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甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌分型及流行概况

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌分型及流行概况

引用

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：孙城涛汪洋吴聪明中国农业大学动物医学院

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）在医院病人、社区人群和养殖动物中广泛流行,已成为全球严峻的临床及公共卫生问题。对分离株进行分型是揭示MRSA流行规律与传播机制的基础。早期的SA流行病学研究主要采用噬菌体分型等表型方法,如50... 详细信息

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）在医院病人、社区人群和养殖动物中广泛流行,已成为全球严峻的临床及公共卫生问题。对分离株进行分型是揭示MRSA流行规律与传播机制的基础。早期的SA流行病学研究主要采用噬菌体分型等表型方法,如50年代在澳大利亚和加拿大出现大流行的青霉素耐药SA由于对噬菌体80和81敏感即称之为80/81株。随着分子生物学技术的发展,更加可靠和有效的分子分型技术已取代了表型方法,如脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gelelectrophorcsis,PFGE）、多位点序列分型（mulfilocus sequence typing,MLST）等,应用这些技术,可获得感染或流行MRSA菌株的型别以及其来源等信息。除上述各种细菌均可通用的分子分型技术外,还有两种专用于葡萄球菌甚至MRSA的分型技术。spa分型是针对金黄色葡萄球菌蛋白A基因可变区（X区）的串联重复序列出现次数和排列方式所开展的分型,目前已广泛用于MRSA分型。SCCmec分型是专门针对葡萄球菌所独有的SCCmec结构建立的分型技术,也是最复杂的MRSA分子分型技术。SCCmec型主要由ccr基因复合体和mec复合体共同决定,而J区决定SCCmec的亚型。已发现的SCCmec型和亚型越来越多,为了避免命名的混乱,国际上成立了SCC分类工作组（IWG-SCC）并建立了统一的SCCmec分型原则。SCCmec基因分型结果显示,目前流行的医院获得性MRSA（HA-MRSA）基因型多为SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型,具有多重耐药特点,除携带mecA基因外还带有其他耐药基因;社区获得性MRSA（CA-MRSA）基因型多为SCCmecⅣ型和V型,SCCmecⅣ型又分为a、b、c、d 4个亚型,SCCmecⅣ和V型的基因盒较短,除了携带mecA基因外几乎不带其他耐药基因,对非β-内酰胺类抗菌药物较为敏感。近年来发现,一些MRSA菌株尤其是携带新型SCCmec元件的菌株也难以通过PFGE、MIST、spa、dru等技术分型,而不断发展完善的高通量全基因组测序技术正在MRSA分子流行病学和溯源研究方面显示出潜力。Harrison等就利用该技术证明了在丹麦出现的mecC-MRSA ST130具有在人和动物之间传播的能力。自1961年首次分离到MRSA以来已发现了多种克隆型的MRSA。全世界已分离到的人源MRSA绝大多数都可归入5个克隆群（CCs）:5,8,22,30和45。最早流行的MRSA克隆（ST250）属于CC8,SCCmec为I型。后来出现的许多重要MRSA克隆,包括在80年代大流行的MRSA均为同一克隆群,但却携带了新的SCCmec（Ⅱ和Ⅲ）,如Iberian克隆（ST247）、Brazilian/Hungarian克隆（ST239）。再之后出现的主要MRSA克隆有NewYork/Japan克隆（ST5,USA100）、"paediatric"克隆（ST5）,它们均属于CC5。动物源MRSA最早于1972年从奶牛乳房炎病例中发现。近10年来,有关动物源MRSA的研究报告越来越多,目前已分离到特定基因型MRSA的养殖动物有奶牛（ST1、ST8、CC97、CC126、CC130、CC133、CC705、ST398、ST425）、猪（ST9、ST398）、绵羊（CC130、CC133、STl464）、山羊（CC133）、鸡（ST1、CC5、ST9、CC385、ST398）、火鸡（CC5）、兔（ST121）、马（ST1、ST8、ST398）等,提示动物也成为MRSA的重要贮库。脉冲场电泳、多位点序列分型、spa分型、SCCmec分型以及高通量全基因组测序技术在MRSA分型中各有优缺点,适用于不同分型要求。MRSA的传播具有明显克隆传播的特征,掌握MRSA的分子分型对于鉴别菌株间的亲缘性、揭示MRSA流行规律与传播机制乃至有效控制感染意义重大。

