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柴胡皂苷b对肝癌细胞增殖凋亡及MACC1/c-Met通路的影响

柴胡皂苷b对肝癌细胞增殖凋亡及MACC1/c-Met通路的影响

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中国药理学会化疗药理专业委员会第十五届学术大会暨2018重庆化疗药物基础与前沿国际论坛

作者：高子涵王红伟吕行直林清华李原野刘唯夷李瑞芳河南科技大学医学院药学系药理学与分子生物学重点实验室河南科技大学护理学院

目的研究柴胡皂苷(saikosaponins,SS)-b对人肝癌细胞株HepG-2细胞的作用及其对结肠癌转移因子1 (MACC1)/肝细胞生长因子受体(c-Met)通路的影响。方法采用CCK-8法观察不同浓度的SS-b对人肝癌细胞株HepG-2细胞增殖的影响。实验分为空白对... 详细信息

目的研究柴胡皂苷(saikosaponins,SS)-b对人肝癌细胞株HepG-2细胞的作用及其对结肠癌转移因子1 (MACC1)/肝细胞生长因子受体(c-Met)通路的影响。方法采用CCK-8法观察不同浓度的SS-b对人肝癌细胞株HepG-2细胞增殖的影响。实验分为空白对照组、SS-b低剂量组、SS-b高剂量组和阿霉素(Doxorubicin,DOX)组。Hoechst 33258染色并在荧光显微镜下观察HepG-2细胞凋亡情况;使用流式细胞术检测HepG-2细胞凋亡率;免疫荧光化学法检测MACC1蛋白表达的变化;Western blot法检测MACC1、c-Met、p-c-Met、Akt、p-Akt、Bad、p-Bad、Bax、Bcl-2、PARP和Caspase-3蛋白表达量。结果1、SS-b作用HepG-2后细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05),经0.075、0.09、0.1、0.2、0.4、0.8mg·mL-1处理48h后,细胞增殖抑制率分别为17.7%、36.7%、44.7%、58.3%、75.1%、97.3%,具有一定的剂量依赖性;2、Hoechst33258染色镜下观空白对照组细胞形态均一呈浅蓝色,SS-b低、高剂量和DOX组中凋亡细胞明显增多,部分细胞核固缩,致密浓染呈蓝亮色;3、流式细胞术结果表明空白对照组、SS-b低、高剂量和DOX组的48 h凋亡率分别为3.3%、39.9%、63.8%和78.7%,提示SS-b对HepG2细胞有明显的促凋亡作用(P<0.01);4、Western blot实验结果显示,与空白对照组相比,SS-b低、高剂量和DOX组可以显著降低HepG-2细胞MACC1、p-c-Met、p-Akt、Bcl-2和caspase-3的表达并升高Bad、Bax、PARP蛋白水平。结论SS-b可以抑制肝癌HepG-2细胞增殖,该作用与其调控MACC1/c-Met通路相关蛋白表达并促进凋亡有关。

关键词：柴胡皂苷b HepG-2细胞 MACC1 c-Met

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新型吡喃酮香豆素类化合物抗金黄色葡萄球菌生物膜作用的研究

新型吡喃酮香豆素类化合物抗金黄色葡萄球菌生物膜作用的研究

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中国药理学会化疗药理专业委员会第十五届学术大会暨2018重庆化疗药物基础与前沿国际论坛

作者：苏珊曲迪张靳伟薛小燕侯征贾敏罗晓星李明凯空军军医大学药学系药理学教研室

目的探究新型吡喃酮香豆素类化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄菌(MRSA)生物膜形成的影响。方法采用微量肉汤稀释法测定15种合成的新型吡喃酮类化合物对MRSA(USA300)的最低抑菌浓度(MIC),以及通过结晶紫染色、荧光显微镜和扫描电镜观察化合... 详细信息

