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13 篇 中国农业科学院哈...
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9 篇 山东省农业科学院...
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中国大陆H9N2亚型禽流感病毒遗传演化研究

中国大陆H9N2亚型禽流感病毒遗传演化研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：李呈军井波余丹丹邓国华田国彬李雁冰于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所全国畜牧兽医总站中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室

H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛流行。我国是在1994年从广东省的一个鸡场中分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒,尽管此后采取了一系列的根除措施,但是由该亚型禽流感病毒引起的疾病并未得到有效的控制,特别是在1998以后发生了H9N2... 详细信息

H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛流行。我国是在1994年从广东省的一个鸡场中分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒,尽管此后采取了一系列的根除措施,但是由该亚型禽流感病毒引起的疾病并未得到有效的控制,特别是在1998以后发生了H9N2亚型禽流感的爆发和流行,使该亚型禽流感病毒在全国范围内广泛分布,给养禽业带来了极其严重的危害。本研究中对1994-2002年中国大陆分离到的27株H9N2亚型禽流感病毒进行了全基因组序列测定和遗传演化分析。结果表明,中国大陆H9N2亚型禽流感病毒主要是欧亚种系,但是也分离到北美种系病毒。多数病毒都是重排病毒,其基因来源于QA/HK/G1D7,DK/HK/Y280/97,DK/HK/Y439D7和未知病毒,根据进化分析结果将这27株病毒划分为10个基因型。同时,进化分析表明在进化树中密切相关的病毒反映出时间参数而不是地域参数,表明病毒出现后并不局限于该区域,而是蔓延到临近的省份或在全国范围内流行。

关键词：禽流感病毒 H9N2亚型遗传演化研究

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妊娠和非妊娠母猪整体蛋白质周转代谢研究

妊娠和非妊娠母猪整体蛋白质周转代谢研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：吴德杨凤周安国王之盛王康宁四川农业大学动物营养研究所四川农业大学动物营养研究所四川农业大学动物营养研究所四川农业大学动物营养研究所四川农业大学动物营养研究所

本研究选取年龄、体重、发情期相近的长白♂×梅山♀后备母猪6头,其中3头配种,3头空怀,当试验开始后的第3、30、85、100天时,分别饲养于代谢笼中进行6天代谢试验,一个代谢笼一个重复。妊娠期采用同一饲粮（DE13.38MJ/kg,CP13.5%）,... 详细信息

本研究选取年龄、体重、发情期相近的长白♂×梅山♀后备母猪6头,其中3头配种,3头空怀,当试验开始后的第3、30、85、100天时,分别饲养于代谢笼中进行6天代谢试验,一个代谢笼一个重复。妊娠期采用同一饲粮（DE13.38MJ/kg,CP13.5%）,不同妊娠阶段母猪采食量是通过维持需要（M）的倍数（ADE）确定,即前期1.1倍维持需要,中期1.2倍维持需要,后期2倍维持需要。用[5N]Glycine单剂量终产物法（三库模型）研究了妊娠和非妊娠母猪在不同阶段整体蛋白质代谢的周转速率以及氨基酸利用效率的差异。试验结果表明:刚配种时,妊娠母猪氨基酸代谢库N流量,蛋白质的合成速率,降解速率,沉积速率以及周转速率与非妊娠母猪间均差异不显著（P>0.05）;妊娠35天时,妊娠母猪蛋白质合成速率,降解速率、周转速率分别比非妊娠母猪下降了12.6%,14.46%,13.5%（P<0.05）,但沉积速率提高了25%（P<0.05）;在妊娠87天以后,妊娠母猪与非妊娠母猪相比,氨基酸代谢库氮流量提高63.9%（P<0.01）,周转速率增加73.38%（P<0.01）,蛋白质合成速率和降解速率分别提高72.30%和70.80%（P<0.01）,蛋白质的沉积速率增加63.33%（P<0.01）,同时,妊娠母猪的内源尿氮排泄速率和氨基酸的氧化速率分别降低（P<0.05）34.42%、50%,氨基酸重复利用速率增加83.33%（P<0.01）,从而使氨基酸的净利用效率提高了30%（P<0.05）。

关键词：妊娠母猪整体蛋白质周转三库模型

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用鸡体偏嗜性密码子对H5亚型禽流感病毒HA基因的优化与构建及其DNA疫苗体外表达研究

用鸡体偏嗜性密码子对H5亚型禽流感病毒HA基因的优化与构建及其DN...