关键词：甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌分子分型流行概况

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伏马毒素单链抗体制备及其识别机制初步研究

伏马毒素单链抗体制备及其识别机制初步研究

引用

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：李成龙余清于雪芝温凯张素霞王战辉中国农业大学动物医学院/动物源食品安全检测技术北京市重点实验室

【目的】在荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay,FPIA）中,伏马毒素B（fumonisin B,FB）的单克隆抗体4F5（mAb 4F5）对伏马毒素B（fumonisin B,FB）存在2.3%的交叉反应,而另一个抗FB的mAb 489对FB2的交叉反应率为98.9%。为阐明mAb 4F5和mAb 489识别FBl和FB2存在差异的原因,本试验制备了两株相应的单链抗体,并借助同源模拟和分子对接,对抗体与小分子的识别机制进行了初步研究。【方法】以杂交瘤细胞株4F5和489为起点,采用基因工程技术获取mAb 4F5和mAb 489的可变区基因序列,分别制备单链抗体4F5（scFv 4F5）和scFv 489,用SDS-PAGE、Western-blotting和ELISA等方法对其进行鉴定,并比较单链抗体与其母本单克隆抗体在FPIA中的识别特性。借助Discovery Studio中MODELER程序构建scFv 4F5和scFv 489的三维结构,结合Ramachandran Plot和Profiles-3D对所得模型进行评估。利用CDOCKER将FB和FB小分子与两个单链抗体模型分别进行对接,获取空间识别信息。【结果】成功制各了scFv4F5和scFv489,SDS-PAGE显示分子大小均约为30 KDa,与预期结果一致。在FPIA中,对于scFv 4F5,FB的半数抑制浓度(IC)为30.0 ng mL,与FB2的交叉反应率为2.0%,该单链抗体具有与母本单克隆抗体一致的生物学活性;对于scFv 489,FB的IC50为127.9 ng mL,与FB的交叉反应率为420.2%,此单链抗体基本保持了亲本单克隆抗体的特性,因此可将scFv 4F5和scFv 489作为抗体与小分子识别机制研究的对象。模型评估均表明scFv 4F5和scFv 4B9的三维结构是合理可信的。与scFv 4F5对接结果显示,FB和FB位于同一识别腔中,与CDR L1的Tyr残基,CDR L3的Tyr残基和CDR H3的Arg、Thr和Tyr残基间均存在分子间氢键;但FB多出的一个羟基,朝向口袋内侧,且与位于CDR H3的233位Tyr和235位Tyr残基生成分子间氢键;通过计算结合自由能可知,E（scFv 4F5-FB2）为-78.9 kcal mol,其远大于E（scFv4F5-FB）的-142.6 kcal mol,故scFv 4F5对FB2亲和力低,识别能力差。与scFv 489对接结果显示,FB和FB位于同一结合口袋中,均与CDRL1的His和Tyr残基、CDRL3的Tyr残基、CDR H1的Set残基和CDRH3的Arg残基生成分子间氢键;而FB多出的一个羟基,朝向口袋外侧,不参与分子间相互作用,从而使得scFv489对FBl和FB2的识别能力相当;结合自由能E（scFv489-FB）为-88.9 kcal mol略大于E（scFv489-FB）的-94.7kcal mol,可得知scFv489对FB的亲和力稍高。另外,结合自由能E（scFv4F5-FB）低于E（scFv 489-FB）,可在一定程度上解释在使用抗体4F5检测FB时,方法更为灵敏的原因。【结论】同源模建和分子对接较好解释了两株单克隆抗体对两种小分子识别能力存在差异的原因,即抗体对靶分子亲和力的不同,与小分子结构及分子间的作用力密切相关。

关键词：伏马毒素单链抗体同源模建分子对接交叉反应率

来源：评论

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不同猪群副猪嗜血杆菌的分布与分型及耐药性研究

不同猪群副猪嗜血杆菌的分布与分型及耐药性研究

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：高婷林晶丘建龙张洁李健马玉芳黄一帆俞道进福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室

【目的】本研究对福建省东部沿海地区的副猪嗜血杆菌疑似病例及某一具体猪场内部不同猪群的副猪嗜血杆菌进行分离鉴定、血清学分型、分子分型及药敏试验等开展研究,为我国和福建地区及场内部的副猪嗜血杆菌的流行、分布和临床用药提供... 详细信息

