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减毒鸡白痢沙门氏菌?crpC79-13株的构建及其作为活疫苗对雏鸡免疫活性初步观察

减毒鸡白痢沙门氏菌?crpC79-13株的构建及其作为活疫苗对雏鸡免疫...

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：郁川程相朝赵战勤张春杰李银聚吴庭才廖成水胡阿勇河南科技大学动物科技学院

构建鸡白痢沙门氏菌C79-13株?crp基因缺失突变株,并将?crpC79-13作为活疫苗口服免疫雏鸡,对其免疫活性进行初步观察。首先,将含缺失320bp crp基因的重组自杀性质粒pRE?crp与C79-13进行接合转移,两步法筛选出无抗性标记的鸡白痢沙门氏菌C... 详细信息

构建鸡白痢沙门氏菌C79-13株?crp基因缺失突变株,并将?crpC79-13作为活疫苗口服免疫雏鸡,对其免疫活性进行初步观察。首先,将含缺失320bp crp基因的重组自杀性质粒pRE?crp与C79-13进行接合转移,两步法筛选出无抗性标记的鸡白痢沙门氏菌C79-13株crp基因缺失突变株。crp基因缺失后,口服接种1日龄雏鸡其毒力较C79-13降低约10～3倍;雏鸡于4日龄口服免疫?crpC79-13(10～9CFU/只)不影响其胸腺、法氏囊、脾脏等免疫器官及平均日增重等正常生长发育(P>0.05);根据外周血淋巴细胞转化(MTT)试验、Griess法及血清IgG动态观察,初步测定雏鸡于接种后第2～3周体内免疫水平达到最高。结果表明,本研究成功构建了减毒鸡白痢沙门氏菌?crpC79-13株,缺失株毒力显著降低,免疫雏鸡保持了较好的免疫活性,为研制鸡沙门氏菌活疫苗奠定了基础。

关键词：鸡白痢沙门氏菌 crp基因重组自杀性质粒免疫

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编码鸭瘟病毒VP11/12蛋白基因克隆和分子特性

编码鸭瘟病毒VP11/12蛋白基因克隆和分子特性

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：路立婷程安春汪铭书蒋金凤朱德康贾仁勇罗启慧陈孝跃四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川农业大学动物微生态工程研究中心

疱疹病毒VP11/12蛋白由UL46基因编码。对本实验室新鉴定的DPV UL46基因(GenBank登录号EU195108)进行PCR扩增并将其克隆到pMD18-T载体上,重组质粒进行PCR和双酶切(BamHⅠ+XhoⅠ)鉴定、测序及核酸斑点杂交验证,并运用生物信息学工具分析DP... 详细信息

疱疹病毒VP11/12蛋白由UL46基因编码。对本实验室新鉴定的DPV UL46基因(GenBank登录号EU195108)进行PCR扩增并将其克隆到pMD18-T载体上,重组质粒进行PCR和双酶切(BamHⅠ+XhoⅠ)鉴定、测序及核酸斑点杂交验证,并运用生物信息学工具分析DPV UL46基因的分子特性。结果证实,获得的ORF2220为DPV UL46基因,全长2220 bp,编码739aa。与已报道的其他24种疱疹病毒参考株UL46基因的同源性均不高。系统发生树显示,DPV与a-疱疹病毒亚科的GaHV-3和MDV-2等鸟类疱疹病毒的亲缘关系最近。DPVUL46基因存在10个转录启动子序列,在17-470 aa范围内存在一个结构功能域,编码的氨基酸Trp、Met、His、Lys、Glu具有一定的偏嗜性。VP11/12共有35个抗原表位,分布于UL46多肽链的整个序列中,编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,具有较好的亲水性、可塑性和较高的抗原指数,无跨膜区域,是一种膜外蛋白,定位于细胞质的核周区,无信号肽切割位点,具有72个潜在的磷酸化位点,2个潜在的糖基化位点。编码蛋白的结构多为柔性区域,富含a-螺旋和β-折叠,含少量无规则卷曲。同源模建分析,未发现与该蛋白相匹配的三级结构。

关键词：鸭瘟病毒 VP11/12蛋白 UL46基因克隆分子特性

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鸭瘟病毒UL46基因主要抗原域的克隆、原核表达及其产物的抗原性分析

鸭瘟病毒UL46基因主要抗原域的克隆、原核表达及其产物的抗原性分...

