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连锁群选育法:一种新型的遗传学鉴定基因方法

连锁群选育法:一种新型的遗传学鉴定基因方法

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者：郭涛黄兵董辉韩红玉赵其平姜连连李洋平宪卿中国农业科学院上海兽医研究所/农业部动物寄生虫学重点开放实验室

连锁群选育法(Linkage Group Selection,LGS)是一种新型的鉴定与表型相关基因的遗传学方法,具有快速、有效、省力等优点,最早由Culleton等人于2005年提出,并首先用于疟原虫(Plasmodium spp.)耐药性相关基因的研究。对疟原虫的遗传分析... 详细信息

连锁群选育法(Linkage Group Selection,LGS)是一种新型的鉴定与表型相关基因的遗传学方法,具有快速、有效、省力等优点,最早由Culleton等人于2005年提出,并首先用于疟原虫(Plasmodium spp.)耐药性相关基因的研究。对疟原虫的遗传分析显示其遗传机制符合经典的孟德尔法则,即把两株遗传学明显不同的疟原虫杂交后,在杂交后代中不同位点的等位基因进行重组,而相同位点的等位基因进行分离。随后合子发育为卵囊,经过孢子生殖发育为单倍体的重组后代——子孢子。两个亲代间的等位基因随机分配到重组后代中,所以,对于控制某个表型的等位基因,例如耐药性等位基因,一半的重组后代获得来自耐药株的耐药等位基因,而另外一半获得来自敏感株的敏感等位基因。单倍体重组虫体经相关选择压力选育,同时也在无选择压力下传代。经过选择后,除了那些与选择压力相关基因连锁的位点之外,来自两个亲代的其他等位基因均相等地呈现。与相应的没有经选择压力选育的后代相比,这些位点上来自敏感亲本的等位基因会减少或被清除。对在有选择压力下的杂交后代和无选择压力的杂交后代用全基因范围内的定量遗传标记进行分析,就可鉴定那些来自敏感亲代的、在选择压力下减少或被消除的标记。在基因组中定位这些选择性的标志,将可定位出一个连锁群,而与选择压力相关的靶基因就可以定位于该连锁群内,所以称为连锁群选育法。而且,某一个标记与靶基因所在位点的距离越近,该标记在有选择压力下的后代中表达量的减少程度就越大。所以,在选择压力作用靶位点的周围形成一个倒置的锥形结构,称为选择谷(selection valley),其中靶位点在底部。对处于选择谷谷底内的标记进行测序,对所获得的序列在基因组数据库中进行比对,所得到的基因很有可能就是决定该特定表型的靶基因。采用LGS法已成功鉴定与疟原虫耐药性、株特异性免疫力等表型相关的靶基因。由于在生活史中具有相同的遗传学特征,LGS也可应用于疟原虫之外的其他顶复器门原虫,例如泰勒属(Theileria spp.)、巴贝斯属(Babesia spp.)、弓形虫属(Toxoplasma spp.)和艾美耳属(Eimeria spp.)原虫;甚至可以用于其他单倍体生物,如裂殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

关键词：靶位点耐药性基因方法疟原虫杂交后代等位基因

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用反向线状印迹方法检测和区别羊的泰勒虫和巴贝斯虫

用反向线状印迹方法检测和区别羊的泰勒虫和巴贝斯虫

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者：牛庆丽关贵全马米玲刘志杰刘爱红高金亮任巧云李有全刘军龙罗建勋殷宏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

根据已报道的梨形虫18S rRNA基因序列设计针对所有梨形虫虫体的通用引物RLB-F和RLB-R(5'端用生物素标记),PCR扩增泰勒虫属和巴贝斯虫属的18S rRNA高变区域,同时,在扩增片段内设计针对不同羊梨形虫种的特异性寡核苷酸探针(梨形虫通... 详细信息

