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表达载体的优化显著增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果

表达载体的优化显著增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：姜永萍张洪波李呈军张芳芳步志高于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部畜牧兽医总站中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/堕医生物技术国家重点实验室

CAGGS含鸡β-actin启动子和CMV增强子,是一种高效真核表达载体。将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA,将pCAGGHA和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24-48小时293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白,Western-blot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI。为进一步评估不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响,DNA疫苗质粒pCIHA及pCAGGHA分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后分别用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果,100μg pCAGGHA可形成100%的免疫保护,100μg pCIHA可形成50%的免疫保护;10μg pCAGGHA可形成对免疫鸡100%的免疫保护,而10μg pCIHA则基本不能形成免疫保护;pCAGGHA诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA。试验结果表明,鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果。

关键词：禽流感 H5亚型鸡β-actin启动子 DNA疫苗免疫保护

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我国部分猪瘟流行毒株病原学特性研究

我国部分猪瘟流行毒株病原学特性研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：王琴王在时宁宜宝丘惠深赵耘张广川范学政沈青春秦玉明涂长春余兴龙吕宗杰徐欣然李红卫中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所解放军军需大学解放军军需大学解放军军需大学解放军军需大学解放军军需大学

目前猪瘟遍布全世界,根据OIE制定的《国际动物卫生法典》(2003年版),猪瘟被列为A类16种法定传染病之一,全世界现有50个国家和地区存在猪瘟。在我国按年饲养量接近10亿头计算,发病死亡按5-10%计,猪瘟每年给我国造成的经济损失近100亿,对... 详细信息

目前猪瘟遍布全世界,根据OIE制定的《国际动物卫生法典》(2003年版),猪瘟被列为A类16种法定传染病之一,全世界现有50个国家和地区存在猪瘟。在我国按年饲养量接近10亿头计算,发病死亡按5-10%计,猪瘟每年给我国造成的经济损失近100亿,对我国养猪业的危害极其严重。通过实验证实,猪瘟兔化弱毒疫苗疫苗(HCLV)虽然效果优良,但由于各种原因,该病仍在我国不间断流行。为了调查我国猪瘟的流行病学数据,获得系统和完整猪瘟病毒流行株的遗传变异情况、基因多态性分布及其与病毒致病性和免疫原性的关系的研究资料,为消灭猪瘟提供技术指导。1995年来我们从全国26个省市自治区收集了并鉴定了258份猪瘟病料,开展了流行株病原学特性差异研究。通过对不同流行株的发病地区、单抗反应性、致病力、基因分型和持续感染动物模型的建立等抗原性差异方面的研究,初步建立了我国猪瘟部分流行株的数据库。阐明了我国猪瘟的流行特点具有遗传多样性现状,揭示了我国猪瘟流行的复杂态势,表明了猪群的随意流动是传播与扩散该病的重要原因;还表明我国猪瘟流行株在病原致病力及抗原特性方面具有复杂性和多样性,尽管如此免疫保护试验证明目前使用的HCLV完全能对各种毒力、各种抗原性的不同流行流行株提供有效的保护。另外通过毒力测定证明了我国猪瘟流行流行株有高、中、低3种毒力之分,采用低毒力流行株进行了猪瘟病毒胎盘垂直传播(持续感染)及水平传播的研究,在国内外首次人工复制并建立了猪瘟持续性感染动物模型。证实了在田间外表健康的持续性感染和不完全免疫猪是我国发生猪瘟的重要传染来源。为阐明我国猪瘟流行株病原学特性的多样性及差异性,尤其为免疫失败的原因提供了科学依据,本研究对我国猪瘟防制具有重要的指导意义。

关键词：猪瘟猪瘟病毒流行病学病原学特性持续感染

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中国南方鸭源H5N1亚型禽流感病毒的进化

中国南方鸭源H5N1亚型禽流感病毒的进化

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

二十世纪八十年代中期,H5N1亚型禽流感病毒(AIV)在进化过程中即表现出了对哺乳动物的致病力。本研究对中国大陆1999-2002年从健康家鸭中分离的21株H5N1亚型AIV进行了系统研究,发现这些病毒与为1997年香港禽流感病毒提供了血凝素基因的A/... 详细信息