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：姜永萍李呈军张洪波步志高张芳芳于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室农业部畜牧兽医总站中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室

不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异。为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD... 详细信息

不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异。为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD,1/96(H5N1)]的HA基因(optiHA),并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质粒pCIHA和pCIoptiHA分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24-48小时293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Western-blot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的基因optiHA体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因。这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础。

关键词： HA基因密码子优化重叠延伸PCR 间接免疫荧光 Western blot检测

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早期日粮精氨酸对鸡淋巴器官和免疫力的长期影响

早期日粮精氨酸对鸡淋巴器官和免疫力的长期影响

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：邓凯东 C.W.Wong J.V.Nolan 澳大利亚新英格兰大学动物科学系澳大利亚新英格兰大学动物科学系澳大利亚新英格兰大学动物科学系

一日龄依莎褐蛋鸡雄性雏鸡180只分入18只育雏笼中,每笼饲喂如下3种日粮之一:1)精氨酸缺乏的基础日粮(6.7 g/kg,对照);2)基础日粮+2.7 g L-精氨酸/kg(LA);3)基础日粮+5.4 g L-精氨酸/kg(HA)。对照、LA和HA日粮的精氨酸水平分别相当NRC标... 详细信息

一日龄依莎褐蛋鸡雄性雏鸡180只分入18只育雏笼中,每笼饲喂如下3种日粮之一:1)精氨酸缺乏的基础日粮(6.7 g/kg,对照);2)基础日粮+2.7 g L-精氨酸/kg(LA);3)基础日粮+5.4 g L-精氨酸/kg(HA)。对照、LA和HA日粮的精氨酸水平分别相当NRC标准的70、100和130%。试验期共为12周:前4周内饲喂试验日粮,在随后的8周內所有动物均饲喂同一生长蛋鸡商品饲料(8.9 g精氨酸/kg)。各试验阶段均自由采食和饮水。每隔4周测定一次生长性能、淋巴器官(胸腺、法氏囊和脾脏)重量、血清抗绵羊红细胞(SRBC)和抗牛血清白蛋白(BSA)的初级抗体水平,以及趾间皮肤对植物血凝素(PHA)的增厚反应(为活体细胞免疫水平的指标)。在前4周内,与对照日粮相比,LA或HA日粮显著提高了(P<0.05)体增重和采食量,但该效应并未延续至随后的8周内。精氨酸水平对各阶段饲料转化率无显著影响。在4周时,LA组对BSA的IgG抗体水平显著低于对照组(P<0.05),但该效应并未延续至第8周或第12周。在第12周时,LA组对BSA的IgM抗体水平却显著高于对照组(P<0.05),而该效果在第4周或第8周时并不存在。在第8周时,LA或HA组的法氏囊相对重量显著低于(P<0.05)对照组,HA组对SRBC的抗体水平则显著高于对照组(P<0.05),而这些效果在其他时间并未观测到。日粮精氨酸对胸腺和脾脏的相对重量、趾间皮肤PHA反应均无显著影响。该研究表明,满足生长需要的早期日粮精氨酸水平可增强鸡在稍后生长阶段对某些抗原的体液免疫水平,但对细胞免疫能力无显著作用。

关键词：精氨酸基础日粮采食量饲喂试验法氏囊相对重量植物血凝素体增重牛血清白蛋白淋巴器官长期影响

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携带新城疫病毒DNA疫苗鼠伤寒沙门氏菌的安全性和免疫效力试验