根据已报道的梨形虫18S rRNA基因序列设计针对所有梨形虫虫体的通用引物RLB-F和RLB-R(5'端用生物素标记),PCR扩增泰勒虫属和巴贝斯虫属的18S rRNA高变区域,同时,在扩增片段内设计针对不同羊梨形虫种的特异性寡核苷酸探针(梨形虫通用、泰勒虫通用、巴贝斯虫通用、莫氏巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性探针),所有的探针合成时,5′端被氨基团修饰,通过共价结合的方式固定在带有负电荷的Biodyne C薄膜上,将扩增的靶基因片段和不同的属、种特异性探针进行杂交,结果证实该方法能够同时检测出:莫氏巴贝斯虫(承德株,临潭株,宁县株,天祝株)、喀什株巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫(临潭株,麻当株和宁县株)和尤氏泰勒虫(渭源株和张家川株)四个种,所有的探针仅和各自的靶基因序列结合,没有交叉反应。标准阳性样品可以很清楚的被相应的虫株、种或者属特异性探针识别,而用羊的基因组和水分别做为阴性和空白对照时,没有观察到任何反应。根据建立的标准方法,应用有限稀释的方法,测定四个种特异性探针的敏感性,其敏感性分别为:10-6(莫氏巴贝斯虫);10-3(巴贝斯未定种喀什株);10-8(吕氏泰勒虫);10-5(尤氏泰勒虫),即分别为0.04pg、0.1ng、0.0001pg、0.1pg。相应的PCR检测方法其敏感性分别为:10-3(莫氏巴贝斯虫);10-2(巴贝斯虫未定种喀什株);10-5(吕氏泰勒虫);10-3(尤氏泰勒虫)。通过该方法对117份六个不同地区采集的野外样品进行检测,与对应样品的PCR和ELISA方法检测结果比较,显示RLB的检出率明显高于其他两种方法,可以用于鉴别诊断羊梨形虫感染情况。

关键词：泰勒虫巴贝斯虫梨形虫

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山东省50家肉鸡场球虫流行率调查

山东省50家肉鸡场球虫流行率调查

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者：孙希萌吕艳丽索勋中国农业大学动物医学院国家动物原虫实验室

肉鸡球虫病是由细胞内寄生的艾美耳属球虫引起的原虫病,其引起的死亡率占肉鸡死亡率的6%-10%,每年造成的直接损失在20亿美元以上。我国肉鸡饲养以农户地面群养为主,软硬件配备相对落后,农户又经常盲目使用抗球虫药物,致使耐药虫株普遍出... 详细信息

肉鸡球虫病是由细胞内寄生的艾美耳属球虫引起的原虫病,其引起的死亡率占肉鸡死亡率的6%-10%,每年造成的直接损失在20亿美元以上。我国肉鸡饲养以农户地面群养为主,软硬件配备相对落后,农户又经常盲目使用抗球虫药物,致使耐药虫株普遍出现,亚临床球虫病继而成为影响肉鸡健康养殖的主要问题,给球虫病的有效控制带来了很大困难。疫苗接种被认为是一种有效替代化学药物治疗的方法,然而,疫苗免疫虫株的合理组分的确定是以肉鸡饲养中球虫流行病学的调研结果为基础的,大多数国家的球虫流行病学的调查研究主要集中在那些因为病变明显而容易鉴别的几个球虫品种或者认为致病性高的几种球虫,因而病变不明显但可负面影响鸡群生产性能的早熟艾美耳球虫常被忽略。因此,要开发更加有效的疫苗,就必须对各种艾美耳球虫在不同肉鸡场的分布和流行情况进行全面的调查研究。本研究在肉鸡饲养量大的山东省进行了采样,采用卵囊形态学和PCR扩增技术,对山东省50家肉鸡场的球虫病流行情况进行了研究。针对艾美耳球虫小RNA亚单位序列或者内转录间隔片段Ⅰ(ITSⅠ)设计了七对特异性引物来鉴别球虫的种类。结果表明,50家肉鸡场都存在至少一种以上艾美耳球虫感染,其中,柔嫩艾美耳球虫90%(45/50)、早熟艾美耳球虫88%(44/50)、堆型艾美耳球虫72%(36/50)、巨型艾美耳球虫68%(34/50)、和缓艾美耳球虫60%(30/50)、毒害艾美耳球虫26%(13/50)以及布氏艾美耳球虫8%(4/50)。因此,针对于山东省内肉鸡场的高效球虫病疫苗应当至少包含早熟艾美耳球虫在内的前六种主要球虫。本研究利用球虫形态鉴定与PCR技术相结合,建立了一套适用于我国内鸡球虫诊断的方法,初步摸清了艾美耳球虫特别是早熟艾美耳球虫在小规模的肉鸡场的流行状况,为鸡球虫病有效疫苗的研制提供了数据支持。

关键词：球虫病流行情况肉鸡场流行率山东省

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The Construction of Rabbit Immunity Model against Haemaphysalis longicornis and Its Effects on *** Adult Growth

The Construction of Rabbit Immunity Model against Haemaphysa...