二十世纪八十年代中期,H5N1亚型禽流感病毒(AIV)在进化过程中即表现出了对哺乳动物的致病力。本研究对中国大陆1999-2002年从健康家鸭中分离的21株H5N1亚型AIV进行了系统研究,发现这些病毒与为1997年香港禽流感病毒提供了血凝素基因的A/goose/Gguangdong/1/96(H5N1)(GSGD/1/96)的抗原性相同。所有21株病毒对鸡均呈高致病性,根据它们在鼠体内复制和对鼠的致死能力分为4种致病型,这些毒株对小鼠的致病力随分离时间不同呈逐渐增长趋势。对6株代表病毒进行了鸭子感染试验,发现5株可以通过气管和泄殖腔排毒,而所有6株病毒均不能引起鸭子发病和死亡。遗传进化分析表明大部分毒株的基因组是由A/goose/Gguangdong/1/96相似的HA基因和另外来源于未知欧亚AIV病毒的7个基因组成。本研究结果建议,应立即采取措施防止健康鸭所携带的高致病力禽流感病毒(HPAIV)对鸡和哺乳动物的传播。

关键词：哺乳动物禽流感病毒 AIV

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表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-ILTVgB)的稳定性,我们对重组病毒第6代和16代进行克隆纯化,对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传代20代.结果发现第6代纯化病毒(rFPV-ILTVgB-C6)在传代过程中有白斑出现... 详细信息

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-ILTVgB)的稳定性,我们对重组病毒第6代和16代进行克隆纯化,对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传代20代.结果发现第6代纯化病毒(rFPV-ILTVgB-C6)在传代过程中有白斑出现,说明病毒纯度不够;经过16代纯化的病毒(rFPV-ILTVgB-C16)对细胞的嗜性加强,病毒的效价进一步升高,20代传代后蓝斑率仍然为100%,PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传。抽取病毒细胞传代过程中的第5,10,15,20代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种2周龄SPF鸡,20天后分为两组,分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株攻击,结果不同代次的(?)组病毒均可以使免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击。鸡体内病毒传代试验表明,重组病毒在接种部位仅存在6天,之后就检测不到病毒,重组病毒通过SPF鸡连续传代,不存在病毒返祖的可能。由此可以得出一个结论,rFPV-ILTVg在结构上和免疫原性上是稳定的,无论是在体外传代,还是在体内均可以稳定遗传,不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能,完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发。

关键词：传染性喉气管炎鸡痘重组鸡痘病毒遗传稳定性

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猪背最长肌肌纤维类型的发育性变化及其品种和性别特点

猪背最长肌肌纤维类型的发育性变化及其品种和性别特点

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：杨晓静赵茹茜陈杰胥清富韦习会陈杰南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室

四种肌球蛋白重链的异构体(MyHCI、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b)分别特征性地对应四种不同类型的肌纤维(I、2a、2x和2b)。本实验选用生长速度快,但肉质较差的瘦肉型猪大白猪和生长速度慢,但肉质较好的肥胖型猪二花脸作为实验动物,采用相对定... 详细信息