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

采用软件DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对本实验室新鉴定的鸭瘟病毒(Duckplague virus,DPV)UL46基因(GenBank登录号EU195108)及其编码多肽的主要抗原域进行分析。结果显示DPV UL46基因全长2... 详细信息

采用软件DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对本实验室新鉴定的鸭瘟病毒(Duckplague virus,DPV)UL46基因(GenBank登录号EU195108)及其编码多肽的主要抗原域进行分析。结果显示DPV UL46基因全长2220 bp,编码739 aa,其多肽链的柔性区域所占比例最大(52.77%),具有较好的亲水性、可塑性和较高的抗原指数。UL46基因的主要抗原域分布于整个多肽链,但主要位于氨基端第Ser423-Thr449、Val451-Ser500、Phe502-Tyr526、Asn540-Thr596、Glu614-Ala651、Ser655-Ser671、Gly681-Cys700区域内。以DPVCHv毒株基因组为模板,利用Primer Premier5.0软件设计一对特异性引物,扩增涵盖上述主要抗原域的基因片段(700-2220 bp),将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,获得重组质粒pET-32a/UL46M,再将其转化至*** Rosetta(DE3)。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明相对分子量约为79 kD的融合蛋白以包涵体形式表达。以兔抗DPV多克隆血清进行Western blot,显示可与该融合蛋白发生特异性反应。结果为进一步开展UL46基因功能的研究提供了重要数据和关键研究材料。

关键词：鸭瘟病毒 UL46基因主要抗原域原核表达 Western blot

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微生态制剂对幼兔生长及HPA轴5-HT能细胞的影响

微生态制剂对幼兔生长及HPA轴5-HT能细胞的影响

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：潘康成冯轼崔恒敏陈刚陈正礼四川农业大学动物医学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川大学基础医学院与法学院

本文旨在研究微生态制剂对幼兔生长和下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴5-羟色胺(5-HT)免疫反应细胞的影响。选用108只雄性幼兔随机分为4组,对照组饲喂基础日粮,益生素组在日粮中添加0.1%芽孢杆菌PAS38制剂,益生元组在日粮中添加0.2%甘露聚糖制... 详细信息

本文旨在研究微生态制剂对幼兔生长和下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴5-羟色胺(5-HT)免疫反应细胞的影响。选用108只雄性幼兔随机分为4组,对照组饲喂基础日粮,益生素组在日粮中添加0.1%芽孢杆菌PAS38制剂,益生元组在日粮中添加0.2%甘露聚糖制剂,合生元组在日粮中添加0.1%PAS38制剂和0.2%甘露聚糖制剂,其中48只兔(12只/组)用于全程观察生长性能。其余60只家兔饲喂至60、75、90日龄时每组宰杀5只,采用免疫组化法检测HPA轴5-HT阳性细胞数量和表达。结果表明,益生素组和合生元组日增重极显著高于对照组(P<0.01),益生元组显著高于对照组(P<0.05)。益生素、益生元、合生元组的料重比分别比对照组下降了13.8%、10.9%、14.9%(P>0.05)。微生态制剂对HPA轴5-HT阳性细胞数量变化不显著(P>0.05);75日龄和90日龄时,益生素和合生元组HPA轴5-HT阳性细胞的表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组,益生元组90日龄时HPA轴5-HT阳性细胞的表达显著高于对照组(P<0.05)。结果提示,微生态制剂能促进幼兔生长,增强HPA轴中5-HT阳性细胞的表达。

关键词：微生态制剂蜡样芽孢杆菌甘露聚糖生长性能 5-羟色胺免疫组织化学下丘脑-垂体-肾上腺轴家兔

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A型产气荚膜梭菌类毒素油乳剂疫苗的研制及家兔免疫效果的研究

