采样猪群没有被禽流感H5、H7、H9亚型病毒感染过,也未携带禽流感H5、H7、H9亚型病毒;(2)采样猪群中被猪流感H1、H3、H9亚型病毒感染过,但未分离到相应亚型的病毒。

关键词：北京地区禽流感猪流感流行病学调查

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金丝桃素新制剂在体外抗AIV的研究

金丝桃素新制剂在体外抗AIV的研究

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十三次学术研讨会

作者：赵晓虹梁剑平王雯慧尚若锋崔颖祝艳华王选慧陈怀涛甘肃农业大学中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃农业大学中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃农业大学甘肃农业大学甘肃农业大学

本研究首先采用Klein-Defors悬浮杀灭方法,进行金丝桃素新制剂对低致病力H9N2亚型AIV 的杀灭效果实验。选取1520枚10日龄SPF鸡胚,分为金丝桃素新制剂给药组(760枚鸡胚)、利巴韦林对照组(608枚鸡胚)和阳性对照组(152枚鸡胚)。根据药物浓... 详细信息

本研究首先采用Klein-Defors悬浮杀灭方法,进行金丝桃素新制剂对低致病力H9N2亚型AIV 的杀灭效果实验。选取1520枚10日龄SPF鸡胚,分为金丝桃素新制剂给药组(760枚鸡胚)、利巴韦林对照组(608枚鸡胚)和阳性对照组(152枚鸡胚)。根据药物浓度的不同,又将金丝桃素新制剂组分为5个小组,利巴韦林对照组分为4个小组。为了观察不同作用时间金丝桃素新制剂对病毒的杀灭效果,再将上述各小组分为两组,一组是将药物与病毒的混合液作用10min后尿囊腔接种鸡胚, 另一组是将混合液作用30min后尿囊腔接种鸡胚。采集尿囊液进行血凝试验,并计算药物对这两种病毒的杀灭率。结果表明,0．0005mg／ml～0．34mg／ml浓度范围内的金丝桃素新制剂与H9N2亚型低

关键词：金丝桃素新制剂 H9N2亚型禽流感病毒 H5N1亚型禽流感病毒杀灭效果

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猪β2-微球蛋白基因在大肠埃希氏菌中的表达与纯化

猪β2-微球蛋白基因在大肠埃希氏菌中的表达与纯化

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十三次学术研讨会

作者：肖一红刘光亮童铁钢王群孟庆文吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

目的:构建猪β2-微球蛋白(Sβ2m)基因的原核表达载体,使其能在大肠杆菌中得到高效表达并能纯化,为构建猪MHC-Ⅰ类分子肽四聚体奠定基础。方法:采用RT-PCR技术从猪外周血单核细胞(PBMC)中扩增出去信号肽的S2m基因,克隆至pET-28a(+)高效... 详细信息

目的:构建猪β2-微球蛋白(Sβ2m)基因的原核表达载体,使其能在大肠杆菌中得到高效表达并能纯化,为构建猪MHC-Ⅰ类分子肽四聚体奠定基础。方法:采用RT-PCR技术从猪外周血单核细胞(PBMC)中扩增出去信号肽的S2m基因,克隆至pET-28a(+)高效表达载体后进行化学诱导表达,利用Ni2+NTA鏊合物树脂柱对表达产物进行了纯化,用SDS-PAGE和 Western blotting法对表达产物进行鉴定。结果:成功构建了pET-SD2m表达载体,表达产物以包涵体的形式存在,分别占全菌和不溶性蛋白的40．4％和91．7％,并在变性条件下对包涵体中的重组Sβ2m进行了纯化,获得了高纯度的Sβ2m,结论:成功表达、纯化了Sβ2m,为进一步利用亲和素在体外构建猪MHC-Ⅰ类分子肽四聚体奠定基础。

关键词：猪β2微球蛋白基因克隆表达纯化

来源：评论

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高致病性禽流感病毒人工感染小鼠组织病理学研究

高致病性禽流感病毒人工感染小鼠组织病理学研究

引用

中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十三次学术研讨会

作者：常爽丁壮杨松涛高玉伟王承宇邹啸环王铁城夏咸柱军事医学科学院军事兽医研究所吉林大学畜牧兽医学院军事医学科学院军事兽医研究所军事医学科学院军事兽医研究所军事医学科学院军事兽医研究所军事医学科学院军事兽医研究所军事医学科学院军事兽医研究所军事医学科学院军事兽医研究所

本研究应用经SPF鸡胚增殖的虎源高致病性禽流感病毒A/Tiger／Harbin／01／2003 (H5N1)株,其对MDCK细胞的TCID50为10-7.36／0．05ml,经气管接种人工感染小鼠,对感染致死的小鼠和对照组小鼠,无菌采取脏器进行组织病理学观察和免疫组织化... 详细信息