目的探究新型吡喃酮香豆素类化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄菌(MRSA)生物膜形成的影响。方法采用微量肉汤稀释法测定15种合成的新型吡喃酮类化合物对MRSA(USA300)的最低抑菌浓度(MIC),以及通过结晶紫染色、荧光显微镜和扫描电镜观察化合物对细菌生物膜形成的影响;构建大鼠膀胱植入导尿软管感染生物膜模型,记录大鼠体内肾脏、血浆和植入的导尿软管中的菌落形成单位,评价体外有抗生物膜活性的吡喃酮类化合物的体内抗生物膜效果。结果 15种新型吡喃酮类化合物对MRSA的MIC值均大于256μg/ml,提示上述吡喃酮类化合物在体外不能抑制细菌的生长繁殖;通过结晶紫染色、荧光显微镜和扫描电镜观察细菌生物膜形成,与对照组相比,其中3个化合物对MRSA菌株生物膜形成有明显抑制作用;在大鼠膀胱感染生物膜模型,经过受试化合物处理后,给药组肾脏研磨液和导尿软管处理液稀释倍数为100和1000时,与感染模型对照组相比,肾脏菌落数减少明显(p<0.001),导尿软管中菌落数也有显著差异(p<0.05,p<0.01);给药组血浆稀释倍数为10和100时和相应对照组中均未检出细菌菌落。结论通过体外MIC测定,发现15种吡喃酮类化合物均不抑制MRSA的生长,说明体外没有直接抑菌活性。但观察体外细菌生物膜形成结果,显示其中3种吡喃类化合物具有明显的抗MRSA生物膜作用。在大鼠膀胱生物膜感染模型中,吡喃类化合物可以有效抑制大鼠体内肾脏和植入软管上细菌生物膜的感染能力,从而减少细菌菌落的生长,有效控制细菌生物膜体内的感染。

关键词：吡喃酮香豆素金黄色葡萄球菌细菌生物膜

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长链非编码RNA linc00467在结直肠癌中的作用机制

长链非编码RNA linc00467在结直肠癌中的作用机制

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中国药理学会化疗药理专业委员会第十五届学术大会暨2018重庆化疗药物基础与前沿国际论坛

作者：柏杨张媛媛周黎明四川大学华西医学中心基础药理教研室

目的探讨Linc00467在结直肠癌(CRC)在结直肠癌中的作用机制。方法用Real-time PCR法检测人结直肠癌组织和癌旁正常组织中linc00467含量,分析linc00467表达水平与临床病理资料关系;用Real-time PCR法检测人结直肠癌细胞和正常结直肠上皮... 详细信息

目的探讨Linc00467在结直肠癌(CRC)在结直肠癌中的作用机制。方法用Real-time PCR法检测人结直肠癌组织和癌旁正常组织中linc00467含量,分析linc00467表达水平与临床病理资料关系;用Real-time PCR法检测人结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中linc00467含量;利用构建的CRISPR CAS9质粒转染结直肠癌细胞,对linc00467进行敲除实验,MTT法检测敲除后细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,realtime-PCR检测细胞中DKK1的mRNA表达变化,WB法检测细胞中DKK1蛋白质表达变化;生物信息学软件预测分析与linc00467可能作用的miRNA;利用双荧光素酶报告实验检测linc00467作用的靶基因是miR451;利用realtime-PCR法检测敲除linc00467后,结直肠癌细胞中miR451含量;以及检测过表达miR451后,结直肠癌细胞中linc00467含量。用realtime-PCR检测人结直肠癌组织和癌旁正常组织中miR451表达水平,并与临床比例资料进行分析。结果在结直肠癌组织中linc00467高表达,并且与淋巴结转移、临床分期和血清CEA水平有关;在结直肠癌细胞株中,linc00467亦高表达,敲除后细胞增殖抑制、凋亡增加,DKK1表达升高;miR451a和linc00467主要通过linc00467上第577结合位点互相作用;敲除结直肠癌细胞中linc00467后,miR451a表达升高;结直肠癌细胞中过表达miR451后,linc00467表达降低;miR451a在人结直肠癌组织中低表达,并且与临床分期和远端转移有关。结论:linc00467在结直肠癌的发生发展中扮演着重要的致癌因子角色,Linc00467是一个在结直肠癌组织中新发现的癌基因,它在结直肠癌组织与细胞中呈现高表达,并且伴随着患者的不良预后。