四种肌球蛋白重链的异构体(MyHCI、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b)分别特征性地对应四种不同类型的肌纤维(I、2a、2x和2b)。本实验选用生长速度快,但肉质较差的瘦肉型猪大白猪和生长速度慢,但肉质较好的肥胖型猪二花脸作为实验动物,采用相对定量RT-PCR方法,测定背最长肌中I、2a、2x和2b四种MyHC mRNA基因的表达,以探讨二花脸猪和大白猪背最长肌中I、2a、2x和2b四种肌纤维类型比例的发育性变化,并分析其品种和性别特点。结果表明:(1)3日龄MyHC I型和2a型肌纤维的比例较高,2b型几乎没有分化;(2)从3日龄到20日龄肌纤维组成发生了急剧的变化,MyHC I型和2a型表达下调,比例下降,2b型肌纤维显著上升(p<0.05),且品种间无显著差异;(3)90日龄以后,二花脸公猪背最长肌中MyHC I型和2a型的比例均显著高于大白猪,同时,大白猪背最长肌中酵解型肌纤维2b的比例增加迅速,显著地高于二花脸(p<0.05);(4)性别间比较,MyHC I型纤维的比例无显著差异, 90日龄和180日龄,二花脸母猪的MyHC 2b的比例显著高于二花脸公猪(p<0.05)。以上结果提示:大白猪和二花脸猪背最长肌肌纤维类型的差异主要表现在90日龄后,大白猪I型纤维比例的显著下降和2b型纤维比例的显著增加与其肌肉的快速沉积有关;而二花脸猪背最长肌较高比例的MyHC I型和2a型纤维与其优良的肉质相关。

关键词：猪背最长肌 MyHC I MyHC 2a MyHC 2x MyHC 2b

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喹烯酮在猪体内的残留研究

喹烯酮在猪体内的残留研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：黄玲利范盛先肖爱国陈品殷居易刘登才邱银生袁宗辉农业部食品安全评价重点开放实验室农业部兽药残留检测基准实验室华中农业大学兽药研究所农业部食品安全评价重点开放实验室农业部兽药残留检测基准实验室华中农业大学兽药研究所农业部食品安全评价重点开放实验室农业部兽药残留检测基准实验室华中农业大学兽药研究所农业部食品安全评价重点开放实验室农业部兽药残留检测基准实验室华中农业大学兽药研究所农业部食品安全评价重点开放实验室农业部兽药残留检测基准实验室华中农业大学兽药研究所农业部食品安全评价重点开放实验室农业部兽药残留检测基准实验室华中农业大学兽药研究所农业部食品安全评价重点开放实验室农业部兽药残留检测基准实验室华中农业大学兽药研究所农业部食品安全评价重点开放实验室农业部兽药残留检测基准实验室华中农业大学兽药研究所

研究新型抗菌促生长剂喹烯酮在猪体内的分布与消除规律。3月龄健康长大猪30头,连续混饲100m/kg的喹烯酮10天,分别于给药第7天和停药后0、5、10、15天各宰杀6头,雌雄各半,取肌肉、脂肪、肾脏和肝脏,采用HPLC法检测各组织中喹烯酮、脱二氧... 详细信息

研究新型抗菌促生长剂喹烯酮在猪体内的分布与消除规律。3月龄健康长大猪30头,连续混饲100m/kg的喹烯酮10天,分别于给药第7天和停药后0、5、10、15天各宰杀6头,雌雄各半,取肌肉、脂肪、肾脏和肝脏,采用HPLC法检测各组织中喹烯酮、脱二氧和3-甲基-喹恶啉-2-羧酸的含量。结果表明,喹烯酮与脱二氧用药第7天在部分动物肝脏中检出少量,停药后四种组织中均未检测到。3-甲基-喹恶啉-2-羧酸主要存在于肝脏组织中,用药第7天和停药第0天浓度分别为0.19±0.06μg/g和0.13±0.03μg/g,停药5天后未检出。肾脏中在用药第7天可检出3-甲基-喹恶啉-2-羧酸0.027±0.013μg/g。以上结果说明,喹烯酮在猪体内消除很快。3-甲基-喹恶啉-2-羧酸在肝脏中残留的量最大、时间最长,故确定喹烯酮经猪体代谢后残留的靶组织为肝脏,标识残留物为3-甲基-喹恶啉-2-羧酸。