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者： XIE Jun-ren,LIU Guang-yuan~*,TIAN Zhan-cheng (Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province,State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Key Laboratory of Veterynary Parasitology lf Gansu Province,Key Laboratory of Grazing Animal Diseases of Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Veterynary Public Health of Ministry of Agriculture,Lanzhou Veterinary Research Institute,CAAS,Lanzhou 730046)

In this study the rabbit immunity model against Haemaphysalis longicornis was constructed by infestation with *** adult quantitatively every two *** results of ELISA showed that the antibody was positive three weeks post the first infection,with the antibody level rising with the increasing of infection and reached the peak at the 11th *** resistance of rabbit against *** significantly influenced the *** plump-blooding *** antibody level was positively correlated to the bloodsucking period and the mortality of female *** adult and negatively correlated to the weight of plump-hlooding female *** results indiated that the salivary gland is one of the main organs in the anti- *** *** maintenance of the antibody level was enough to make *** to complete a generation,which satisfied the experiment require- *** it is an ideal model for *** immunity positive control *** the same time,the specific antibody level in the serum can be one of the important indexes to evaluate whether the animal resistance to *** is strong or weak.

关键词： Haemaphysalis longicorns adult immunity model growth

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Detection of Neospora caninum in aborted bovine fetuses and dam blood samples by nested PCR and ELISA and seroprevalence in Beijing and Tianjin,China

Detection of Neospora caninum in aborted bovine fetuses and ...

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者： L.Yao,N.Yang,Q.Liu~*,M.Wang,W.Zhang,W.F.Qian,Y.F.Hu,J.Ding (Key Laboratory of Zoonosis of Ministry of Agriculture and National animal Protozoa Laboratory,College of Veterinary Medicine, China Agricultural University,Beijing 100193,China)

*** infection is a significant cause of abortion in *** investigated the tissue distribution of Neospora caninum in aborted bovine fetuses and dam blood samples by a nested PCR assay,and compared the nested PCR with ELISA in the diagnosis of *** *** six aborted fetuses and 813 blood samples were collected from eight dairy herds in Beijing(n=212) and Tianjin(n=601),*** fetuses(57.7%) were tested *** positive by the nested *** DNA was detected from the brain of 52%,kidneys of 22%,skeletal muscle of 18%,and heart of 4%of the aborted *** PCR positive cases(55%,11/20) was higher than seropositive cows(40%,8/20) in a subset of 20 fetuses,but the PCR results of blood samples of the 20 cows were all *** seroprevalence of the 813 samples was 15.5%(43.4%of samples from Beijing,5.7%of samples from Tianjin),compared to the PCR positive blood samples of 0.9%.Our study showed that the nested PCR is a valuable diagnostic tool for the primary diagnosis of *** in aborted fetuses,while ELISA is the preferred assay for testing blood samples collected from *** two assays are complementary in determining whether abortions are associated with *** infection in cattle.

关键词： Neospora caninum ELISA Nested PCR Abortion Bovine fetus

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上海和青岛城市生活污水中隐孢子虫基因型和基因亚型的分布研究

上海和青岛城市生活污水中隐孢子虫基因型和基因亚型的分布研究

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者：冯耀宇李娜段莉萍 Lihua Xiao 华东理工大学资源与环境工程学院美国疾病预防控制中心

为了解上海和青岛城市生活污水中隐孢子虫基因型和基因亚型的分布以及隐孢子虫病在当地的传播动态,我们于2006年12月到2007年4月和2008年5月到7月分别采集上海四个和青岛五个生活污水处理厂中未经处理的生活污水进行研究。采用基于SSU r... 详细信息

