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沃尼妙林对鸡毒支原体的体内药动药效同步模型研究

沃尼妙林对鸡毒支原体的体内药动药效同步模型研究

引用

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：肖霞方茜刘雅红华南农业大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

沃尼妙林为新型截短侧耳素类药物,对鸡毒支原体极其敏感,同时在鸡体内具有优良的药动学特征,是未来治疗鸡毒支原体感染较为理想的药物。但目前有关沃尼妙林对鸡毒支原体的研究较匮乏,无法为临床使用该药提供足够的科学用药依据。本文拟... 详细信息

沃尼妙林为新型截短侧耳素类药物,对鸡毒支原体极其敏感,同时在鸡体内具有优良的药动学特征,是未来治疗鸡毒支原体感染较为理想的药物。但目前有关沃尼妙林对鸡毒支原体的研究较匮乏,无法为临床使用该药提供足够的科学用药依据。本文拟通过体内药动药效（PK/PD）同步模型来研究沃尼妙林对鸡毒支原体的药效作用特征。为消除动物自身免疫对药物作用的影响,对3日龄无鸡毒支原体感染雏鸡,大腿肌肉注射60 mg/kg环磷酰胺,连续注射三天,建立中性粒细胞减少模型。对免疫系统破坏了的雏鸡进行气管灌注鸡毒支原体0.2mL约10～8CCU鸡毒支原体,连续攻毒三天,建立鸡毒支原体感染雏鸡模型。对感染雏鸡进行肌肉注射1、10、20 mg/kg b.w.沃尼妙林考察其药动学特征。选取50只感染雏鸡,随机选取5只分离气囊、肺、气管,其余45只随机分为9组,分别肌注生理盐、1、2、4、6、8、10、15、20 mg/kg沃尼妙林三天。最后一次给药24 h以后处死雏鸡,分离每只鸡的气囊,肺,气管作为一个样品。样品保存于-80℃,利用DNA提取试剂盒进行细菌DNA提取。采用荧光定量PCR建立定量测定菌液及组织样品中鸡毒支原体拷贝数的方法,鸡毒支原体拷贝数的对数值与荧光定量PCR的Ct值在3×10～2CCU/mL×10～8 CCU/mL范围内成线性关系,相关系数R为0.9976,即可通过荧光定量PCR检测雏鸡给药前后鸡毒支原体的载菌量。利用Sigmoid E模型将参数AUC/MIC与给药前后鸡毒支原体细菌数量的改变进行拟合,得出最优的PK/PD参数及达到不同作用效果的参数值。最后利用Toutain推荐的方法进行给药剂量的计算。雏鸡经环磷酰胺处理后粒细胞数量小于1000/mm并且可持续8天。粒细胞减少的雏鸡通过气管灌注鸡毒支原体后,95%的雏鸡的精神萎靡,闭眼,解剖发现气囊有奶酪样物质,气管有血丝。将气囊,气管,肺组织分离进行DNA提取测定鸡毒支原体DNA得出雏鸡细菌载菌量基本稳定在0.3×10～6CCU。发病率为95%,死亡率为17%。而对照组的雏鸡无临床症状,分离组织测DNA亦未测出。在1 mg/kg0 mg/kg b.w.剂量范围内药动学参数AUC、C与给药剂量成线性关系,由此可推算出任何介于1 mg/kg0 mg/kg b.w.给药剂量下的药动学参数AUC、C。经拟合发现AUC/MIC与沃尼妙林对鸡毒支原体在体内的抗菌作用存在显著的相关性（R=0.9669）。预测当AUC/MIC值为28,820、38,030和56,256时可达到抑制鸡毒支原体生长（0Log10 CCU/mL）,减少1 LogCCU/mL,减少2.5 LogCCU/mL的作用效果。对于MIC为0.0014μg/mL或者更小的鸡毒支原体感染,为达到使鸡毒支原体减少2.5 LogCCU/mL的效果推荐的给药剂量为6.5mg/kg,一天一次,一共给药三天,为临床合理用药提供理论依据。

关键词：鸡毒支原体沃尼妙林药动药效同步模型

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猪源大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌铜抗性与抗菌药物耐药性的相关性初探

猪源大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌铜抗性与抗菌药物耐药性的相关...