关键词：喹烯酮猪消除靶组织标识残留物

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环丙沙星对链球菌病猪免疫反应的影响研究

环丙沙星对链球菌病猪免疫反应的影响研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：卿柳庭袁宗辉华中农业大学兽药研究所华中农业大学兽药研究所

为研究环丙沙星对链球菌病猪免疫反应的影响,取7周龄长大杂交猪24头,体重(25.5士1.4)kg),随机均分为空白组、阴性组、阳性组和试验组。阴性组和试验组人工复制猪链球菌病亚急性模型,空白组和阳性组用生理盐水代替菌液安慰接种,阳性组和... 详细信息

为研究环丙沙星对链球菌病猪免疫反应的影响,取7周龄长大杂交猪24头,体重(25.5士1.4)kg),随机均分为空白组、阴性组、阳性组和试验组。阴性组和试验组人工复制猪链球菌病亚急性模型,空白组和阳性组用生理盐水代替菌液安慰接种,阳性组和试验组于接种后第7天由耳静脉推注环丙沙星,空白组和阴性组用生理盐水代替环丙沙星安慰给药。接种后第0、7、14、21、28天,自前腔静脉采血,用显微镜法计数白细胞总数,姬姆萨染色法作白细胞分类计数,硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验定量检测嗜中性白细胞吞噬功能, 噻唑蓝(MTT)比色法检测外周血中淋巴细胞转化,单向免疫扩散法测定血清IgG浓度,50%溶血试验测定血清中补体总活性,同时,用植物血凝素(PHA)皮肤试验检测迟发型超敏(DTH)反应。结果表明:环丙沙星能缓解链球茵病所致的白细胞增高血症,升高感染猪外周血中淋巴细胞百分含量,相对降低嗜中性白细胞百分含量;能增强感染猪嗜中性白细胞吞噬功能,接种后第14、21、28天,给药和接种细菌感染两因素交互作用极显著(p<0.01),二者共同使试验组猪嗜中性白细胞还原NBT能力极显著高于空白组(p<0.01);能加强PHA刺激感染猪淋巴细胞体外增殖能力,接种后,PHA刺激感染猪淋巴细胞增殖指数(SI),均极显著低于空白组(p<0.01),但试验组猪用药后第21天恢复,与空白组猪无显著差异(p>.05),且极显著高于阴性组(p<0.01);能增强感染所致的猪DTH反应下降,阴性组于接种后第21天,DTH反应显著低于空白组,但试验组却极显著高于空白组和阴性组(p<0.01);抑制IgG合成,从而使试验组猪于接种后第14天IgG水平显著低于阴性组(p<0.05),与空白组差异不显著(p>.05),而阴性组此时IgG极显著高于空白组(p<0.05);使感染猪血清补体总活性于接种后第7天显著低于空白组(p<0.05),此后回升,于第28天,显著高于阴性组(p<0.05)。总之,环丙沙星在治疗过程中,虽然增强了机体细胞免疫功能及补体总活性,却对IgG的合成具有抑制作用。从而为揭示链球茵、机体和环丙沙星三者之间的关系提供试验依据,为制订环丙沙星的用药方案提供参考。

关键词：猪链球菌病环丙沙星免疫反应

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高+Gx过载后不同时期恒河猴心脏损伤的病理形态学研究

高+Gx过载后不同时期恒河猴心脏损伤的病理形态学研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：郝俊峰吴斌赵德明宁章勇王传武秦秀慧马李颖中国农业大学动物医学院国家海绵状脑病检测实验室航天医学工程研究所中国农业大学动物医学院国家海绵状脑病检测实验室中国农业大学动物医学院国家海绵状脑病检测实验室中国农业大学动物医学院国家海绵状脑病检测实验室中国农业大学动物医学院国家海绵状脑病检测实验室中国农业大学动物医学院国家海绵状脑病检测实验室

本文研究恒河猴经受相应抛物线型+Gx过载作用后及不同恢复阶段的心脏在病理形态学上的变化,为了解不同+Gx值与心肌病理性损伤程度的关系以及损伤后恢复的情况。实验选用15只健康恒河猴于清醒状态下,在动物离心机上经受相应峰值(+1Gx、+1... 详细信息