关键词：结直肠癌 lncRNA linc00467

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STAT4基因多态性对肝癌易感性及预后的影响及对CYP2E1的调控作用

STAT4基因多态性对肝癌易感性及预后的影响及对CYP2E1的调控作用

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中国药理学会化疗药理专业委员会第十五届学术大会暨2018重庆化疗药物基础与前沿国际论坛

作者：王彩娥乔海灵郑州大学临床药理研究所郑州

目的研究STAT4 rs7574865与HBV-HCC发病风险及预后的关联性并初步探讨STAT4调控CYP2E1在HCC发生发展中的作用机制。方法本研究采用Sequenom MassArray法对HBV-HCC患者和健康人各500例进行STAT4rs7574865基因分型,Logistic回归分析STAT4rs7574865与HBVHCC发生风险进行关联性分析。随访记录314例肝癌患者的死亡时间,采用单因素和多因素的方法对预后生存期影响因素进行统计分析。用ELISA检测STAT4rs7574865不同基因型的血液和组织STAT4的表达水平;流式细胞仪检测L02和HepG2细胞的细胞周期和凋亡:Transwell小室检测STAT4 siRNA对L02、HepG2细胞迁移及侵袭能力的影响;qPCR和westernblot检测STAT4、CYP2E1的水平;荧光素酶报告基因检测STAT4对CYP2E1的启动子区域的调控。结果 STAT4 rs7574865G等位基因是HBV-HCC风险基因,在两组中STAT4的表达水平GG型明显高于TT型(P<0.05),携带GG型的HCC患者死亡风险增加:STAT4siRNA促进细胞凋亡和抑制生长周期,明显抑制L02、HepG2细胞的迁移和侵袭(P<0.01);在肝组织中STAT4与CYP2E1的代谢活性Clint和Vmax呈正相关(P<0.05);qPCR和westernblot显示siRNA-STAT4明显抑制STAT4、CYP2E1的表达(P<0.01);STAT4调控CYP2E1的启动子区域。结论 STAT4在HCC发生发展中起着重要作用,且rs7574865G等位基因可能作为一种预后标志物;STAT4可通过调控CYP2E1的启动子区域影响其转录后翻译,从而影响HCC发生发展,为发现HCC新治疗靶点提供一定的理论依据。

关键词：肝细胞癌信号转导与转录激活因子4 单核苷酸多态性预后增殖 CYP2E1

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新型4-羟基双香豆素衍生物DCH靶向ArgR发挥抗MRSA感染作用

新型4-羟基双香豆素衍生物DCH靶向ArgR发挥抗MRSA感染作用

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中国药理学会化疗药理专业委员会第十五届学术大会暨2018重庆化疗药物基础与前沿国际论坛

作者：曲迪罗晓星李明凯空军军医大学药学系药理学教研室

目的:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染率不断攀升,且近年来新研发上市的抗生素数量呈锐减趋势,因此我们需要研发新型抗菌药物。此研究中我们旨在研究新型双香豆素衍生物的体内外抗菌效果并研究其抗菌作用机制。方法:我们通过取代基修饰的... 详细信息