【目的】本研究对福建省东部沿海地区的副猪嗜血杆菌疑似病例及某一具体猪场内部不同猪群的副猪嗜血杆菌进行分离鉴定、血清学分型、分子分型及药敏试验等开展研究,为我国和福建地区及场内部的副猪嗜血杆菌的流行、分布和临床用药提供切实的基础数据。【方法】临床无菌采集病料及各阶段猪群鼻腔拭子样本,采用胰蛋白胨琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨肉汤培养基(TSB)与16S rRNA PCR进行分离鉴定。将分离到的副猪嗜血杆菌送往华中农业大学动物传染病诊断中心,通过传统的KRG琼脂扩散法,进行血清型分型鉴定。并通过ERIC-PCR分型技术对其进行基因分型。同时还利用肉汤稀释法对临床分离株进行耐药性研究。【结果】从336份样品中分离出副猪嗜血杆菌57株,分离率为16.96%,其中分离率最高的为气管39.13%,肺脏、鼻腔、心脏、淋巴结、肾脏、脾脏和心包积液的分离率分别为18.37%、18.25%、9.68%、3.45%、7.14%、3.45%和11.11%;其中126份健康鼻拭子中分离出副猪嗜血杆菌23株,分离率为18.25%,其中分离率最高的是育肥猪41%,哺乳仔猪、保育仔猪和后备母猪的分离率分别为25.00%、34%和15%;经产母猪鼻拭子中没有分离到HPS。57株临床分离菌的血清型中包括血清型1(4株)、血清型2(5株)、血清型5(1株)、血清型10(8株)、血清型11(2株)、血清型12(2株)、血清型13(1株)、血清型14(2株)和血清型15(2株);另外还有7株有交叉反应和23株不可分型的菌株。ERIC-PCR结果显示HPS基因分型具有很强的多样性,共表现出51种不同的ERIC-PCR基因型,识别率为100%。通过对ERIC-PCR谱图的聚类分析,大致可将其分为两个大的集群(A集群和B集群)共6个小集群,其中所有健康猪群鼻腔拭子分离株的ERIC-PCR图谱相似,均被归为B集群中(图3-2),而A群中除两株外均分离自疑似发病猪,可见疑似发病猪体内的HPS的基因型不同于健康猪群。同时对同一猪场健康猪群的气管和鼻腔分离株进行ERIC-PCR研究,结果显示,同一猪场不同分离部位的HPS的基因型也存在差异。药敏试验结果显示,所有临床分离的57株副猪嗜血杆菌敏感率较高的药物有阿奇霉素(56,98.3%)、氨苄西林(54,94.7%)、头孢噻肟(53,93.0%)和氯霉素(40,70.2%);另外,试验菌株对四环素的耐药率高达49.12%(28株)。副猪嗜血杆菌对环丙沙星的耐药率为12.28%,但其42.11%(24株)的菌株都处于中介值。【结论】1、福建东部沿海地区猪场的HPS主要以血清型10、1、2和不能分型的为主,血清型5、11、12、13、14和15仅有少数分离,且血清型3、4、6、7、8和9没有分离到。2、在ERIC-PCR基因分型中,发现HPS具有很强的基因多样性,而且HPS的基因型差异不仅存在于健康猪群和病猪群之间,也存在于健康猪群内的气管和鼻腔之间。3、同一猪场流行的副猪嗜血杆菌同源性具有一定相似性,不同猪场间的HPS在同源性上具有一定的差异。4、在耐药性的研究中,发现福建东南部地区的HPS对头孢噻肟、阿米卡星和氨苄西林敏感性高,而对四环素具有较强的耐药性,同时对环丙沙星也不敏感,这为该地区的临床用药的选择提供了确实的参考。

关键词：副猪嗜血杆菌基因分型 ERIC-PCR 血清型分型耐药性

来源：评论

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低水平氮磷营养盐对水源性大肠杆菌群体感应系统的影响

低水平氮磷营养盐对水源性大肠杆菌群体感应系统的影响

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：黄启发徐超侯雪含张洁李健黄一帆俞道进福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室