本文研究恒河猴经受相应抛物线型+Gx过载作用后及不同恢复阶段的心脏在病理形态学上的变化,为了解不同+Gx值与心肌病理性损伤程度的关系以及损伤后恢复的情况。实验选用15只健康恒河猴于清醒状态下,在动物离心机上经受相应峰值(+1Gx、+15Gx、+18Gx、+21Gx)的抛物线型过载作用后,按要求在过载后不同时期剖解,大体观察、取材,进行病理形态学的定性研究。结果(1)眼观病变:在急性实验和恢复1天后+18Gx组和+21Gx组均在左心室近二尖瓣处可见有明显的出血,出血的程度随着+Gx值的增加而加重;+15Gx组在急性实验时可见左心室近瓣膜处有轻度的充血和1-2个针尖大小的出血点,而在转后2天心肌就未见明显眼现的病变;其余两个实验组在转后9天时都未发现眼观可见的病变。(2)H.E.染色,光镜下可见急性实验组心肌纤维和乳头肌染色局灶性变浅、肿胀,有的出现颗粒变性;心内膜下、近心内膜处的心肌纤维间、乳头肌间可见有红细胞;恢复组的动物未见出血性病变,无炎性细胞浸润和增生性变化。(3)电镜可见急性实验的心肌纤维细胞核染色质聚集呈团块状或边集,核膜皱缩,线粒体轻度肿胀,断裂处心肌纤维甚至呈团块状,心肌闰盘问连接疏松,有的出现明显的裂隙;恢复组除可见上述病变外,还可发现断裂处溶酶体数量增多。所以,在经受高+Gx过载后,恒河猴心脏出现了明显的损伤性病理变化,而且损伤的程度与+Gx的增加成正相关,其中+15Gx造成的损伤相对较轻,且容易恢复,而+21Gx造成的损伤严重,且难以恢复。这为载人航天型号任务中可能遇到的高过载医学要求和评价提供了依据。

关键词：高过载 +Gx 恒河猴心脏病理学

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鸭病毒性肠炎病毒强毒在人工感染鸭体内形态结构和发生学的研究

鸭病毒性肠炎病毒强毒在人工感染鸭体内形态结构和发生学的研究

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中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

应用透射电镜和超薄切片技术对鸭病毒性肠炎病毒(Duck Enteritis Virus,DEV)CH强毒株在感染成年鸭体内的分布和形态学进行研究,结果表明:感染后12h在脾脏和法氏囊首先观察到少量的DEV出现,24h后在脾、胸腺和法氏囊以及死亡鸭的肝、肠和... 详细信息

应用透射电镜和超薄切片技术对鸭病毒性肠炎病毒(Duck Enteritis Virus,DEV)CH强毒株在感染成年鸭体内的分布和形态学进行研究,结果表明:感染后12h在脾脏和法氏囊首先观察到少量的DEV出现,24h后在脾、胸腺和法氏囊以及死亡鸭的肝、肠和胰组织器官中均观察到具有典型的疱疹病毒粒子及其核衣壳形态的DEV。DEV病毒核衣壳有空心型、致密核心型、双环型和内壁附有颗粒型四种形态,存在胞核和胞浆两种装配方式。病毒成熟有两种方式:一为细胞核内核衣壳在核内获得皮层,通过核内膜获得囊膜成为成熟病毒;二为核内核衣壳通过内外核膜进入胞浆,核内和胞浆内的核衣壳在细胞浆中获得皮层,然后在各种质膜上获得囊膜,最后成熟病毒通过细胞破裂或其他方式释放到细胞外。伴随着病毒的复制、装配和成熟,细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密颗粒、核内微管和中空短管、胞浆包液体等病毒相关结构。

关键词：鸭病毒性肠炎病毒强毒人工感染病毒形态发生

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