目的和意义:高胆固醇血症是动脉粥样硬化的重要危险因子,动脉粥样硬化是影响人类健康最严重、最常见的心血管疾病之一,是人类死亡的一个主要病因。本研究采用饲喂高胆固醇食物造成高胆固醇血症动物模型,应用基因芯片技术研究高胆固醇血症时基因表达的变化,对阐明该病的发病机理有重要价值。材料和方法:(1)实验分组:将13周龄雄性近交系C57BL/6J小鼠分为正常组、模型组,每组9只。模型组饲以高脂饲料,正常组饲喂普通饲料2周。(2)样品采集及观测指标:第2周结束后,摘眼球取血,分离血清,进行血液生化检测,确定高胆固醇血症造模的成功。血清检测指标包括总甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇,总胆汁酸、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、白球比、肌酐、尿素氮、总胆红素、直接胆红素等。另外,检测体重、脏器指数、肝脏和空肠的总胆固醇、甘油三酯含量,光镜观察肝、肾、脾、心、空肠上段的病理改变。第2周结束时,每组动物除进行上述各种检测指标以外,在眼球取血后迅速取出肝脏,用TRIzol试剂提取RNA用于基因芯片检测。(3)基因芯片检测:从每组动物中的每只动物中各取等量mRNA混合后用于芯片检测。采用Qiagen公司的mouse genome oligo-set version 2.0寡核苷酸芯片。此芯片上点有16463个约70个寡核苷酸长的单链DNA,分别代表16463个小鼠cDNA片段,这些cDNA片段代表的基因覆盖小鼠整个基因组。将mRNA样品反转录成cDNA的过程中,各加入Cy3和Cy5荧光染料进行标记,制备成两个cDNA探针,将探针混合后按预先设计的方案与芯片杂交。杂交结果通过计算机扫描后进行数据分析。(4)定量PCR检测:采用Roche公司SYBR Green I PCR试剂盒,对芯片结果显示的差异表达的几个基因进行定量PCR验证,与芯片结果相符。结果:高脂模型复制成功,模型组的总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、肝脏和空肠脂肪指标与正常组相比有显著的升高(P<0.01)。病理观察可见模型组的肝、肾有典型的高脂血症的改变。基因芯片检测结果表明有98个基因的表达发生了显著变化。这些基因不仅涉及胆固醇代谢、还涉及炎症反应、细胞周期、蛋白质代谢等有关功能。其中,有关胆固醇转变成胆汁和胆汁排泄的基因在模型组中均降低,同时胆固醇逆向转运回肝的相关基因表达增加,因此导致肝胆固醇和血胆固醇增高。
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