【目的】通过建立模型生态系统,研究低水平氮磷营养盐对氨苄西林（AMP）、头孢唑啉（CFZ）、头孢噻肟（CTX）、庆大霉素（GM）、四环素（TE）、环丙沙星（CIP）和氯霉素（CHL）7种抗生素耐药表型产生的影响,了解大肠杆菌在不同剂量营养... 详细信息

【目的】通过建立模型生态系统,研究低水平氮磷营养盐对氨苄西林（AMP）、头孢唑啉（CFZ）、头孢噻肟（CTX）、庆大霉素（GM）、四环素（TE）、环丙沙星（CIP）和氯霉素（CHL）7种抗生素耐药表型产生的影响,了解大肠杆菌在不同剂量营养盐条件下耐药性的维持和变化;分析得到的多重耐药大肠杆菌与群体感应系统调控相关的6个基因sdiA、lsrR、lsrADB、ftxE、ftsQ和hflX表达水平的相关性。方法:建立模型生态系统,共设4个剂量组和一个空白组,每个剂量设置2个重复,分别添加低水平的磷酸二氢钠（NaHPO）和硝酸铵（NHNO）营养盐使TN和TP最终浓度分别为1.50 mg/L,0.15mg/L;2.50mg/L,0.25mg/L;3.50mg/L,0.35mg/L;4.50mg/L,0.45mg/L。采集第0d、1 d、8d、15 d、22 d、29 d、36 d、54 d、85 d模型生态系统的水样并测定TN、TP、COD和Chla 4个水质指标,同时分离、鉴定和保存相应时间点的大肠杆菌;用微量肉汤稀释法检测分离菌对7种抗生素的敏感性,探讨不同氮磷营养盐浓度对大肠杆菌耐药性的影响。以分离到对AMP和CFZ高水平耐药的大肠杆菌为材料,应用Real-time PCR检测调控QS的6个基因sdiA、lsrR、lsrADB、ftsE、ftsQ和hflX的表达水平。用Pearson相关性分析法分析耐药水平和6个基因的表达水平相关性。【结果】（1）添加不同剂量低水平的氮磷营养盐可以引发***的耐药。对AMP和CFZ的耐药最明显,大部分表现为高水平的耐药,且二者变化相似,超低剂量组第15 d和第22 d分离到敏感菌,其它都为高水平耐药菌;低剂量组第1 d和第8 d分离到对AMP敏感菌,对CFZ表现为低水平的耐药菌,其余都是高水平耐药菌;中剂量组整个过程都分离到对两种药物表现为高水平的耐药菌;高剂量组第8 d和第15 d分离到敏感菌,其它都为高水平耐药菌。不同剂量组分离到少量对CTX的耐药菌,没有明显规律性变化。高剂量组的第8 d和第15 d分离到低水平的耐GM的大肠杆菌,第22 d分离到对TE的高水平耐药菌,没有分离到对CIP和CHL的耐药菌。（2）水质指标TN、TP、COD、Chla和大肠杆菌对7种药物耐药水平的相关性系数都比较低,但是TN与大肠杆菌对AMP、CFZ和GM耐药水平的相关系数分别为0.447、0.38和00388,呈低度的相关性;COD与大肠杆菌对AMP、CFZ和CTX的相关系数分别为0.605、0.507和0.566,呈低度的相关性。（3）细菌对AMP和CFZ的耐药水平与基因ftsQ表达水平呈负相关,与另外5个基因表达水平呈正相关。超低剂量组:对AMP的耐药水平和基因lsrR、lsrADB、ftsE和hflX的表达水平呈显著的相关性:对CFZ的耐药水平和基因sdiA、lsrR、lsrADB和hfLX的表达水平呈低度的相关性。低剂量组:对AMP的耐药水平和基因表达水平呈弱的相关性;对CFZ的耐药水平和基因sdiA、lsrR和hflX的表达水平呈低度的相关性。中剂量组:对AP的耐药水平和基因lsrR、ftxE的表达水平呈显著的相关性,与基因sdiA和ftsQ的表达水平呈低度的相关性;对CFZ的耐药水平与基因lsrR的表达水平呈显著的相关性,与基因ftsQ表达水平呈低度的相关性。高剂量组:对AMP的耐药水平和基因lsrR、lsrADB和ftsE的表达水平呈显著的相关性,与基因hlfX表达水平呈低度的相关性;对CFZ的耐药水平与基因ftsE和hflX的表达水平呈显著的相关性,与基因lsrR和lsrADB的表达水平呈低度的相关性。【结论】（1）模型生态系统分离到对AMP和CFZ高水平耐药大肠杆菌与加入的氮磷营养盐有关,但是与加入氮磷营养盐剂量没有明显的关系。（2）模型生态系统分离到对AMP和CFZ高水平耐药与TN和COD有一定的相关性,但是不显著。（3）大肠杆菌对CFZ和AMP的高水平耐药与sdA、lsrR、lsrADB、ftsE和hflX5个基因的增量表达相关,同时与基因ftsQ的减量表达相关。（4）水源性大肠杆菌可以通过群体感应系统调控相关基因的表达水平,应对氮磷营养盐的刺激而产生高水平耐药菌。