引用

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：杨慧姜中其浙江大学动物科学学院

目的抗菌药物和重金属盐在饲料中的普遍添加,无疑会导致其向环境中源源不断地释放,从而加剧相关抗性基因在环境中的传播和扩散。本试验开展猪源大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌的铜抗性发生率及抗铜基因、耐药基因携带检测分析,旨在了解... 详细信息

目的抗菌药物和重金属盐在饲料中的普遍添加,无疑会导致其向环境中源源不断地释放,从而加剧相关抗性基因在环境中的传播和扩散。本试验开展猪源大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌的铜抗性发生率及抗铜基因、耐药基因携带检测分析,旨在了解猪源常见细菌铜抗性分布并初步探索抗菌药物耐药基因与重金属抗性基因之间的关系。方法与结果采用CLSI微量肉汤稀释法,对猪源大肠杆菌130株、沙门氏菌32株和葡萄球菌13株进行药敏试验,筛选出抗铜菌株。结果显示:硫酸铜对上述各菌株的MIC为8-10 mM。其中当MIC为8mM时,分离自仔猪、生长肥育猪和出栏猪的大肠杆菌铜抗性分别为9.23%、9.23%和15-38%;MIC为9mM时,分离自仔猪、生长肥育猪和出栏猪的大肠杆菌铜抗性分别为32.3 1%、10.77%和6.15%:MIC为10mM时,分离自仔猪、生长肥育猪和出栏猪的大肠杆菌铜抗性分别为12.31%、3.08%和1.54%。当MIC为8 mM、9mM、10mM所对应的沙门氏菌铜抗性分别为18.75%、68.75%、12.5%。MIC值为8 mM、9mM、10raM所对应的葡萄球菌铜抗性分别为45.45%、45.45%、9.09%;进一步采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术检测其抗铜基因(pcoABCDE)和耐药基因(tetA、tetB、strA、strB、sul2),结果表明:大肠杆菌临床分离株pcoA、pcoB、pcoC、pcoD和pcoE抗铜基因携带率占总检测菌株数的31.5%(41/130);沙门氏菌临床分离株pcoA、pcoB、pcoC、pcoD和pcoE抗铜基因携带率占总检测菌株数的59.4%(19/32);而11株临床分离的葡萄球菌均未检测到抗铜基因。另外,同时具有pcoA、pcoB、pcoC、pcoD和pcoE抗铜基因的41株抗铜大肠杆菌中,携带耐药基因tetA、tetB、strA、strB、sul2均较高,分别为60.98%、36.59%、90.24%、95.12%、90.24%;而同时具有pcoA、pcoB、pcoC、pcoD和pcoE抗铜基因的19株沙门氏菌中,携带耐药基因tetA、tetB、strA、strB、sul2差异则较大,分别为73.68%、5.26%、100.0%、100.0%、15.79%。结论三种常见猪源病原菌均存在不同程度的铜抗性。pco抗铜基因簇较普遍地存在于猪源大肠杆菌和沙门氏菌中,且这5种抗铜基因均同时出现在某一株大肠杆菌或沙门氏菌中,表现出这五种抗铜基因的协同性。tetA、tetB、strA、strB、sul2这5种耐药基因在铜抗性菌株中的存在,说明饲料中添加铜盐导致铜抗性基因产生的同时也协同选择了某些耐药基因。其中,氨基糖苷类抗菌药物和磺胺类抗菌药物与抗铜大肠杆菌协同选择密切程度很高(>90%),四环素类抗菌药物次之;氨基糖苷类抗菌药物与抗铜沙门氏菌协同选择密切程度最高(100%),四环素类抗菌药物其次,磺胺类抗菌药物最低(<20%)。

关键词：猪源大肠杆菌沙门氏菌和葡萄球菌铜重金属抗性耐药性

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氯丙醇类化合物对T淋巴细胞的毒性及机制研究

氯丙醇类化合物对T淋巴细胞的毒性及机制研究

引用

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：卢静关爽张爽许琳莉黄国任宋博翠王振宁张硕男邓旭明动物医学学院吉林大学

【目的】氯丙醇类化合物是目前被国际上广为关注的食品污染物,包括3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）、2,3-二氯-丙醇（2,3-DCP）等,其中3-MCPD含量最大。据报道3-MCPD具有免疫抑制作用,能降低CD4+CD8+T细胞比值,... 详细信息