A型产气荚膜梭菌类毒素油乳剂疫苗的研制及家兔免疫效果的研究

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：吕静柴同杰山东农业大学动物科技与动物医学院

本研究利用全自动机械搅拌发酵罐对A型产气荚膜梭菌进行发酵培养生产毒素,毒素经0.4%的甲醛灭活制备了类毒素油乳剂疫苗,根据兽用生物制品规程对疫苗进行常规检测,家兔免疫后对1～19周的抗体消长规律以及保护率进行了研究,并与商品化灭... 详细信息

本研究利用全自动机械搅拌发酵罐对A型产气荚膜梭菌进行发酵培养生产毒素,毒素经0.4%的甲醛灭活制备了类毒素油乳剂疫苗,根据兽用生物制品规程对疫苗进行常规检测,家兔免疫后对1～19周的抗体消长规律以及保护率进行了研究,并与商品化灭活苗免疫效果进行了比较。结果表明,甲醛灭活48h后制备的类毒素油乳剂疫苗经检验符合疫苗制造的各项要求,对动物安全性高,无毒副作用;2mL免疫家兔获得了100%的保护率;免疫家兔后第4周抗毒素效价和抗菌效价达到最高峰,分别为8.3log2和8.6log2,到19周抗毒素和抗菌效价分别为6.5log2和5.4log2;免疫后攻毒第2～19周均达到100%的保护率。通过比较,类毒素疫苗和商品化灭活苗产生的抗菌效价水平差异不显著(P>0.05),而抗毒素效价水平明显高于商品化灭活苗(P<0.05),动物安全性以及对动物保护率均优于商品化灭活苗。可见本疫苗对动物具有确实可靠的免疫效果。

关键词：产气荚膜梭菌类毒素油乳剂疫苗免疫家兔

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IBDV抗原表位与HBcAg嵌合基因的分子设计及其表达产物分析

IBDV抗原表位与HBcAg嵌合基因的分子设计及其表达产物分析

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：刘小娟王永山欧阳伟张海彬王晓丽王忠灿唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

为了提高模拟IBDV多表位基因5epis的免疫效力,运用重叠延伸PCR技术,在乙型肝炎病毒核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)基因的231位～232位核苷酸(77位～78位氨基酸残基)之间插入BamH I和EcoR I酶切位点,构建HBcAg修饰基因(Modifi... 详细信息

为了提高模拟IBDV多表位基因5epis的免疫效力,运用重叠延伸PCR技术,在乙型肝炎病毒核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)基因的231位～232位核苷酸(77位～78位氨基酸残基)之间插入BamH I和EcoR I酶切位点,构建HBcAg修饰基因(Modified HBc,mHBc)表达质粒pET-mHBc。然后,将5epis基因定向插入到该表达质粒mHBc基因中,获得嵌合基因mHBc-5epis表达质粒pET-mHBc-5epis,并在大肠杆菌中表达。用SDS-PAGE分析,重组嵌合蛋白的分子量约为29kDa,表达量约占菌体总蛋白的47.6%;在Western-blotting试验中,重组嵌合蛋白与IBDV抗体反应形成1条特异性蛋白带。将重组菌超声破碎后,用电镜观察,可见重组嵌合蛋白呈病毒样颗粒(VLP),直径约60 nm～80 nm;用IBDV抗体夹心ELISA检测,抗原效价达到2.0×10～2。本研究成功构建了5epis与HBcAg嵌合基因,在大肠杆菌中高效表达了具有IBDV抗原反应性的重组嵌合蛋白并形成了VLP,具有成为颗粒化表位型IBD基因工程疫苗的应用前景。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) 乙肝病毒核心抗原(HBcAg) 抗原表位嵌合基因

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猪瘟病毒E2蛋白乳酸菌表达系统的构建

猪瘟病毒E2蛋白乳酸菌表达系统的构建

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：童亮肖晶刘旭川王生奎孙绍美徐佳柴俊张以芳云南农业大学动物科学技术学院

猪瘟(Swine fever)是由猪瘟病毒(Classic Swine FeverVirus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病,猪是该病毒唯一的自然宿主。E2即gp55,是CSFV的囊膜糖蛋白之一,是猪瘟病毒最重要的中和性抗原,也是病毒所有糖蛋白中保守性最低、最易变异的... 详细信息