关键词：模型生态系统大肠杆菌耐药水平群体感应系统低水平氮磷营养盐

来源：评论

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猪场饮用水肠球菌的分离鉴定及其耐药性分析

猪场饮用水肠球菌的分离鉴定及其耐药性分析

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：徐超林福陈晓刚汪燕秋李健黄一帆俞道进福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室

肠球菌(Enterococcus)是重要的环境指示菌,同时又是潜在的动物条件性致病菌。动物饮用水中的肠球菌耐药的相关研究目前未见报道,本实验采集猪场不同来源的饮用水、分离鉴定肠球菌,测定肠球菌的耐药现状。目的:了解不同地区、不同猪场来... 详细信息

肠球菌(Enterococcus)是重要的环境指示菌,同时又是潜在的动物条件性致病菌。动物饮用水中的肠球菌耐药的相关研究目前未见报道,本实验采集猪场不同来源的饮用水、分离鉴定肠球菌,测定肠球菌的耐药现状。目的:了解不同地区、不同猪场来源的饮用水肠球菌对土霉素(OXY)、氨苄西林(AMP)、环丙沙星(CIP)、万古霉素(VAN)、氯霉素(CHL)、红霉素(ERY)的耐药情况,了解猪场水源进水口、蓄水池、怀孕舍饮水、分娩舍饮水、保育舍饮水及肥育舍饮水等饮用水肠球菌属细菌抗生素耐药表型及耐药谱,试图探讨猪场水源与饮水器出水在肠球菌耐药方面的差异并分析原因,为猪场饮用水细菌耐药提供基础数据。方法:采集南平地区9个猪场和福州地区11个猪场不同来源的饮用水。富集培养水样中的微生物,进行肠球菌的分离培养并通过生化、PCR方法鉴定肠球菌菌株,保存。采用微量肉汤稀释法对分离菌进行药物敏感性实验,测定肠球菌对抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。获得猪场饮用水肠球菌各个采样点的耐药表型,分析耐药谱,了解猪场饮用水肠球菌的耐药情况及分布特点。结果:(1)南平地区9个猪场42株饮用水分离菌对抗生素的耐药率由高到低分别为:土霉素>红霉素>氯霉素>环丙沙星>氨苄西林>万古霉素。其中对土霉素、红霉素的耐药率最高,分别为:80.95%、66.67%;对氯霉素、环丙沙星、氨苄西林的耐药率稍低,分别为35.71%、19.05%、16.67%;分离出6株VRE,耐药率为14.29%。(2)福州地区11个猪场46株饮用水分离菌对抗生素的耐药率由高到低分别为:红霉素>土霉素>氯霉素>环丙沙星>氨苄西林>万古霉素。对前四种药的耐药率都超过50%,分别为:84.78%、76.09%、67.39%、50%,对氨苄西林的耐药率较低,为19.57%,分离出2株VRE,耐药率为4.35%。(3)南平地区9个猪场源头饮用水与饮水器饮用水肠球菌耐药比较:水池进水口及蓄水池分离菌总体表现为对土霉素和红霉素耐药,耐药率较饮水器饮用水分离菌略低,对土霉素的耐药率分别为77.78%、87.5%,对红霉素的耐药率分别为55.56%、50%;对氯霉素、环丙沙星、氨苄西林的耐药显著低于饮水器分离菌,水池进水口的耐药率分别为22.22%、11.11%、11.11%,蓄水池的耐药率分别为25%、0%、12.5%;保育舍饮水器分离菌对所有药物都有更高的耐药率,其次为母猪舍饮水器、育肥舍饮水器。共分离出6株VRE,其中4株来自猪场源头饮用水,2株来自饮水器饮用水。(4)福州地区11个猪场源头饮用水与饮水器饮用水肠球菌耐药比较:蓄水池分离菌总体表现为对土霉素、红霉素、氯霉素耐药,耐药率较饮水器饮用水分离菌略低,为72.73%、72.73%、63.64%,对环丙沙星、氨苄西林的耐药显著低于饮水器分离菌,分别为27.27%、9.09%。保育舍饮水器分离菌对所有药物都有更高的耐药率,其次为育肥舍、哺乳舍、怀孕舍饮水器。共分离出2株VRE,分别来自蓄水池和育肥舍饮水器。(5)猪场饮用水耐药谱分析南平地区9个猪场饮用水肠球菌一共有11种耐药谱,福州地区11个猪场一共有13种耐药谱,南平地区猪场发现有11株分离菌对4～5种抗生素耐药,其中有5株来自保育舍饮水器。福州地区猪场有19株分离菌对4～5种的抗生素耐药,有5株来自保育舍饮水器,且其中有4株表现对5种抗生素耐药。水池进水口及蓄水池分离菌的多重耐药率均低于饮水器分离菌,保育舍饮水器多重耐药率最高结论:(1)猪场源头饮用水与饮水器饮用水分离菌对土霉素和红霉素普遍耐药。源头饮用水分离菌对氯霉素、环丙沙星、氨苄西林的耐药率普遍低于饮水器饮用水,保育舍饮水器分离菌的抗生素耐药率普遍高于其它采水点。(2)两个地区的猪场饮用水分离菌的抗生素耐药谱较多,多重耐药现象也较严重。南平地区9个猪场的保育舍饮水器分离菌的多重耐药率最高,福州地区11个猪场的保育舍、育肥舍饮水器分离菌的多重耐药率最高。