【目的】氯丙醇类化合物是目前被国际上广为关注的食品污染物,包括3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）、2,3-二氯-丙醇（2,3-DCP）等,其中3-MCPD含量最大。据报道3-MCPD具有免疫抑制作用,能降低CD4+CD8+T细胞比值,但其机制不清楚,2,3-DCP对免疫系统毒作用未见报道;T淋巴细胞是数量最多的淋巴细胞,具有重要的免疫功能。因此,本研究旨在阐明3-MCPD（+）、和2,3-DCP对小鼠T淋巴细胞免疫毒性及机制。【方法】在体外实验中,采用MTT法考察受试物对小鼠脾淋巴细胞的细胞毒作用,在非细胞方法毒性剂量下采用流式细胞术分析、ELISA试剂盒检测、RT-PCR、细胞内钙离子的荧光测定、western blot等技术考察受试物对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖、细胞周期、T细胞表面标志、细胞因子、细胞内钙离子浓度、CD3 T细胞pIκBα、IκB、NF-κB、NFAT2、AP-1等蛋白表达的影响;在体内实验中,构建二硝基氟苯（DNFB）所致的迟发型超敏反应（DTH）小鼠模型,考察了受试物对二硝基氟苯（DNFB）诱导的迟发型超敏反应（DTH）的影响。【结果】体外实验确定3-MCPD（+）、和2,3-DCP的非细胞毒性剂量范围为1-4mM,该剂量范围内的3-MCPD（+）和2,3-DCP剂量依赖地抑制T细胞的免疫功能。其中3-MCPD（+）(1,2,4mM)剂量依赖地抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖、降低CD4T淋巴细胞的数量和CD4/CD8T细胞比值、阻止T淋巴细胞进入到S期、抑制Th1和Th2细胞因子分泌和IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-6基因表达、抑制细胞内Ca浓度和钙调蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）及P-CaMKⅡ蛋白表达、并抑制P-IκB、NFAT2和AP-1蛋白表达、促进Iκ3蛋白表达,但对CD8T淋巴细胞数量无明显影响;2,3-DCP（1,2,4mM）剂量依赖地抑制ConA诱导的脾淋巴细胞增殖,并使S期细胞比例增多,降低CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+比值,降低细胞分泌Th1细胞因子,并在剂量为4mM时降低细胞分泌Th2细胞因子,抑制NFAT2、pIκBα和p65 NF-κB蛋白表达,促进IκB蛋白表达;体内实验表明3-MCPD（+）(10,20,40mg/kg)和2,3-DCP（10,20,40mg/kg）降低DTH诱导迟发型超敏反应小鼠耳廓重量、耳组织的水肿和炎性细胞浸润。【结论】3-MCPD（+）和2,3-DCP对BALB/c小鼠T淋巴细胞具有免疫抑制作用,这种抑制作用可能是通过抑制Ca、NF-κB、NFAT及AP-1信号通路来实现的。该研究为3-MCPD（+）和2,3-DCP对T淋巴细胞的免疫抑制机制和进一步的安全性评价提供毒理学依据。

关键词： 3-MCPD(+) 2,3-DCP NFAT DTH Ca2+ NF-κB AP-1 免疫抑制

来源：评论

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PCV2诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的建立

PCV2诱导小鼠体内免疫细胞氧化胁迫模型的建立

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：尹丹杨剑郝祝兵韦英益胡庭俊广西大学动物科学技术学院

【目的】通过腹腔注射、滴鼻和灌胃等三途径感染昆明系小鼠PCV2,探讨病毒感染剂量、感染时间与体内免疫细胞活性氧水平变化的关系,建立免疫细胞氧化胁迫整体动物模型。【方法】将72只昆明系小鼠随机分为6组,雌雄各半,根据前期试验结果... 详细信息

【目的】通过腹腔注射、滴鼻和灌胃等三途径感染昆明系小鼠PCV2,探讨病毒感染剂量、感染时间与体内免疫细胞活性氧水平变化的关系,建立免疫细胞氧化胁迫整体动物模型。【方法】将72只昆明系小鼠随机分为6组,雌雄各半,根据前期试验结果优化的感染方案(第1、2、3天每天经三种途径联合感染PCV2病毒原液,1mL/只),采用腹腔注射、灌胃和滴鼻等三种途径联合感染PCV2,具体处理如下:A组:第1、2、3天每天经三种途径联合感染PCV2病毒原液,1mL/只,于感染后第7 d剖杀;B组:第1、2、3天每天以三种途径联合给予相同剂量生理盐水,1mL/只,于感染后第7d剖杀;C组:第1、2、3天每天经三种途径联合感染PCV2病毒原液,1mL/只,于感染后第14d剖杀;D组:第1、2、3天每天以三种途径联合给予相同剂量生理盐水,1mL/只,于感染后第14 d剖杀;E组:第1、2、3天每天经三种途径联合感染PCV2病毒原液,1mL/只,于感染后第21 d剖杀;F组:第1、2、3天每天以三种途径联合给予相同剂量生理盐水,1mL/只,于感染后第21 d剖杀。分别于感染后第7d、14d、21d剖杀并进行脾淋巴细胞分离,DCFH-DA荧光探针检测细胞ROS水平,酶联免疫法检测小鼠脾脏T-GSH、GSH、GSSG含量及XOD、MPO、iNOS活力。【结果】PCV2感染小鼠7d、14 d、21d后,小鼠脾淋巴细胞ROS水平随时间稍有降低。与空白对照组相比,PCV2感染小鼠7 d、14 d、21 d均升高细胞内ROS水平,差异极显著(P<0.01)。与空白对照组相比,PCV2感染小鼠7d、14d、21 d后,不同程度降低小鼠脾脏GSH、T-GSH水平,升高小鼠脾脏GSSG水平;其中感染后7d小鼠脾脏GSH、T-GSH水平及感染后14 d小鼠脾脏GSH水平与空白对照组比差异均显著(P<0.05),感染后7d小鼠脾脏GSSG水平、14d脾脏T-GSH水平与空白对照组比差异均为极显著(P<0.01),感染后21d小鼠脾脏GSH、T-GSH水平及感染后14 d、21 d小鼠脾脏GSSG水平与空白对照组比差异均不显著(P>0.05)。与空白对照组中正常小鼠相比,PCV2感染小鼠7 d、14 d、21 d后,不同程度升高了小鼠脾脏XOD、MPO、iNOS活力,其中感染后7d脾脏XOD、MPO活力与空白对照组比较差异显著(P<0.05),感染后14 d、21 d小鼠脾脏XOD、MPO、iNOS活力与空白对照组比较差异不显著(P>0.05)。【结论】本实验结果表明,PCV2成功感染小鼠,且通过升高感染小鼠脾淋巴细胞ROS水平、上调细胞XOD、MPO、iNOS活力,降低GSH和T-GSH水平,以改变感染小鼠脾脏氧化还原状态,成功建立免疫细胞氧化胁迫动物模型。