猪瘟(Swine fever)是由猪瘟病毒(Classic Swine FeverVirus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病,猪是该病毒唯一的自然宿主。E2即gp55,是CSFV的囊膜糖蛋白之一,是猪瘟病毒最重要的中和性抗原,也是病毒所有糖蛋白中保守性最低、最易变异的蛋白,因此常选择CSFV的E2蛋白作为检测猪瘟和制备亚单位疫苗的候选抗原。本试验在诱变猪瘟E2稀有密码子,以适以原核表达,构建原核表达质粒pET28aE2的基础上,使用重组原核表达菌株BL21(DE3)/pET28aE2,经重组PCR技术,对猪瘟病毒E2基因进行PCR扩增,将PCR扩增的E2基因克隆至乳酸菌表达质粒pNZ44中,构建了猪瘟病毒E2基因的乳酸菌重组表达质粒pNZ44-E2。将pNZ44-E2转入受体菌乳杆菌中,通过优化生长条件,有效表达了猪瘟病毒主要保护性抗原E2基因,免疫印迹试验表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。研究为猪瘟E2蛋白在猪瘟的口服免疫及粘膜免疫防制方面的应用奠定了基础,也为乳酸菌的性能改进提供了新的思路。

关键词：猪瘟病毒 E2基因乳酸菌表达系统乳酸菌

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间接免疫荧光检测DPV gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律

间接免疫荧光检测DPV gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布...

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：沈福晓程安春汪铭书贾仁勇朱德康陈孝跃蒋金凤四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川农业大学动物微生态工程研究中心

本研究利用已建立的间接免疫荧光检测DPV gC基因疫苗(pcDNA-DPV-gC)在雏鸭体内的表达时相和分布规律,为DPV gC基因疫苗的进一步的研究和临床应用提供基础数据。将鸭瘟病毒gC基因疫苗(pcDNA-DPV-gC)分别以不同剂量(6、3和1μg)基因枪免... 详细信息

本研究利用已建立的间接免疫荧光检测DPV gC基因疫苗(pcDNA-DPV-gC)在雏鸭体内的表达时相和分布规律,为DPV gC基因疫苗的进一步的研究和临床应用提供基础数据。将鸭瘟病毒gC基因疫苗(pcDNA-DPV-gC)分别以不同剂量(6、3和1μg)基因枪免疫20日龄雏鸭,以空白质粒和生理盐水为对照;于免疫后4 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、2 w、4 w、6 w和10 w随机宰杀2只雏鸭,采集心、肝、脾、肺、肾、胰、脑、胸腺、哈氏腺、法氏囊、食道、十二指肠、盲肠、直肠以及注射部位皮肤等组织器官,应用间接免疫荧光检测pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律。结果显示免疫后1 d,各剂量组可在肝、十二指肠、盲肠、直肠和注射部位皮肤发现阳性信号,其中注射部位皮肤的阳性信号最强;免疫后2w,各组织中的抗原表达量达到高峰,其中肝、胸腺、法氏囊、十二指肠、盲肠和直肠是DPV gC蛋白主要的分布器官;免疫后10w,各剂量组仍在肝、脑、十二指肠、盲肠和直肠发现持续表达DPV gC蛋白;而对照组中各组织均未检出阳性信号。不同免疫剂量的pcDNA-DPV-gC与其在雏鸭体内的抗原表达和分布呈现一定的正相关,表现出一定的剂量依赖性。研究表明不同剂量pcDNA-DPV-gC可以顺利进入雏鸭体内,能在雏鸭各组织中广泛分布并能持续表达DPV gC蛋白。

关键词：鸭瘟病毒gC基因疫苗间接免疫荧光表达时相分布规律

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实时荧光定量PCR检测鸡口服枯草芽孢杆菌后肠道芽孢杆菌数量变化

实时荧光定量PCR检测鸡口服枯草芽孢杆菌后肠道芽孢杆菌数量变化

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：潘康成冯兴崔恒敏张亚兰赵爽四川农业大学动物医学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室