携带新城疫病毒DNA疫苗鼠伤寒沙门氏菌的安全性和免疫效力试验

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：潘志明焦新安黄金林唐丽华张辉张成全刘秀梵扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室

将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207(pVAX1-F)分别以不同剂量口服免疫1日龄雏鸡,结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-F)对雏鸡具有良好的安全性,且不影响鸡的增重。将重组菌SL7207(pVAX1-F)分别以108CFU和109CFU的剂量三次口服免疫1日龄商品代伊... 详细信息

将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207(pVAX1-F)分别以不同剂量口服免疫1日龄雏鸡,结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-F)对雏鸡具有良好的安全性,且不影响鸡的增重。将重组菌SL7207(pVAX1-F)分别以108CFU和109CFU的剂量三次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,血清和小肠粘膜抗体效价检测结果显示,SL7207(pVAX1-F)能激发机体产生体液免疫应答,在三免后1周,SL7207(pVAX1-F)109CFU剂量组的血清抗体效价与空载体组和空白对照组之间存在显著性差异(p<0.05)。重组菌SL7207(pVAX1-F)108CFU和109CFU两个剂量组在首免后2周开始出现粘膜抗体,并于二免后2周和3周达到较高水平。免疫保护试验结果显示,SL7207(pVAX1-F)109 CFU剂量组对鸡具有良好的保护率(77.27%),与空白对照组和SL7207(pVAX1)空载体组之间存在显著性差异(p<0.05),说明重组细菌SL7207(pVAX1-F)能提供NDV强毒攻击良好的免疫保护作用,预示着该疫苗候选株在新城疫控制中有重要应用前景。

关键词：减毒沙门氏菌 DNA疫苗新城疫病毒安全性免疫效力

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抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的构建及其免疫效力研究

抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的构建及其免疫效力研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：彭金美童光志王云峰仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗。它是用表位作免疫原,这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。本试验以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了4个重组质... 详细信息

多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗。它是用表位作免疫原,这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。本试验以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了4个重组质粒:1、pIRES/HA(表达全长的HA基因);2、pIRES/tHA(只表达HA基因的主要抗原表位区):3、pIRES/tHA-NPep(融合表达HA基因的抗原表位区和NP基因的三个CTL表位);4、pIRES/tHA-NPep-IFN-γ,(用鸡的IFN-γ基因取代质粒pIRES/tHA-NPep中的neo基因)。分别用这四个重组质粒和空载体质粒pIRESlneo肌注免疫30日龄SPF鸡。免疫三次,间隔为两周,每次每只鸡的剂量为200μg。第三次免疫后两周以高致病性禽流感病毒H5N1强毒攻击,免疫及攻毒前后均采血检测HI抗体效价和外周血CD4+、CD8+T细胞的变化。结果,攻毒前各质粒免疫组均检测不到HI抗体,攻毒后一周存活鸡HI抗体效价迅速升高到64-256。流式细胞术检测外周血CD4+、CD8-T细胞在疫苗免疫后都有不同程度的升高。载体质粒对照组鸡(10只)在攻毒后3-8天内全部死亡,其他各质粒免疫组鸡都获得了部分保护,保护率分别是,pIRES/HA组为54.5%(6/11),pIREStHA组为30%(3/10),pIRESHA1NPep组为36.3%(4/11),pIRESHA1NPep-IFN-γ组为50%(5/10)。这些结果表明我们构建的多表位DNA疫苗能够诱导机体产生特异性免疫应答,并在同型禽流感强毒攻击时对鸡只提供了一定的保护。

关键词：多表位DNA疫苗禽流感病毒

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共表达H5N1、H7N1亚型AIV HA与鸡IL-18多价重组鸡痘病毒免疫保护性研究

共表达H5N1、H7N1亚型AIV HA与鸡IL-18多价重组鸡痘病毒免疫保护...