关键词：猪圆环病毒2型(PCV-2) 昆明种小鼠活性氧氧化胁迫模型

来源：评论

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闽江流域水源性肠球菌抗生素耐药与水体氮磷营养盐的相关性研究

闽江流域水源性肠球菌抗生素耐药与水体氮磷营养盐的相关性研究

引用

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：陈玉红肖正润林福张洁李健黄一帆俞道进福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室

目的:了解水源性肠球菌产生土霉素（OXY）、氨苄西林（AMP）、环丙沙星（CIP）、万古霉素（VAN）、氯霉素（CHL）、红霉素（ERY）耐药表型,了解自然环境水体肠球菌的耐药率、抗生素耐药水平、耐药谱以及了解不同水体中肠球菌抗生素耐药... 详细信息

目的:了解水源性肠球菌产生土霉素（OXY）、氨苄西林（AMP）、环丙沙星（CIP）、万古霉素（VAN）、氯霉素（CHL）、红霉素（ERY）耐药表型,了解自然环境水体肠球菌的耐药率、抗生素耐药水平、耐药谱以及了解不同水体中肠球菌抗生素耐药模式（ARP）的差异。探讨水源性肠球菌抗生素耐药与其所处水体氮磷营养盐之间的相关性,建立自然水体氮磷营养盐与肠球菌耐药水平之间的相关性。方法:以闽江流域为研究主体,采集主要流域三大支流及主干流的表层水样,共设置40个采样点。将样品中的微生物进行富集、增菌培养、分离、纯化,并用生化方法以及PCR方法鉴定肠球菌菌株,保存。同时测定富营养化指标:总氮（TN）、总磷（TP）、高锰酸盐指数(COD)。用微量肉汤稀释法对鉴定后的肠球菌菌株进行药物敏感性试验。运用数学统计分析的方法,得到水源性肠球菌的耐药表型、耐药率及其对各类抗生素的耐药水平。分析各个采样点的耐药谱,了解水体中肠球菌抗生素耐药模式（ARP）,并分析水源性肠球菌耐药性与自然水体中氮磷营养盐之间的相关性。结果:（1）闽江流域40份水样,共分离得到40株肠球菌;分离菌对抗生素的耐药率由高到低分别为:土霉素>红霉素>环丙沙星>氯霉素>氨苄西林,其中对土霉素、红霉素的耐药率最高,分别为70.00%和50.00%;对环丙沙星、氯霉素和氨苄西林的耐药率较低,分别为17.5%、12.5%、2.5%,没有检测到耐万古霉素肠球菌;（2）分离菌对红霉素和土霉素的耐药水平很高,红霉素MIC≥256μg/mL的比例达到了75.00%,对土霉素的MIC≥128μg/mL的比例为75.00%,对氯霉素的耐药水平也较高,MIC=64μg/mL的比例为60.00%,分离得到的耐药菌对环丙沙星属于低水平耐药;（3）40株分离菌共有8种耐药谱,主要以COE、OE和O为主,分别占15.00%、20.00%、22.50%,有一株对四种抗生素（AHOE）都表现耐药的菌株;（4）分离菌1～4重耐药均有出现,主要以1～3重耐药为主,其中2重以上的耐药率为50%;（5）在河流的源头和最接近源头的上游地区分离得到的肠球菌几乎不耐药,而随着水流推进的方向,出现了细菌的耐药和多重耐药情况。因此,几乎不受人类活动影响的自然水源是存在抗生素敏感菌的,人类活动对细菌耐药的产生有重要影响。（6）水体的TN、TP、CODMn以及TN/TP的比值与水源性肠球菌土霉素及红霉素耐药水平呈正相关。结论:（1）闽江流域水样中的肠球菌主要表现为对土霉素与红霉素的高耐药率和高水平耐药,流域各段水样肠球菌对环丙沙星、氯霉素、氨苄西林耐药率较低,没有分离到耐万古霉素肠球菌。（2）水体TN值与分离菌土耐药水平相关性最强,COD值与分离菌红霉素耐药水平相关性最强,它们是导致细菌耐药的重要影响因素。TP、TN/TP值与肠球菌耐药也有一定的相关性。