目的:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染率不断攀升,且近年来新研发上市的抗生素数量呈锐减趋势,因此我们需要研发新型抗菌药物。此研究中我们旨在研究新型双香豆素衍生物的体内外抗菌效果并研究其抗菌作用机制。方法:我们通过取代基修饰的方法化学合成了28个双香豆素衍生物。并评价了这系列衍生物对于药物敏感的金黄色葡萄球菌*** (ATCC 29213)和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSAXJ 75302,Mu50ATCC 700699,USA300)的最低抑菌浓度。此外我们测定衍生物对于细菌生长曲线的影响进一步验证衍生物的抗菌效果。我们在小鼠体内的腹腔感染模型和大鼠膀胱插管模型中评价衍生物抗MRSA感染作用和亚抑菌浓度下抗MASA生物膜的作用,并使用扫描电镜和荧光显微镜观察植入插管表面生物膜的形成。此外RT-PCR也用于检测MRSA中生物膜形成相关基因的表达。结果:4-羟基双香豆素衍生物DCH在体外对药物敏感的金黄色葡萄球菌*** (ATCC 29213)和三株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSAXJ 75302,Mu50 ATCC 700699,USA 300)显示出最佳的抗菌活性,其最低抑菌浓度为4-8μg/ml,生长曲线结果显示DCH在4和8μg/mL时能显著抑制细菌的生长。在小鼠腹腔感染MRSA的模型中分别给予1,2.5和5 mg/kg的DCH进行治疗,可以将小鼠生存率提升至56%,67%和82%,并且显著改善感染小鼠肺脏和肝脏的病理损伤。在大鼠膀胱插管模型中,DCH能在亚抑菌浓度呈计量依赖性的抑制MRSA生物膜的形成并能够抑制生物膜相关基因SrtA,atlE,icaA和aap的表达。通过检测DCH处理后MRSA中蛋白组学的表达,我们发现DCH能够显著降低MRSA中精氨酸代谢通路中关键酶的水平。通过蛋白亲和力实验证实DCH能够靶向结合于MRSA中的精氨酸代谢调控子ArgR,且其亲和力常数KD(M)高达8.20e-008。结论:4-羟基双香豆素衍生物DCH体内外均具有显著抗MARA活性作用。且在亚抑菌浓度DCH可通过抑制MRSA中生物膜相关基因表达抑制MRSA感染时生物膜的形成。DCH的抗MRSA活性与其干扰细菌中精氨酸代谢有关,其能够靶向MRSA中精氨酸代谢调控子ArgR从而影响细菌中精氨酸代谢通路。此研究为新型抗菌药物的研发奠定基础。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌双香豆素最低抑菌浓度生物膜精氨酸

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盐酸小檗胺阻断自噬降解及其增强多柔比星抑制乳腺癌细胞活性的机制研究

盐酸小檗胺阻断自噬降解及其增强多柔比星抑制乳腺癌细胞活性的机...

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中国药理学会化疗药理专业委员会第十五届学术大会暨2018重庆化疗药物基础与前沿国际论坛

作者：邓琴傅若秋高宁中国人民解放军陆军军医大学药学院