为了解上海和青岛城市生活污水中隐孢子虫基因型和基因亚型的分布以及隐孢子虫病在当地的传播动态,我们于2006年12月到2007年4月和2008年5月到7月分别采集上海四个和青岛五个生活污水处理厂中未经处理的生活污水进行研究。采用基于SSU rRNA基因的PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)的方法来确定隐孢子虫的基因型,并进一步对gp60基因进行PCR和测序确定隐孢子虫基因亚型。在所研究的上海90个样品中,63个为隐孢子虫阳性样本,其中10个样品为混合感染。59个样品(93.7%)中含有人隐孢子虫,另外还发现其它8个隐孢子虫虫种/基因型。对59个人隐孢子虫阳性样品中的47个成功进行了基因亚型鉴定,其中29个属于Ib亚型家族,其余的属于Ia,Id,Ie和If亚型家族。三个Ib亚型经鉴定分别为IbA19G2,IbA20G2和IbA21G2,它们与在世界上其它地区所发现的两个普遍存在的Ib亚型(IbA9G3和IbA10G2)有很大不同。同样,Ie亚型IeA12G3T3也不同于常见的IeA11G3T3亚型。青岛地区的结果与上海地区明显不同。在所研究的109个青岛样品中,75个为隐孢子虫阳性样本,其中混合感染情况明显(29)。60个(80.0%)和10个(13.3%)样品中分别合有鼠隐孢子虫和隐孢子虫大鼠基因型。在其它6个隐孢子虫虫种/基因型中可以感染人的虫种所占比例较低,分别为火鸡隐孢子虫(12.0%)和微小隐孢子虫(6.7%)。结果表明在青岛污水处理管道中鼠分布较多,由于它们分泌的隐孢子虫量大。掩盖了感染人的隐孢子虫虫种/基因型的检测。因此在人口集中、动物分布较少的地区对城市生活污水中病原体的研究可以帮助我们快速了解某疾病在当地人群中的流行动态。多种亚型家族和少见的Ib,Ie和If亚型在上海地区的存在表明隐孢子虫在上海地区的传播可能和在其它地区的传播有明显不同。

关键词：隐孢子虫传播动态基因型基因亚型

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Pharmacokinetics under the effect of self-licking behavior in eprinomectin topically-treated rabbits and its influence on clinical efficacy

Pharmacokinetics under the effect of self-licking behavior i...

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者： Huiqiang Wen~1 Fangfei Wang~1 Zhenzhong Yang~1 Lu Lv~1 Baoliang Pan~1 Yuwan Wang~2 Ming Wang~(1,*) (1.China Agricultral University,College of Veterinary Medicine,Beijing 100193 2.Beijing C.A.U Bio-technology Co., Ltd.,Beijing 100091)

Eprinomectin is a worldwide-used endectocide compound largely administered to beef and dairy cattle as a topical formulation(pour-on).The present work herein aimed to evaluate the plasma disposition of topically administered eprinomectin in rabbits,as well as that under the effect of animal self-licking *** New Zealand rabbits were given one single topical(1000 ug kg-1) administration of *** were allocated into two groups(n=5):licking group where self-licking was free and non-licking *** comprison,significant differences were observed between self-licking and non-licking groups in plasma disposition of *** contributed to in a shorter half-life of absorption(29.44±7.81 and 14.85±2.79 h in licking) and a higher Cmax value for eprinomectin (21.95±5.36 and 6.98±0.72 ng ml-1 in licking),together with a markedly shorter mean residence time (106.66±7.39 and 50.72±3.45 h in licking).More importantly,the area under the plasma curve is similar(758.56±60.97 and 733.43±80.32 ng h ml-1,respectively) for both groups,in contrast to that for ivermectin in cattle reported. Altogether,the present experiment demonstrates that pharmacokinetic profiles for eprinomectin following pour-on administration in rabbits,the effect of animal natural self-licking behavior on plasma disposition,and the relationship between drug disposition and clinical ***,it suggests that a double cattle-based dose rate can be administered for pour-on eprinomectin formulation to provide an effective and rational approach to control of ear mite in rabbits.

关键词： Pharmacokinetics under the effect of self-licking behavior in eprinomectin topically-treated rabbits and its influence on clinical efficacy

来源：评论

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猪带绦虫乳酸脱氢酶基因的序列分析、克隆表达和免疫学分析

猪带绦虫乳酸脱氢酶基因的序列分析、克隆表达和免疫学分析

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者：杜武英黄江胡旭初余新柄徐劲廖兴江戴佳琳贵阳医学院多媒体形态学实验室中山大学中山医学院寄生虫学教研室

目的利用生物信息学方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中识别乳酸脱氢酶A的基因(lactate dehydrogenaseA,LDH-A),分析和预测其编码蛋白的结构和功能,并对其进行克隆、表达和免疫学特性的初步研究。方法利用生物信息学网站如NCBI和ExPASy中有... 详细信息