关键词：闽江水源性肠球菌氮磷营养盐抗生素耐药耐药模式(ARP)

来源：评论

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广州流溪河沉积物反硝化细菌群落结构、丰度与环境因子相关性研究

广州流溪河沉积物反硝化细菌群落结构、丰度与环境因子相关性研究

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：王勉之丁雪瑶孙静马驿范葶莉孙永学华南农业大学兽医学院兽药安全评估国家重点实验室广东海洋大学农学院动物医学系

(目的)本文以反硝化细菌硝酸盐还原酶的narG基因和亚硝酸盐还原酶的nirS基因作为分子标示物,研究反硝化细菌的群落结构、丰度与环境因子之间的相关性。（方法）实验对流溪河流域从上游至下游十个不同位点进行沉积物采样,进行环境因子（... 详细信息

(目的)本文以反硝化细菌硝酸盐还原酶的narG基因和亚硝酸盐还原酶的nirS基因作为分子标示物,研究反硝化细菌的群落结构、丰度与环境因子之间的相关性。（方法）实验对流溪河流域从上游至下游十个不同位点进行沉积物采样,进行环境因子（温度、pH、氨态氮、硝态氮、亚硝态氮、总氮、COD）理化数据测定,对narG基因和nitS基因构建基因文库,分析流溪河流域沉积物中反硝化细菌的群落结构和多样性,再结合实时荧光定量PCR法（RT-PCR）对反硝化细菌的丰度进行研究,并通过主坐标分析和冗余度分析等多变量统计分析方法研究了反硝化细菌的群落结构、丰度与环境因子之间的相关性。（结果）结果表明:十个位点环境因子数据显示,硝态氮（NO3-N）含量变化不大,浓度均接近3.0 mg/L、亚硝态氮（NO-N）浓度均很低,约为0.08 mg/L;narG基因和nirS基因文库分析显示流溪河流域不同采样位点的沉积物中反硝化菌群落结构表现出差异性,用MOTHUR软件对其做多样性指数分析,在所有采样点中7.-CH、6-LK、9-RH采样点的物种多样性指数相对于其他采样点较高,上游两个采样点（1-SK和2-WQ）的多样性指数低;荧光定量分析结果,反硝化细菌nirS基因拷贝数范围为7.89×10～3.34×10～4copies/g,narG基因拷贝数为5.97×10～2.64×10～4 copies/g,nirS基因丰度变化范围为0.01%.1%,narG基因丰度变化范围为0.01%.5%,构建系统发育树发现,沉积物样品中大多数nirS基因克隆与目前已知可培养的反硝化细菌的亲缘关系较远,大部分为未被认知的微生物类群,其中已知的nirS型反硝化菌属于变形菌Alpproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria,其中大部分属于Betaproteobacteria;最后用冗余分析（RDA）和典范对应分析（CCA）对三者相关性进行分析。（结论）结果显示,环境因子中亚硝态氮（NO）生化因子对反硝化细菌群落结构起着决定性的作用,与环境因子的相关性大小依次表现为:NO2-N>TN>NH4..N>COD>NO3-N>pH>Temp;反硝化细菌丰度与环境因子的Person相关系数分析表明,河流沉积物中总细菌16S rDNA基因丰度与环境因子之间无显著的相关性,而nirS基因型反硝化细菌数量与NH-N和IN因子浓度之间差异极显著（P<0.01）,与NO3-N因子差异显著（P<0.05）,narG基因型反硝化菌数量与NO因子浓度差异显著（P<0.05）,但与其它环境因子差异不显著（P>0.05）。

关键词： narG nirS 反硝化细菌群落结构丰度多样性环境因子

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田七总皂苷对PCV2诱导小鼠体内免疫细胞组蛋白乙酰化修饰的调节作用

田七总皂苷对PCV2诱导小鼠体内免疫细胞组蛋白乙酰化修饰的调节作...