目的探讨盐酸小檗胺(BBM)阻断乳腺癌细胞自噬降解及其增敏多柔比星抑制乳腺癌细胞活性的分子机制。方法采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性;采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞的蛋白表达水平;采用免疫共沉淀法(Co-IP)检测蛋白的... 详细信息

目的探讨盐酸小檗胺(BBM)阻断乳腺癌细胞自噬降解及其增敏多柔比星抑制乳腺癌细胞活性的分子机制。方法采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性;采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞的蛋白表达水平;采用免疫共沉淀法(Co-IP)检测蛋白的相互结合;采用免疫荧光(IF)及激光共聚焦方法(Confocal)观察自噬体及蛋白共定位等;采用流式细胞仪(Flow cytometry)检测细胞凋亡及ROS。结果BBM可明显增加乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞中自噬小体的数量:增加自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ的表达,但不影响促进自噬体形成的关键蛋白的表达。tfLC3双荧光质粒转染实验,确证BBM阻断了乳腺癌细胞的自噬降解。IP及Confocal研究发现BBM既不破坏溶酶体的酸性环境也不降低溶酶体膜标志蛋白LAMP1/LAMP2的表达,但可抑制自噬体与溶酶体的融合。进一步研究发现BBM可干扰SNAP29-VAMP8之间的结合,影响了自噬体-溶酶体融合所必需的SNARE蛋白复合物的形成,从而抑制自噬体-溶酶体的融合而阻断自噬降解。研究也发现BBM可以增加BNIP3的mRNA转录水平及上调BNIP3蛋白的表达;采用shRNA干扰的方法敲降BNIP3后,可减轻BBM对SNAP29-VAMP8结合的干扰,减弱BBM对自噬体-溶酶体融合的抑制作用进而削弱BBM阻断自噬降解的作用。而通过Co-IP实验发现BNIP3与SNAP29可以发生共沉淀,IF检测发现BNIP3可以与SNAP29发生共定位;而过表达SNAP29可以减轻BNIP3对SNAP29-VAMP8结合的干扰,促进自噬体-溶酶体融合,最终削弱BNIP3阻断自噬降解的作用。MTT检测发现BBM可以抑制不同类型肿瘤细胞的增殖活性,也可协同增敏多种抗肿瘤药物的抗乳腺癌细胞作用;其中对多柔比星(DOX)的增敏作用最强;流式细胞和Western blot检测发现BBM联用DOX (BBM+DOX)可增加乳腺癌细胞的凋亡率,激活细胞凋亡途径;进一步的分子机制研究发现BBM+DOX是通过抑制自噬降解导致自噬体大量堆积,从而协同多柔比星诱导细胞出现氧化应激反应产生ROS,进而影响p38、ERK等MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平而激活细胞凋亡途径,促进乳腺癌细胞发生凋亡而抑制其增殖活性。结论盐酸小檗胺是一新型的自噬降解抑制剂,可作为一种新的抗肿瘤药物增敏剂用于抗乳腺癌治疗。