目的利用生物信息学方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中识别乳酸脱氢酶A的基因(lactate dehydrogenaseA,LDH-A),分析和预测其编码蛋白的结构和功能,并对其进行克隆、表达和免疫学特性的初步研究。方法利用生物信息学网站如NCBI和ExPASy中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别乳酸脱氢酶A(TsLDH-A)的基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白的结构与功能;并将Ts LDH-A克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定及用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化产物用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果该基因全长1332 bp,编码331个氨基酸。其氨基酸序列与其它物种LDH-A氨基酸序列一致性可达54%,具有乳酸脱氢酶保守结构域。其编码的蛋白理论分子量和等电点分别为35461.1 Da和7.09;有3个跨膜区,元亚细胞定位序列;具有多个磷酸化位点,蛋白的理化性质较稳定。预测有四个主要的B细胞抗原表位,L-乳酸脱氢酶活化位点之一的His192包含于表位190-199 aa中。酶催化位点的三个关键氨基酸在不同物种中保守,在空间结构上位置相互靠近。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-Ts LDH-A构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白能被Ts LDH-A重组蛋白免疫的SD大鼠血清、感染了猪带绦虫的病人血清及猪血清识别,表明其具有较好的免疫原性和免疫反应性。结论应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了Ts LDH-A的全长序列并预测得到其编码蛋白的结构与功能方面的信息,该基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

关键词：猪带绦虫乳酸脱氢酶A 序列分析克隆表达免疫学特性

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Molecular identification and sequence analysis variability two mitochondrial DNA regions and internal transcribed spacer of rDNA for tapeworm parasites

Molecular identification and sequence analysis variability t...

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者： R.S.Dai~(1,2),G.H.Liu~(1,2),W.Liu~2,Y.Liu~(1*),X.Q.Zhu~(1**) (1.College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong province 510642, PR China 2.College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,Hunan province,PR China)

Sequence variability in two mitochondrial DNA(mtDNA) regions and internal transcribed spacer of rDNA, namely cytochrome c oxidase subunit 1(cox1) and NADH dehydrogenase subunit 4(nad4),among and within tapeworm,***,***,*** and *** from different geographical origins was examined by a mutation scanning approach.A portion of the cox1 gene(pcox1),nad4 genes(pnad4) and ITS were amplified separately from individual tapeworm by polymerase chain reaction(PCR).Representative samples displaying sequence variation were subjected to sequencing in order to define genetic markers for their specific identification and *** the intra-specific sequence variations within each of the four tapeworm species were 0-0.7% for pcox1,0-1.7%for pnad4 and 0.1-3.6%for ITS,the inter-specific sequence differences were significantly higher,being 12.1-17.6%for pcox1,18.7-26.2%for pnad4 and 31-75.5%for ITS,*** analy- ses based on the combined sequences of peox1 and pnad4 revealed that the recently described species *** was more closely related to *** than to *** findings provided mtDNA evidence for the validity of *** and also demonstrated clearly the usefulness and attributes of the mutation scanning-sequencing approach for studying the population genetic structures of these and other tapeworm of socio-economic importance.

关键词： Genetic variation Mitochondrial DNA(mtDNA) Internal transcribed spacer Ribosomal DNA Tapeworm

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Functional Replacement of the FabD Protein of Escherichia coli Fatty Acid Synthesis by Eimeria tenella MCAT Homologue

Functional Replacement of the FabD Protein of Escherichia co...

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会

作者： Sun Ming-fei~(1,2),Zhu Guan~3,Qin Zong-hua~(1,2),Yuan Jian-feng~(1,2),Yu Jin-shu~(1,2),Lv Min-na~(1,2), Wu Cai-yan~(1,2),Xie Ming-quan~(1,2),Cai Jian-ping~(1,2) (1.Institute of Veterinary Medicine,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou,510640 2.Guangdong Common Lab of Veterinary Public Health,Guangzhou,510640 3.Lab of Molecular Parasitology,School of Veterinary and Biomedicine Science,Texas A&M University,USA)

TypeⅡfatty acid biosynthetic system is an essential process for bacteria,apicomplexans and some plants ***,Escherichia coli provides the paradigm for the ***,little was known about the fatty acid metabolism in Eimeria spp(apicomplexans).Here,we report a *** homologous gene(EtMCAT) to *** fabD,the protein shows 37%homology to *** FabD amino acid sequence in the coding region for the mature ***,the predicted structure of EtMCAT is similar to *** FabD crystal structure except for a few differences in secondary structure *** replacement of fabD gene with amber mutation of *** temperature-sensitive LA2-89 strain by *** MCAT homologue using homologous recombination with suicide plasmid pDS132,the transgenic *** strain which fabD gene with an amber mutation was replaced by cDNA encoding mature *** MCAT could restore growth at non-permissive temperature(39℃).The results demonstrated the functional complementation and direct function of *** our knowledge,this is the first functional evidence supporting the identification of *** cDNA for MCAT.

关键词： Eimeria tenella Escherichia coli TypeⅡfatty acid biosynthetic Homologous gene Functional replacement Malonyl-CoA:ACP transacylase

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