关键词：猪场饮用水肠球菌抗生素耐药多重耐药

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氮磷营养盐条件下水源性大肠杆菌生物膜形成与耐药的相关性

氮磷营养盐条件下水源性大肠杆菌生物膜形成与耐药的相关性

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：肖正润刘梦莹陈秀萍李健汪燕秋黄一帆俞道进福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室

目的:本试验通过建立微宇宙,观察微宇宙中较低浓度的氮磷营养盐对大肠杆菌耐药表型和生物膜形成能力的影响,以及大肠杆菌生物膜形成过程中有关基因（luxS、mqsR和运动性基因flhD、iliA、motA,以及I型菌毛基因fimH）的相对表达量,确定在... 详细信息

目的:本试验通过建立微宇宙,观察微宇宙中较低浓度的氮磷营养盐对大肠杆菌耐药表型和生物膜形成能力的影响,以及大肠杆菌生物膜形成过程中有关基因（luxS、mqsR和运动性基因flhD、iliA、motA,以及I型菌毛基因fimH）的相对表达量,确定在氮磷营养盐条件下大肠杆菌生物膜形成与细菌耐药的相关性。方法:根据本课题组之前所获得的试验结果及微宇宙中总氮（TN）、总磷（TP）的基底值,设置了空白组和处理组（其中,处理组包括4个添加了较低浓度的氮磷营养盐的剂量组）,每个组设置两个重复。测定水质指标中的TN、TP浓度及高锰酸盐指数(COD),观察其变化情况;采集并分离纯化大肠杆菌样本,然后用CLSI推荐的微量肉汤稀释法检测大肠杆菌对7种抗生素的耐药情况;采用定性检测（玻璃试管法）和半定量检测样品菌生物膜的形成能力,了解较低浓度氮磷营养盐对大肠杆菌生物膜形成的影响;最后利用实时荧光定量PCR检测大肠杆菌生物膜6个相关基因mRNA的表达水平,探讨其与大肠杆菌生物膜形成的相关性。结果:（1）添加较低浓度的氮磷营养盐后,微宇宙中的TN浓度总体来看变化不明显;TP浓度在加入氮磷后不久所有剂量组均降至基底值水平;各剂量组的COD在整个试验过程中没有规律性变化。药物敏感性试验结果显示,空白组没有分离到耐药菌株,各处理组的耐药率及多重耐药率均很高,其中中剂量组的整体耐药率最高,其次是高剂量组,最低剂量组和低剂量组的耐药率最低。各处理组主要是对头孢唑啉和氨苄西林的耐药（耐药率大部分在50%-100%的范围内）,其次是头孢噻肟（耐药率大都低于50%）;而最低剂量组、中剂量组和高剂量组分离获得的菌株中均被检测出对四环素的耐药,高剂量组更是出现了对氯霉素的耐药,但对这两种抗生素的耐药率都比较低。