关键词：盐酸小檗胺自噬 BNIP3 多柔比星凋亡乳腺癌

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千金藤素抑制自噬降解及其增敏乳腺癌化疗的机制研究

千金藤素抑制自噬降解及其增敏乳腺癌化疗的机制研究

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中国药理学会化疗药理专业委员会第十五届学术大会暨2018重庆化疗药物基础与前沿国际论坛

作者：邓琴傅若秋高宁第三军医大学药学院

目的探讨千金藤素抑制自噬降解及其增敏乳腺癌化疗的分子机制。方法首先以乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7作为研究对象。采用激光共聚焦显微镜观察千金藤素对乳腺癌细胞自噬体数量的影响,以及Western Blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62、p-ULK1... 详细信息

目的探讨千金藤素抑制自噬降解及其增敏乳腺癌化疗的分子机制。方法首先以乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7作为研究对象。采用激光共聚焦显微镜观察千金藤素对乳腺癌细胞自噬体数量的影响,以及Western Blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62、p-ULK1、mTOR、Beclin1、ATG5、ATG7的表达变化。细胞转染EGFP-LC3质粒后,采用Mito Tracker染色线粒体观察线粒体自噬,以及通过分离提取线粒体蛋白检测线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62的表达。然后通过Western Blot检测千金藤素分别联用Bafilomycin A1、Rapamycin后对LC3-Ⅱ、p62的影响,以及转染双色荧光质粒(tfLC3)后细胞自噬流的变化。紧接着通过LysoTracker染色考察溶酶体的pH环境。Western Blot检测溶酶体相关膜蛋白LAMP1、LAMP2以及溶酶体组织蛋白酶的表达。共转染mGFP-LAMP1、mRFPLC3质粒考察自噬体与溶酶体的融合情况。再通过Western Blot检测千金藤素对肌球蛋白MYO1C表达的影响。慢病毒构建shMYO1C稳定细胞株研究MYO1C敲低后对细胞自噬产生的影响。通过免疫沉淀和免疫荧光实验考察MYO1C与LC3的共定位情况。最后通过MTT法和流失细胞仪考察千金藤素增敏乳腺癌化疗的效果,以及Western Blot检测Cyto c和凋亡相关蛋白Caspase3、PARP的表达。结果首先通过激光共聚焦观察到了千金藤素可引起乳腺癌细胞自噬体的聚集,使得LC3-Ⅱ、p62的表达水平呈时效和量效增多,但是并不影响诱导自噬形成相关蛋白p-ULK1、mTOR、Beclinl、ATG5、ATG7的表达。细胞转染EGFPLC3和Mito Tracker染色的线粒体产生了大量共定位。同时,线粒体蛋白中的LC3-Ⅱ、p62表达增多,说明千金藤素引起了细胞线粒体自噬。千金藤素联用Bafilomycin A1可进一步导致LC3-Ⅱ的增多,联用Rpamycin可以使p62蛋白表达水平减少被逆转。转染tfLC3后观察到千金藤素与自噬抑制剂Bafilomycin A1作用类似,导致自噬流被阻断。紧接着通过LysoTracker和Western Blot实验发现,千金藤素不会影响LysoTracker对溶酶体的染色,也不减少溶酶体相关膜蛋白LAMP1、LAMP2的表达。但是,千金藤素减少了溶酶体组织蛋白酶成熟部分的表达。共转染mGFP-LAMP1、mRFP-LC3质粒后发现千金藤素减少了两者的共定位。进一步通过Western Blot发现千金藤素可以抑制MYO1C的表达,shMYO1C后导致LC3-Ⅱ的增多,自噬体的聚集,阻断自噬流的降解,并且在加入千金藤素处理后,进一步阻断了mRFP-LC3与mGFP-LAMP1的共定位。通过免疫沉淀和免疫荧光实验发现千金藤素减少了MYO1C与LC3的直接结合。最后,我们发现千金藤素联用化疗药物显著增敏化疗药的活性。其中,联用多柔比星可促进Cyto c的释放,导致Caspsase 3和PARP的降解激活,显著增加细胞的凋亡率。结论千金藤素可以通过抑制溶酶体组织蛋白酶的成熟以及通过抑制MYO1C的表达阻断自噬体的转运而抑制自噬降解。同时,千金藤素联合多柔比星可以通过诱导细胞凋亡增敏化疗药的活性。