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：杨剑尹丹郝祝兵韦英益胡庭俊广西大学动物科学技术学院

【目的】探讨田七总皂苷对PCV2诱导小鼠脾淋巴细胞组蛋白乙酰化修饰的调节作用,以及氧化应激与组蛋白乙酰化修饰之间的关系。【方法】84只昆明种小鼠随机分为7组(A、B、C、D、E、F、G组),雌雄各半,根据本课题组前期试验结果选择建立氧... 详细信息

【目的】探讨田七总皂苷对PCV2诱导小鼠脾淋巴细胞组蛋白乙酰化修饰的调节作用,以及氧化应激与组蛋白乙酰化修饰之间的关系。【方法】84只昆明种小鼠随机分为7组(A、B、C、D、E、F、G组),雌雄各半,根据本课题组前期试验结果选择建立氧化应激模型的感染方案及最佳感染时间:B、C、D、E、F组小鼠于实验第1d、2d、3d分别采用腹腔注射以及口服和滴鼻等三种途径联合感染PCV2病毒原液1mL/只,A、G组给予生理盐水1mL/只。第4d、5d、6d,C、D、E、G组小鼠分别给予腹腔注射不同剂量的田七总皂苷(50mg/kg·BW,100mg/kg·BW,200mg/kg·BW,200mg/kg·BW),F组小鼠给予腹腔注射维生素C(100mg/kg·BW),A、B组小鼠给予腹腔注射生理盐水。化学发光法检测抑制超氧阴离子活力、抑制·OH能力和过氧化氢含量,酶联免疫分析法测定组蛋白乙酰化酶(HAT)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)水平,Westernblotting检测Ac-H3、Ac-H4、β-actin蛋白表达水平。【结果】小鼠感染PCV2病毒后,脾脏抗超氧阴离子能力、抑制羟自由基能力显著降低;中、高剂量田七总皂苷均能显著上调感染小鼠脾脏抗超氧阴离子能力、抑制羟自由基能力,两者效果分别为与抗氧化剂VC相当、不如抗氧化剂VC;未感染PCV2病毒的小鼠腹腔注射田七总皂苷对小鼠脾脏抗超氧阴离子能力、抑制羟自由基能力无显著影响。小鼠感染PCV2病毒后,脾脏过氧化氢水平有所升高,低、中、高剂量的田七总皂苷处理后,感染小鼠脾脏过氧化氢水平有所降低但仍未达其效果不及抗氧化剂VC;未感染PCV2病毒的小鼠腹腔注射田七总皂苷对小鼠脾脏过氧化氢水平没有显著影响。小鼠感染PCV2病毒后,引起小鼠脾脏HAT活性的显著升高及HDAC活性的显著降低,导致细胞组蛋白趋于乙酰化修饰的状态;感染PCV2病毒的小鼠腹腔注射100mg/kg·BW、200mg/kg·BW田七总皂苷后,抑制了PCV2感染引起的小鼠脾脏HAT活性的升高,但对于感染小鼠脾脏HDAC活性没有显著影响。小鼠感染PCV2病毒后,引起脾脏组蛋白H3乙酰化水平显著升高,而对组蛋白H4乙酰化水平无显著影响;感染PCV2病毒的小鼠腹腔注射100μg/mL田七总皂苷后,抑制了PCV2感染引起的小鼠脾脏组蛋白H3乙酰化水平的升高。【结论】抗氧化剂维生素C通过抑制氧化应激引起的活性氧自由的升高,起到调节组蛋白乙酰化水平的作用;田七总皂苷对PCV2感染引起的小鼠脾脏自由基的增加有良好的清除作用,并且对小鼠脾脏H3乙酰化水平的升高能有效下调,主要通过抑制感染细胞HAT水平的升高达到调节细胞组蛋白乙酰化修饰的目的,进一步证明了氧化应激与组蛋白乙酰化之间紧密的联系。然而,氧化应激与组蛋白乙酰化失衡之间的关系仍需进一步研究。

关键词：田七总皂苷猪圆环病毒2型(PCV-2) 昆明种小鼠脾组蛋白乙酰化

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富营养化对大肠杆菌mar/sox调控系统的影响

富营养化对大肠杆菌mar/sox调控系统的影响

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：赖宝色苏俊峰刘梦莹李建武李健黄一帆俞道进福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室福建农业职业技术学院

【目的】从四个模型生态系统不同时期分离大肠杆菌,对多重耐药调控基因marA和soxS的mRNA表达水平进行研究,分析模型生态系统各环境因子与大肠杆菌marA和soxS的表达水平的相关性;对从模型生态系统低剂量组中分离的6株高水平耐药大肠杆菌... 详细信息