（2）在添加氮磷营养盐后,定性检测生物膜形成情况的结果显示,中剂量组形成的生物膜较其它组明显,其次是低剂量组和高剂量组,最低剂量组形成的生物膜是最不明显的。半定量试验的结果显示,中剂量组分离到的大肠杆菌的整体粘附能力最强,其次是高剂量组,再是低剂量组和最低剂量组。结合所选取样品菌的耐药情况可以发现:细菌耐药,形成的生物膜就比较明显:相反,细菌不耐药,形成的生物膜就比较不明显。（3）分别以第0 d和空白组采集的样品作为校准样品,将实时荧光定量PCR检测结果进行计算。结果均显示了各处理组在加入氮磷营养盐后的第1 d开始luxS、flhD、fliA、motA和flmH基因就出现了相应的表达,区别在于表达水平的高低以及表达持续时间的长短,而mqsR则基本不表达。此外,flhD、fliA、motA和fimH基因的表达水平变化趋势基本一致,其中fliA和motA的总体表达水平最高,其次是fimH,最后则是flhD。结论:（1）添加较低浓度的氮磷营养盐,可以导致微宇宙中分离到的大肠杆菌出现较高水平的耐药,甚至是多重耐药。中剂量组的氮磷营养盐浓度（TN和TP终浓度分别为3.5 mg/L、0.35 mg/L）对大肠杆菌耐药性的产生影响最大。（2）低浓度氮磷营养盐对微宇宙中的大肠杆菌生物膜形成有明显影响。本试验中,细菌耐药与生物膜形成能力之间有直接的相关性。（3）添加较低浓度的氮磷营养盐后,微宇宙中大肠杆菌的生物膜形成能力增强,且与luxS、flhD、fliA、motA和fimH5个基因有关,与mqsR无关。（4）在微宇宙中添加较低浓度的氮磷营养盐后,出现的大肠杆菌耐药与多重耐药和生物膜形成能力呈正比,而与鞭毛基因及菌毛基因的表达水平和维持时间呈反比。3个鞭毛基因和菌毛基因flmH的表达水平呈正相关。

关键词：微宇宙氮磷营养盐大肠杆菌抗生素耐药生物膜生物膜基因

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放射性标记技术在兽药安全评价中的应用

放射性标记技术在兽药安全评价中的应用

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：潘源虎朱洪鹏谢书宇陶燕飞陈冬梅黄玲利刘振利袁宗辉农业部兽药残留检测重点实验室/国家兽药残留基准实验室(HZAU)华中农业大学动物医学院

兽药的安全评价的最重要的的目的之一就是为了保障人的食品安全,包括系统开展兽药的毒理学、代谢动力学和残留消除研究,确定人日允许摄入量（ADI）,残留标示物和靶组织,进而制订出最高残留限量（MRL）和休药期,从而对兽药进行最好的风... 详细信息