关键词：千金藤素自噬乳腺癌化疗

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青蒿琥酯的药代动力学与药理活性研究进展

青蒿琥酯的药代动力学与药理活性研究进展

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中国药理学会化疗药理专业委员会第十五届学术大会暨2018重庆化疗药物基础与前沿国际论坛

作者：岑彦艳曾秀秀周红陆军军医大学药理学教研室重庆圣华曦药业股份有限公司遵义医学院基础药理教育部重点实验室

青蒿琥酯(Artesunate,AS),又名青蒿酯(Artesunatum),是一种青蒿素的衍生物,当前全球的用于轻微到严重的疟疾感染的基础治疗。最近,研究报告显示青蒿琥酯与其活性代谢产物二氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)具有多种生物活性,包括抗炎... 详细信息

青蒿琥酯(Artesunate,AS),又名青蒿酯(Artesunatum),是一种青蒿素的衍生物,当前全球的用于轻微到严重的疟疾感染的基础治疗。最近,研究报告显示青蒿琥酯与其活性代谢产物二氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)具有多种生物活性,包括抗炎、抗脓毒症、抗肿瘤、放射线增敏、抗纤维化等等。充分了解青蒿琥酯药物动力学特征,如不同给药途径、不同人群使用的药物体内过程,以及青蒿琥酯和代谢物药理活性的研究进展。为进一步合理开发利用青蒿琥酯及其代谢产物提供一定的理论依据。青蒿琥酯是有效的抗疟药物,挽救了数百万人的性命。青蒿琥酯药代动力学研究的主要采用血浆样本,少部分研究采用了血清、全血、唾液或其他生物样本。青蒿琥酯为弱酸性药物,PKa为3.5-5.5。在体内主要通过简单扩散的方式跨过生物膜,在酸性体液中离子化程度低,较易透过生物膜。口服青蒿琥酯较快,15min可在血中检测到,一般达峰时间在1h以内。青蒿琥酯经不同给药途径吸收入血后,无论是原型形式还是活性代谢产物,其与血浆蛋白的结合率都较高,均高于75%。青蒿琥酯转化为具有药理活性的二氢青蒿素的水解酶可能包括非微粒体酶和微粒体酶。由青蒿琥酯转化产生的二氢青蒿素可经胆汁排泄入肠道,但存在非常明显的肠肝循环。肝脏是二氢青蒿素的主要代谢器官,但没有CYP450的参与,主要通过尿甘二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)催化的糖基化而代谢,存在明显的肝肠循环,主要以在尿中排泄。青蒿琥酯的药代动力学特征符合二室模型,二氢青蒿素则符合非房室模型。健康志愿者静脉注射静脉注射分别给予0.5、1、2、4和8mg/kg AS后AS的Cmax分别为4797、6128、19420、36100、83340ng/ml,AS的AUC为386、593、1595、3038、6994ng*h/ml,而DHA的Cmax分别为428、802、1286、3148、4744ng/ml,DHA的AUC分别为385、1082、1850、4886、10410ng*h/ml。健康志愿者分别口服AS剂量为150mg、200mg以及300mg时,AS的Cmax分别为111、256.3、397ng/ml,AUC分别为154、119、406ng*h/ml;而DHA的Cmax分别为546、873.7、500ng/ml,AUC分别为824、1331、1630ng*h/ml。疟疾患者静脉注射分别给予1.2、2.4mg/kg青蒿琥酯后青蒿琥酯的Cmax分别为15369、29677ng/ml,AS的AUC为555、1042ng*h/ml,而二氢青蒿素的Cmax分别为1584、3011ng/ml,DHA的AUC分别为737、923ng*h/ml;静脉注射剂量为120mg时AS的AUC为1146 ng*h/ml,而DHA的Cmax为2648ng/ml,DHA的AUC为2377ng*h/ml。疟疾患者肌肉注射给予2.4mg/kg AS后AS的Cmax为2195ng/ml,AUC为856ng*h/ml,而DHA的Cmax为870ng/ml,AUC为1496 ng*h/ml;肌注剂量为120mg时AS的Cmax为884ng/ml,AUC为999ng*h/ml,而DHA的Cmax为1166ng/ml,AUC为2474ng*h/ml。在儿童中UGTs的代谢能力比成年人弱,因此导致二氢青蒿素清除率降低。运用单位体重给予相应剂量的方式给予药物可以有效避免药物暴露量的差异,但年龄因素的影响还有待进一步研究。孕妇口服青蒿琥酯后二氢青蒿素的药动学研究表明,二氢青蒿素的清除率以及表观分布容积的值分别为4.0L/h和3.4 L/kg,均低于一般患者。随着青蒿素的发现获得2015年诺贝尔生理学或医学奖,青蒿素及其衍生物成为研究的焦点。在众多科研工作者的共同努力下,证实青蒿琥酯对除疟疾外的多种疾病有治疗作用。如青蒿素及其衍生生治疗系统性红斑狼疮进入了临床研究。因此,更多的新适应的发现将改变其给药方式。因此,物质转化、药物浓度、时量关系等的测定和研究非常具有意义,对青蒿琥酯及代谢物的药代动力学和药理活性做一个全面的分析掌握有利于促进药物开发和临床应用。

关键词：青蒿琥酯二氢青蒿素药代动力学药理活性

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MiR-451a调控BAP31介导内质网应激诱导结直肠癌细胞凋亡研究

MiR-451a调控BAP31介导内质网应激诱导结直肠癌细胞凋亡研究

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中国药理学会化疗药理专业委员会第十五届学术大会暨2018重庆化疗药物基础与前沿国际论坛

作者：许可张媛媛周黎明四川大学华西医学中心基础药理教研室

目的研究miR-451a调控BAP31表达下降后引起细胞内质网应激从而诱导结肠癌细胞凋亡的分子机制。方法 Realtime-PCR方法检测结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中miR-451a的表达情况;干预miR-451a表达的结直肠癌细胞株HCT116构建抑制杂交... 详细信息