本研究应用经SPF鸡胚增殖的虎源高致病性禽流感病毒A/Tiger／Harbin／01／2003 (H5N1)株,其对MDCK细胞的TCID50为10-7.36／0．05ml,经气管接种人工感染小鼠,对感染致死的小鼠和对照组小鼠,无菌采取脏器进行组织病理学观察和免疫组织化学染色以及透射电镜观察。结果表明:剖检感染的死亡小鼠发现以肺脏的损害最为明显。病理组织学光镜观察,肺泡腔不同程度的缩小,胞腔内有少量蛋白样浆液渗出,肺泡间隔不同程度的增宽, 肺内小血管及肺泡间隔的毛细血管扩张、淤血,支气管内充血。免疫组织化学染色发现,在支气管上皮细胞和较多的肺泡上皮细胞和浸润的单核细胞胞浆内可见到该病毒的抗原阳性染色颗粒。电镜超微结构观察,在小鼠肺泡扁平上皮细胞表面和肺泡腔中可见到短杆型和圆型的流感病毒样粒子。

关键词：高致病性禽流感病毒(HPAIV) 小鼠组织病理学免疫组织化学

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稳定表达鸡CD4、CD8α细胞系的建立与鉴定

稳定表达鸡CD4、CD8α细胞系的建立与鉴定

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会

作者：袁舟潘志明孟松树季琰胡青海焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室

鸡CD4和CD8分子是T细胞表面Ⅰ型跨膜糖蛋白,作为TCR的辅受体参与对MHC分子递呈抗原的识别。除了作为细胞黏附分子发挥作用外,它们还是传递信号的分子。因此,深入研究ChCD4和ChCD8将有利于我们了解这些辅受体在家禽免疫防御中的作用,从... 详细信息

鸡CD4和CD8分子是T细胞表面Ⅰ型跨膜糖蛋白,作为TCR的辅受体参与对MHC分子递呈抗原的识别。除了作为细胞黏附分子发挥作用外,它们还是传递信号的分子。因此,深入研究ChCD4和ChCD8将有利于我们了解这些辅受体在家禽免疫防御中的作用,从而为阐明疾病的免疫机理奠定基础。本研究利用Flp/FRT重组系统,将Flp重组酶表达载体pOG44与带有白莱航鸡CD4或CD8α基因序列的真核表达载体pcDNA5/FRT共转染Flp-In-293细胞,在Flp重组酶介导下使Flp- In-293细胞中的FRT位点与真核表达载体pcD- NA5/FRT中的FRT位点发生特异性重组,经Hy- gromycin B抗性压力筛选获得了表达ChCD4、ChCD4-FLAG、ChCD8α或ChCD8αc-FLAG的稳定细胞系,这为研制针对ChCD4、ChCD8α的单克隆抗体(mAb)奠定了基础。分别用BamHⅠ、ApaⅠ和Bam HⅠ、XhoⅠ从pcDNA3.1-CD4和pcDNA3.1-CD8中切出白莱航鸡CD4和CD8α基因,并插入pcDNA5/FRT载体中,构建出真核表达质粒pcDNA5/FRT-CD4和pcDNA5/FRT-CD8α。用PCR方法扩增去除C端终止子的ChCD4和ChCD8α基因片段,经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后插入pcDNA3.1-FLAG载体,使其C端带有FLAG标签;然后用KpnⅠ和ApaⅠ将目的片段ChCD4-FLAG和ChCD8α-FLAG切下插入pcDNA5/FRT载体,最后构建出真核表达质粒pcD- NA5/FRT-CD4-FLAG和pcDNA5/FRT-CD8α- FLAG。分别将ChCD4、ChCD8α及C端带有FLAG标签的四种真核表达质粒瞬时转染Flp-In-293细胞,孵育48h后,FACS检测结果表明,四种真核表达质粒pcDNA5/FRT-CD4、pcDNA5/FRT-CD8α、pcDNA5/FRT-CD4-FLAG、pcDNA5/FRT-CD8α- FLAG构建正确且都能在Flp-In-293细胞膜上表达,且C端带有FLAG标签不影响目的蛋白的表达。采用脂质体转染法,将重组酶表达载体pOG44与四种pcDNA5/FRT真核表达质粒分别共转染Flp-In-293细胞,孵育48h后,用含120μg/ml Hygro- mycin B的完全培养基1:10稀释进行抗性筛选,3-4周后挑取克隆扩大培养并作FACS鉴定,获得表达ChCD4的细胞克隆,分别命名为C1、C2、C7;表达ChCD4-FLAG的细胞克隆,分别命名为D1、D6、D8;表达ChCD8α的细胞克隆,命名为E1;表达ChCD8α-FLAG的细胞克隆,分别命名为F1、F2、F3、F4。FACS、直接免疫荧光、间接免疫荧光分析表明,ChCD4和ChCD8α均在Flp-In-293细胞膜上表达,C端FLAG标签也得到了表达;β-半乳糖苷酶活性及Zeocin抗性分析表明,lacZ-Zeo融合蛋白在筛选过程中依然部分存在;选取C1、D1和E1、F1在抗性压力下长期培养后,FACS检测表明,目的蛋白能稳定表达;正常条件培养及饥饿20h培养F1、F2、F3、F4后裂解细胞进行SDS-PAGE电泳,转印后以FLAG单抗为一抗,HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗进行Western blotting,ECL显色,四个克隆均在35kDa处有目的条带,阴性对照E1及未转染细胞均无任何条带。饥饿培养与正常条件培养的细胞条带差异不大,说明有无血清刺激均不影响细胞表达ChCD4或ChCD8α分子。以鼠抗鸡CD8α纯化抗体为一抗进行Western blotting,F1、F2、F3、F4均在预期的35kDa处有目的条带。

关键词：鸡 CD4 CD8α 稳定表达细胞系建立

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