【目的】从四个模型生态系统不同时期分离大肠杆菌,对多重耐药调控基因marA和soxS的mRNA表达水平进行研究,分析模型生态系统各环境因子与大肠杆菌marA和soxS的表达水平的相关性;对从模型生态系统低剂量组中分离的6株高水平耐药大肠杆菌和2株敏感大肠杆菌进行OmpF表达水平研究,了解耐药性与OmpF表达水平之间的相关性。应用【方法】从样本大肠杆菌中提取总RNA,将获得的质量合格的RNA反转录成cDNA,并以样本cDNA为模板,采用实时荧光定量（Real-time PCR）技术对大肠杆菌多重耐药调控基因marA和soxS的mRNA表达水平进行研究;利用Pearson相关性分析法分析模型生态系统中各环境因子与marA和soxS的相关性:选取从低剂量组中分离的2株敏感菌株和6株高水平耐药菌株,利用Western Blot蛋白印迹法对大肠杆菌外膜孔蛋白OmpF的表达水平进行定量研究。【结果】（1）不同的富营养化水平的模型生态系统中,大肠杆菌marA和soxS的表达水平都发生了变化,空白组marA在添加氮磷营养盐后第24d表达明显提高,soxS在24d后表达明显提高;低剂量组marA在第1d后表达明显提高,soxS在第16d后表达明显提高;中剂量组marA表达水平在第24d后表达明显提高,soxS表达提高出现在24d;高剂量组marA在第32d后表达明显提高,soxS在第32d后表达明显提高。（2）Pearson分析结果显示,各剂量组中,marA和soxS的表达水平之间显著相关;空白组中,marA和soxS的表达水平与叶绿素a之间呈显著相关;低剂量组marA和soxS的表达水平与环境综合营养指数TLI显著相关,soxS表达水平与COD显著相关;中剂量组中marA和soxS的表达水平与COD显著相关;高剂量组中,marA表达水平与COD和TLI显著相关。仅低剂量组中出现了多重耐药率与soxS表达水平的显著相关性。（3）对大肠杆菌外膜孔蛋白表达水平的定量分析,结果显示,低剂量组中的多重耐药菌出现在16d之后,同时OmpF表达水平在16d后显著下调。【结论】（1）各剂量组中均有出现大肠杆菌marA和soxS的表达上调现象。低剂量氮磷营养盐能够使rnarA和soxS的表达上调现象提前出现。（2）氮、磷营养盐的加入使模型生态系统中环境因子发生变化造成富营养化,与大肠杆菌marA和soxS表达水平之间存在相关性;marA和soxS的增量表达与COD、叶绿素a和TLI之间存在相关性,推测模型生态系统中的有机物、氧自由基和氧化还原物质都有可能是诱导大肠杆菌marA和soxS过量表达的因素。（3）低剂量组中大肠杆菌OmpF的减量表达可能是marA和soxS的增量表达造成的,低剂量组中大肠杆菌OmpF的减量表达可能是marA和soxS的增量表达造成的,低剂量组中大肠杆菌出现的高水平耐药可能与marA和soxS的增量表达和OmpF的减量表达有关。

关键词：模型生态系统富营养化大肠杆菌 marA soxS OmpF

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基于猪CCR1和CCR5受体高通量细胞筛选模型的构建及其条件优化

基于猪CCR1和CCR5受体高通量细胞筛选模型的构建及其条件优化

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：柴继田王志强扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

为构建猪趋化因子受体1（CCR1）、趋化因子受体5（CCR5）真核表达载体并分析其信号通路,在细胞水平上初步探究了CC型趋化因子（RANTES）与CCR1和CCR5之间的关系,并建立CCR1和CCR5细胞模型并优化筛选条件,为筛选基于受体CCR1和CCR5的先... 详细信息

为构建猪趋化因子受体1（CCR1）、趋化因子受体5（CCR5）真核表达载体并分析其信号通路,在细胞水平上初步探究了CC型趋化因子（RANTES）与CCR1和CCR5之间的关系,并建立CCR1和CCR5细胞模型并优化筛选条件,为筛选基于受体CCR1和CCR5的先导化合物防控相关猪病奠定基础。本文利用PCR技术从猪的肌肉组织中扩增出1062bp的CCR1基因片段和1059bp的CCR5基因片段。将猪CCR1和CCR5基因连接到真核表达载体pcDNA3.1（+）并获得重组质粒pcDNA3.1（+）-myc/CCR1和pcDNA3.1（+）-myc/CCR5。将重组质粒转染到HEK293T细胞中,通过RT-PCR技术和Western blotting技术鉴定目的基因的转录和翻译。将重组质粒分别与pGL4.29[1uc2P/CRE/Hygro]或pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro]和pGL4.74[hRluc/TK]共转染到HEK293T细胞中,通过双荧光素酶报告基因法,使用微孔板多功能荧光素酶检测仪检测RANTES作用后荧光素酶的表达量。分别转染pcDNA3.1（+）-myc/CCR1与pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pcDNA3.1（+）-myc/CCR5与pGL4.33[luc2P/SR E/Hygro]重组质粒到CHO-K1细胞中,使用G418和潮霉素B加压筛选,通过有限稀释法和单荧光素酶报告系统检测荧光素酶荧光值的变化情况,筛选出稳定表达的CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1的单克隆细胞。然后对以该细胞株为模型的高通量筛选条件中涉及的化合物的作用时间、作用浓度、溶剂DMSO的浓度进行了优化,优化的结果以Z'因子进行评价。构建的pcDNA3.1（+）-CCR1和pcDNA3.1（+）-CCR5基因序列正确,猪CCR1和CCR5受体蛋白可正常表达,且具有良好的生物活性。RANTES作用于猪CCR1能够降低由Forskolin升高的cAMP水平,对CRE元件表现出抑制效应,而对SRE有激活作用;RANTES作用于猪CCR5能够激活CRE和SRE反应元件。获得了稳定表达目的基因的细胞模型CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1,优化后的高通量筛选的条件为:药物作用时间为9h,药物作用浓度10M,Forskolin作用浓度为2μM,作用时间为1-2h,溶剂DMSO浓度小于2%,此时猪CCR1/CRE-CHO-K1细胞株Z'因子为0.59,CC5/SRE-CHO-K1细胞株Z'因子为0.60,说明筛选方法适合高通量筛选。本试验构建出pcDNA3.1（+）-CCR1和pcDNA3.1（+）-CCR5真核表达载体,初步阐明了RANTES与猪CCR1和CCR5作用后细胞内信号活动情况,为进一步研究猪CCR1和CCR5在猪病中的生物功能奠定基础。构建的细胞模型CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1可以用于活性化合物的筛选,为防治该通路参与的相关猪病奠定基础。