目的研究miR-451a调控BAP31表达下降后引起细胞内质网应激从而诱导结肠癌细胞凋亡的分子机制。方法 Realtime-PCR方法检测结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中miR-451a的表达情况;干预miR-451a表达的结直肠癌细胞株HCT116构建抑制杂交消减文库得到miR-451a所调控的基因;Realtime-PCR、Western blot的方法检测结直肠癌癌细胞和正常直肠上皮细胞NCM460中BAP31的mRNA和蛋白表达情况。用双萤光素酶报告基因检测BAP31是miR-451a的靶基因;根据miR-451a及BAP31的基因序列,设计、构建miR-451a及BAP31的真核表达及shRNA表达质粒;将上述构建的质粒转染人结直肠癌HCT-116和SW620细胞;并利用Realtime-PCR及western blot方法检测转染后细胞中miR-451a和BAP31的表达变化。通过MTT细胞活性实验检测转染后细胞的增值率;Hoechst染色、流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡变化;Fluo-4AM检测细胞质钙离子浓度的变化,ER-tracker检测内质网形态的变化。并利用western blot方法检测转染后细胞中GRP78、BAX和PERK蛋白的表达变化。用结直肠癌HCT116建立裸鼠移植瘤模型。瘤内核瘤旁注射miR-451a过表达质粒和BAP31的沉默质粒,按照每只每次注射10μg,每周一次的频率注射,记录每只裸鼠的体重、瘤体积和最后瘤重量;在临床标本中,利用Realtime-PCR结直肠癌癌组织和癌旁正常组织中,验证miR-451a的表达情况,分析miR-451a与临床指标的关系;在临床标本中,利用Realtime-PCR、Western blot和免疫组化的方法检测结直肠癌癌组织和癌旁正常组织中以及结直肠癌细胞中BAP31的mRNA和蛋白表达情况,分析BAP31的表达与临床指标的关系。结果直肠癌HCT16、HT29、SW480、SW620、DLD细胞株与对照细胞株正常直肠上皮细胞NCM460相比中miR-451a表达下调;抑制杂交削减正向文库中我们得到了BAP31,EEF1A1,CDC20,WDR6,TUFM,RPL13和RPL7A基因,在反向库中我们获得了DKK1,PSME1,NDUFA3和GNB2基因。miR-451a参与与了转录延伸、蛋白质在内质网上的定位、蛋白质的翻译、以及polyA RNA的结合、负向调剂Wnt信号通路等过程;直肠癌HCT16、HT29、SW620、DLD细胞株与对照细胞株正常直肠上皮细胞NCM460相比中BAP31表达上调。双荧光素酶报告基因证明miR-451a通过作用于BAP31上游5‘-UTR发挥作用;过表达miR-451a后在HCT16、SW620细胞中,BAP31表达下降;在细胞转染过表达miR-451a和沉默BAP31后,能够明显抑制细胞生长,引起细胞凋亡率增加,同时还发现细胞中内质网形态变为浓集或出现空泡,包内钙离子浓度增加,内质网应激标志蛋白GRP78表达明显增加,内质网应激引发的PERK、BAX蛋白表达明显增加;与空白质粒对照相比,注射过表达miR-451a质粒和BAP31沉默质粒能够明显抑制裸鼠皮下瘤的生长,裸鼠体重的减轻不明显。另外检测瘤体重BAP31蛋白的表达量发现注射过表达miR-451a质粒和BAP31沉默质粒的瘤体中BAP31蛋白的表达情况。miR-451a在结直肠癌组织中的表达明显降低,miR-451a的相对表达量与结直肠癌临床分期有关;BAP31在结直肠癌组织中的表达明显升高,BAP31的相对表达量与结直肠癌临床分期有关。结论 miR-451a在结直肠癌的发生发展中发挥着重要的抑癌基因作用,参与与了转录延伸、蛋白质在内质网上的定位、蛋白质的翻译、以及polyARNA的结合、负向调剂Wnt信号通路等过程。可通过抑制BAP31蛋白表达,引起细胞中内质网应激出现,激活PERK/ATF4通路,同时BAX蛋白的表达增加引起内质网中钙离子释放入胞质中,引起细胞的凋亡。增加miR-451a的表达或者靶向性抑制BAP31,能有效抑制肿瘤生长及转移的发生。

关键词：结直肠癌 microRNA-451a BAP31 内质网应激凋亡

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