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：马鸣潇金宁一王振国郑敏尹革芬金扩世夏志平长春军事兽医研究所全军重点基因工程实验室长春军事兽医研究所全军重点基因工程实验室长春军事兽医研究所全军重点基因工程实验室长春军事兽医研究所全军重点基因工程实验室长春军事兽医研究所全军重点基因工程实验室长春军事兽医研究所全军重点基因工程实验室长春军事兽医研究所全军重点基因工程实验室

用本实验室构建的3株重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,以106 PFU剂量经翼蹼免疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghom蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照。免疫后测定HI抗体效价、淋巴细胞转化指标、重组... 详细信息

用本实验室构建的3株重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,以106 PFU剂量经翼蹼免疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghom蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照。免疫后测定HI抗体效价、淋巴细胞转化指标、重组疫苗对增重的影响、免疫后的攻毒保护效力、免疫后的抑制排毒情况。于免疫后7d、14d、21d分别测定特异性抗体和淋巴细胞刺激指数。试验结果表明,3株重组鸡痘病毒株均能诱导鸡体产生血凝抑制抗体(HI);共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18诱导商品蛋鸡的细胞免疫水平明显高于非共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA。用重组鸡痘疫苗免疫SPF和商品蛋鸡后第21d攻毒,rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫攻毒保护率达100%,rFPV-H5HA免疫攻毒保护率达90%,与常规疫苗相当。免疫的商品蛋鸡于攻毒后7d采集泄殖腔棉试子样品,检测排毒情况。结果表明,rFPV-HSHA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL8免疫组在攻毒后第7d无排毒,其抑制免疫鸡排毒效果优于常规疫苗和单独表达HA的rFPV-H5HA重组鸡痘病毒。rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组鸡,在14日龄时的体重明显高于rFPV-H5HA免疫组和常规疫苗对照免疫组,表明共表达的鸡IL-18能降低鸡痘病毒载体对雏鸡增重的影响。

关键词：禽流感病毒重组鸡痘病毒疫苗实验免疫血凝素白介素18

来源：评论

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犬、狐、貉粪样中犬冠状病毒的检测及基因型分析

犬、狐、貉粪样中犬冠状病毒的检测及基因型分析

引用

中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：王玉燕马光刚陆承平温海南京农业大学农业部动物疫病诊断及免疫重点实验室南京农业大学农业部动物疫病诊断及免疫重点实验室南京农业大学农业部动物疫病诊断及免疫重点实验室南京农业大学农业部动物疫病诊断及免疫重点实验室

自2003年7月至2004年4月间收集犬粪样129份,其中南京地区家庭单养的腹泻犬粪样43份,犬场群养健康犬粪样30份;沈阳地区群养健康犬粪样39份;昆明地区群养健康犬粪样12份,腹泻粪样5份;安徽某养殖场健康狐粪样61份、貉粪样24份。用套式PCR(R... 详细信息

自2003年7月至2004年4月间收集犬粪样129份,其中南京地区家庭单养的腹泻犬粪样43份,犬场群养健康犬粪样30份;沈阳地区群养健康犬粪样39份;昆明地区群养健康犬粪样12份,腹泻粪样5份;安徽某养殖场健康狐粪样61份、貉粪样24份。用套式PCR(RT-nPCR)方法检测犬冠状病毒(CCV)并进行基因型鉴定。结果显示,健康犬粪样中Ⅱ型CCV的检出率南京为80.0%(24/25),沈阳为87.2%(34/39),昆明为100%(12/12),健康狐粪样为70.5%(43/61)貉为91.7%(22/24),地区之间差别不大,但都高于南京和昆明腹泻犬粪便中CCV Ⅱ型检出率,41.9%(18/43)和40.0%(2/5)。Ⅰ型CCV的检出结果:南京和沈阳的犬粪样中没有检测到Ⅰ型CCV;1份昆明腹泻犬粪样为CCV Ⅰ型阳性;29份狐粪样为CCV Ⅰ型阳性,其中25份同时也是CCV Ⅱ型阳性,两型混合感染率为41.0%;16份貉粪样为CCV Ⅰ型阳性(66.7%),同时也是CCV Ⅱ型阳性。对部分Ⅰ型和Ⅱ型CCV阳性样本进行测序分析,结果显示,所得Ⅱ型CCV序列都与CCV 1-71及来自中国大熊猫CCV的M基因序列有很高的同源性,分别在96.5-99.5%和95.8-99.1%之间,与TGEV的同源性(93.4-97.2%)高于Ⅰ型FCoV代表株UCD1(77.8-81.6%)和Ⅱ型FCoV代表株FIPV 79-1683(75.9-79.7%)。狐源与貉源CCV Ⅰ型序列与GenBank上Ⅰ型CCV同源性最高(96.7%-98.1%)。来自昆明的Ⅰ型CCV序列在系统进化树上处于Ⅰ和Ⅱ型CCV之间,可能是一个新的变异株。本研究证实在国内健康犬、狐、貉群中普遍存在CCV的感染,CCV Ⅱ型的感染较为普遍,CCC Ⅰ型感染呈局域型分布,并首次从貉粪样中检测到CCV。