关键词：猪趋化因子受体1 趋化因子受体5 真核表达载体细胞模型

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鸡黑素皮质素4受体cAMP/PKA信号通路特点及其细胞筛选模型的建立

鸡黑素皮质素4受体cAMP/PKA信号通路特点及其细胞筛选模型的建立

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：周家华王志强扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

本文旨在研究三种黑素皮质素4受体（MC4R）激动剂和拮抗剂对鸡MC4R（cMC4R）WT及4个突变体（Q18H、G21R、S76L和L299P）cAMP/PKA信号通路的影响,建立了基于cMC4R信号通路以cMC4R为靶点的细胞筛选模型。将cMC4RWT及4个突变体的真核表达... 详细信息

本文旨在研究三种黑素皮质素4受体（MC4R）激动剂和拮抗剂对鸡MC4R（cMC4R）WT及4个突变体（Q18H、G21R、S76L和L299P）cAMP/PKA信号通路的影响,建立了基于cMC4R信号通路以cMC4R为靶点的细胞筛选模型。将cMC4RWT及4个突变体的真核表达质粒与萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]、海肾荧光素酶内参质粒pRL-TK共转染入HEK293T细胞,应用双报告基因法检测受体在无配体作用时荧光素酶的表达水平;检测受体在激动剂（α-MSH、β-MSH、NDP-MSH）的作用下荧光素酶的表达量;将cMC4RWT真核表达质粒与报告基因质粒、内参质粒共转染HEK293T细胞,检测受体在拮抗剂SHU9119和激动剂（α-MSH、β-MSH、NDP-MSH）的共同作用下荧光素酶的表达量。将cMC4R WT真核表达质粒与报告基因质粒按1:5的比例共转染到CHO-K1细胞,经G418（800μg/ml）和潮霉素B（400μg/ml）抗性筛选后,利用有限稀释法获得稳定表达目的基因的单克隆细胞株,利用RT-PCR从转录水平验证了目的基因的表达;排查cMC4R阳性细胞株内源性干扰,构建稳定表达cMC4R和萤火虫荧光素酶的细胞系;优化细胞筛选模型中配体浓度、作用时间以及二甲基亚砜（DMSO）溶剂的用量;采用Z'因子评估系统的稳定性和可靠性。结果显示,Q18H的基础活性极显著高于WT（P<0.01）,L299P的基础活性极显著低于WT（P<0.01）,G21R和S76L的基础活性与WT的相比差异不显著（P>0.05）。对于cMC4R WT及4个突变体,三种激动剂的内在活性为:NDP-MSH>α-MSH=β-MSH。4个突变体中cMC4R L299P的cAMP水平极显著低于cMC4RWT（P<0.01）,说明该突变对cMC4R结构和功能的影响较大,使cMC4R几乎失去了与激动剂的结合能力。无论何种激动剂与cMC4R WT作用,高浓度和中浓度的SHU9119都能够显著抑制激动剂的激动作用,低浓度的SHU9119抑制作用不明显。经有限稀释法获得了萤火虫荧光素酶的相对表达量最高的单克隆阳性细胞株A2;RT-PCR在预期位置扩增出两条目的条带;对细胞筛选模型进行优化显示,当激动剂NDP-MSH终浓度为10mol/L,NDP-MSH孵育时间为8h,溶剂DMSO终浓度小于2%时,筛选模型Z'因子为0.82,说明建立的筛选方法可靠、稳定,可以用于cMC4R激动剂和反向激动剂的筛选。本实验证实了cMC4R WT及4个突变体（Q18H、G21R、S76L、L299P）真核表达质粒能在体外细胞中表达,且具有生物学活性。成功建立了以cMC4R为靶点的细胞筛选模型,为筛选出cMC4R激动剂和反向激动剂奠定了基础。

关键词：鸡黑素皮质素4受体突变体信号通路细胞筛选模型

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