兽药的安全评价的最重要的的目的之一就是为了保障人的食品安全,包括系统开展兽药的毒理学、代谢动力学和残留消除研究,确定人日允许摄入量（ADI）,残留标示物和靶组织,进而制订出最高残留限量（MRL）和休药期,从而对兽药进行最好的风险管理。FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会（JECFA）对于MRL的制订方法,推荐采用放射标记药物在靶动物的代谢研究来确定靶组织和标示残留物,进行药物在靶动物的总残留消除试验确定总残留物与标示残留物的比率,制订出科学合理的MRL值。本文将从放射性示踪技术在兽药在动物体内的ADME及残留消除研究方面的运用来阐述该技术在兽药的安全评价中的重要性。研究药物在体内的吸收时采用放射性标记药物,借助液闪计数器可以直接测定给药后不同时间点生物样品中的放射性浓度,计算得到药物吸收速率、达峰时间和生物利用度等参数。全面研究药物在体内的代谢,可以阐明兽药在动物体内的代谢途径,预测药物的药效及其潜在的毒性作用。但是药物在体内往往代谢生成多种代谢产物,而放射性示踪技术则可以明确区分与药物相关的代谢物,随着高效液相与放射性检测和质谱联用,能够实现对兽药相关的代谢物同时进行定性和定量分析,而且可以方便地比较药物在不同种属的代谢情况。对于药物排泄研究,即使不知道代谢物具体信息,利用放射性特点通过分别测定粪便、尿液和胆汁样品的总放射量,从而获得物料平衡的准确信息。如对阿维菌素同系物MAB1a的研究采用和C双标记方法研究其鸡体内代谢。连续口服给药7d（1mg/kg bw/d）,收集每天的鸡蛋和粪便,分离鸡蛋的蛋白和蛋黄,停药后20h宰杀鸡,收集肝脏、肾脏、心脏、肌肉、脂肪、卵巢、肌胃、消化道和内容物、尸体等检测。在粪便和消化道及其内容物中回收到总给药放射性的70%,组织和鸡蛋中回收了6%。分离和鉴定了两个代谢产物及其8个结合物,占组织和鸡蛋的总放射性的8～70%,并证明了MAB1a在禽类和哺乳动物体内生物转化不同。放射性示踪技术在兽药的安全评价中最具特色可能就是在残留消除研究中的应用。通过对不同的靶动物使用放射性标记的药物,在不同的时间点检测不同组织中的放射性水平,确定残留靶组织,并对靶组织中的各个代谢产物先定性（确定其结构）、后定量（确定其含量）,从而确定靶组织的主要代谢产物（含量>10%）和其结构,然后在主要代谢产物中,将那些与总残留呈稳定比例关系又能在体外稳定存在的一种或几种代谢产物拟定为残留标示物。如研究罗硝唑在火鸡和猪体内的残留消除,给火鸡和猪服用C标记的罗硝唑,到休药期第10天的时候残留量分别为鸡肉0.26 mg/kg,肾脏0.14mg/kg和肝脏0.05mg/kg。休药期42天时,罗硝唑在猪体内残留量分别为肌肉130μg/kg,肝脏、肾脏和脂肪大约50-60μg/kg。由于在猪和火鸡的残留消除实验中肌肉在休药期后药物的残留量最高,最终确定罗硝唑在火鸡和猪中的残留靶组织均为肌肉。又如对头孢噻呋残留标示物的确定,利用C标记的头孢噻呋动物体内进行残留研究。在肾脏中,主要的存在物是去呋喃甲酰基头孢噻呋半胱氨酸二硫化物;在肝脏中,主要的代谢物是去呋喃甲酰基头孢噻呋和3,3'-去呋喃甲酰基头孢噻呋二硫二聚物,最终确定了残留标示物是去呋喃甲酰基头孢噻呋。低能量的4C和H是药物ADME研究中最常用的放射性核素。由于具有标记位点稳定的优点,C作为最常用的放射性核素通常标记在分子的骨架结构上,缺点是C的来源较少且价格高。而H标记具有合成方便,氚源相对容易而且检测灵敏度高的优点,也常做为示踪剂,但是存在可能会与易与环境中的氢发生交换,稳定性不如C,一般要求氚水交换比例小于5%。作者所在实验室近几年陆续开展了喹噁啉类兽药喹赛多,喹烯酮和喹乙醇在实验动物和猪鸡鱼的放射性示踪研究,阐明了这些药物在动物体内的代谢差异及分布和残留消除规律,为制定这类药物残留限量和休药期进行探索性工作。随着国家对食品安全的日益重视,为了进一步加强兽药的食品安全性评价,放射性同位素示踪技术在兽药的新药研发及一些兽药的再评价中的地位应该得到重视,与国外的法规和指南接轨。

关键词：兽药安全评价放射性示踪代谢残留消除

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二十年:我与郭沫若研究工作

二十年:我与郭沫若研究工作

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中国郭沫若研究会第五次代表大会暨学术研讨会

作者：杨胜宽

今年是中国改革开放三十年。郭沫若研究界也把回顾总结三十年郭沫若研究所走过的路程作为主题之一。从1988年算来,我自己涉足郭沫若研究刚好经历了二十年。借此机会,对我与郭沫若研究的一些经历作一番回顾,聊作对学界研究主题的一种呼应。