关键词：套式PCR 犬冠状病毒 CCVⅠ型 CCVⅡ型狐貉

来源：评论

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玻璃化冷冻牛卵母细胞支持体细胞克隆胚的体内外发育研究

玻璃化冷冻牛卵母细胞支持体细胞克隆胚的体内外发育研究

引用

中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

本研究目的是研究牛卵母细胞经玻璃化冷冻后的体内外发育能力及对克隆胚发育的支持。采用EDFS30、EDFS40、EDFSF30和EDFSF40玻璃化冷冻液,对牛体外成熟培养16h的卵母细胞实施OPS法冷冻保存,冷冻解冻后卵母细胞的存活率分别为77.0%和79.1... 详细信息

本研究目的是研究牛卵母细胞经玻璃化冷冻后的体内外发育能力及对克隆胚发育的支持。采用EDFS30、EDFS40、EDFSF30和EDFSF40玻璃化冷冻液,对牛体外成熟培养16h的卵母细胞实施OPS法冷冻保存,冷冻解冻后卵母细胞的存活率分别为77.0%和79.1%及97.2%和97.5%。利用A23187和6-DMAP联合化学激活后其囊胚发育率达10.3～23%,与对照组(33.2%)差异不显著(P>0.05)。并用722枚卵母细胞进行体细胞克隆牛的制备,融合343枚(47.6%),经过7天培养后有56枚(16.3%)重构胚发育至囊胚,其中24枚胚胎移植给6头同期处理的受体母牛,其中2头受体妊娠(33.3%),流产1头。另一头于妊娠263天分娩。结果表明用玻璃化冷冻解冻的牛卵母细胞可以支持体细胞克隆胚胎的体内外全程发育。

关键词： OPS法玻璃化冷冻卵母细胞牛核移植卵子激活胎儿成纤维细胞

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鸡体偏嗜性密码子优化免疫原基因增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果

鸡体偏嗜性密码子优化免疫原基因增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保...

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高张芳芳于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室农业部畜牧兽医总站中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室

利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR法及限制酶切法构建了密码子优化的A/Goose/GuangDong/1,96(H5N1)[GD/1,96(H5N1)]的HA基因(optiHA),并将其插入CMV启动予表达栽体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA。将pCIopfiHA和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白;随之将pCIoptiHA及pCIHA分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果,间接免疫荧光法和Western-blot分析表明密码子优化的HA基因表达水平显著高于野生型HA基因;免疫SPF鸡后,100μg pCIoptiHA可形成75%的免疫保护,100μg pCIHA可形成50%的免疫保护;10μg pCIoptiHA可形成对免疫鸡75%的部分免疫保护,而10μg pCIHA则基本不能形成免疫保护;pCIoptiHA诱导的m抗体水平远远高于pCIHA。试验结果表明,HA基因密码子的优化可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果。

关键词：禽流感 H5亚型 DNA疫苗免疫保护

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