应用细菌16S rDNA序列设计芽孢杆菌的引物并对仔鸡口服枯草芽孢杆菌Pab02后进行实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测肠道内芽孢杆菌数量的动态变化。枯草芽孢杆菌Pab02悬液按2mL/1kg体重(10～9CFU/mI)进行灌喂,每天2次,连续仔鸡3d后,收集肠道... 详细信息

应用细菌16S rDNA序列设计芽孢杆菌的引物并对仔鸡口服枯草芽孢杆菌Pab02后进行实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测肠道内芽孢杆菌数量的动态变化。枯草芽孢杆菌Pab02悬液按2mL/1kg体重(10～9CFU/mI)进行灌喂,每天2次,连续仔鸡3d后,收集肠道内容物,采用FQ-PCR检测肠道内容物中芽孢杆菌的数量。对照组鸡肠道内芽孢杆菌数在10～5～10～6个拷贝数之间,当连续口服芽孢杆菌Pab02悬液3d后鸡肠道内的芽孢杆菌在10～5～10～8拷贝数之间,十二指肠内的芽孢杆菌数量从12h到第4d极显著地高于对照组差,第5d后恢复到对照组水平;空肠、回肠和直肠的芽孢杆菌数量变化相似,从12h到第5d灌服Pab02组极显著高于对照组,第6d以后恢复到对照组水平。盲肠内的芽孢杆菌数量在48h时极显著高于对照组,72h时显著高于对照组,第4d以后恢复到对照组水平。芽孢杆菌在鸡肠道内的数量较少,经口补充芽孢杆菌后,能迅速提高肠道内的芽孢杆菌数量,当停止补充芽孢杆菌后,肠道内的芽孢杆菌逐渐恢复到正常水平。

关键词：枯草芽孢杆菌实时荧光定量PCR 肠道仔鸡

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复合活菌制剂对断奶仔猪生长性能及血清溶菌酶含量的影响

复合活菌制剂对断奶仔猪生长性能及血清溶菌酶含量的影响

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：刘宇朱战波孙秀军王玉海车车谭磊崔莉张军袭莹李冬野杨焕民黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江省兽医科学研究所黑龙江省鸡西大唐热电公司黑龙江省大庆市油田矿区服务事业部园林绿化公司

选择长白二元杂交断奶仔猪90头进行实验.断奶日龄为35d。共分为五个组,每组设3个重复,每个重复随机选取健康仔猪6头。试验组一:饲喂基础日粮+0.1%复合制剂(纳豆杆菌,双歧杆菌,罗伊氏乳杆菌),试验组二:饲喂基础日粮+0.1%复合制剂(纳豆杆... 详细信息

选择长白二元杂交断奶仔猪90头进行实验.断奶日龄为35d。共分为五个组,每组设3个重复,每个重复随机选取健康仔猪6头。试验组一:饲喂基础日粮+0.1%复合制剂(纳豆杆菌,双歧杆菌,罗伊氏乳杆菌),试验组二:饲喂基础日粮+0.1%复合制剂(纳豆杆菌,双歧杆菌,干酪乳杆菌),试验组三:饲喂基础日粮+0.1%复合制剂(纳豆杆菌,双歧杆菌,嗜酸乳杆菌),试验组四:饲喂基础日粮+0.1%复合制剂(纳豆杆菌,双歧杆菌,罗伊氏乳杆菌,干酪乳杆菌,嗜酸乳杆菌),对照组:饲喂基础日粮。其中复合制剂中益生菌活菌数为10～9CFU/g。饲养30d后观察复合活菌制剂对断奶仔猪生长性能及血清溶菌酶含量的影响。结果表明:在日增重、饲料效率及血清溶菌酶方面,试验组一和二显著高于对照组(P<0.05);在腹泻率方面,试验组均显著低于对照组(P<0.05)。研究表明:在仔猪日粮中添加复合活菌制剂可提高每头断奶仔猪平均日增重及饲料效率,降低腹泻的发病率,且增高了仔猪血清溶菌酶含量,提高了仔猪的免疫机能,从而提高了经济效益。

关键词：复合活菌制剂断奶仔猪生长性能血清溶菌酶

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