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基于转录组的甘薯转座元件搜寻及转座酶基因表达分析

基于转录组的甘薯转座元件搜寻及转座酶基因表达分析

引用

中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：颜朗曹庆华张义正王海燕四川大学生命科学学院四川省分子生物学及生物技术重点实验室

甘薯是旋花科番薯属的6倍体植物,主要进行无性繁殖。因其基因组大和遗传结构复杂,它是如何在无性繁殖过程中产生适应环境变化的后代的遗传机制还有待研究。转座子是真核生物基因组的重要组成部分,它的转座导致的基因组改变,提高了物种... 详细信息

甘薯是旋花科番薯属的6倍体植物,主要进行无性繁殖。因其基因组大和遗传结构复杂,它是如何在无性繁殖过程中产生适应环境变化的后代的遗传机制还有待研究。转座子是真核生物基因组的重要组成部分,它的转座导致的基因组改变,提高了物种对环境的适应性,利于物种进化。目前有关甘薯的转座子仍知之甚少。我们利用已有的4个甘薯转录组数据库(徐薯18营养器官和花器官,广薯87块根和京薯6号块根数据库)中所有原始read序列进行合并后从头组装,最终构建了长度大于200bp的转录组数据库,共有118309个转录本,最长转录本达13067bp。通过Blast2Go功能注释、同源序列比对和亚末端保守序列分析,最终鉴定了1405个转座子序列,含883个反转录转座子和522个DNA转座子。将4个甘薯转录组的原始read序列与获得的转座子序列进行映射分析发现,不同甘薯品种或同一品种不同器官所表达的转座子数目和表达量存在明显差异,如徐薯18和广薯87分别有1209个和994个转座子表达,前者比后者高出至少20%,而京薯6号仅有5个转座子表达,但表达量远高于前两者;在徐薯18品种的营养器官和繁殖器官中分别有1030个和832转座子表达。通过对徐薯18营养器官内数字基因表达谱分析发现,该品种中存在多个典型的组织器官差异性和特异性表达的转座子。选择了16个转座子进行转座酶基因编码区的克隆与测序,结果显示,实测序列与上述组装序列的相似度达到95%以上,表明了序列组装的可靠性。这些基因的进化树分析显示,甘薯中转座元件与多种双子叶植物间及自身家族间具有亲缘关系。拷贝数鉴定结果表明,这16个转座子在甘薯基因组中的拷贝数在1-3之间,属低拷贝元件,然而它们的表达量都相对较高。在本项研究中,我们在构建的甘薯整合转录组数据库的基础上,搜寻并鉴定了大量转座子,提供了甘薯转录组中关于转座子的丰富的资源及表达信息,对于研究甘薯基因组进化、基因的表达调控及在无性繁殖过程中基因组优化等具有重要的意义。

关键词：甘薯转座子转录组数据库序列比对表达活性

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水稻叶片光氧化基因LP01(t)的定位

水稻叶片光氧化基因LP01(t)的定位

引用

中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：吕川根夏士健张启军江苏省农业科学院粮食作物研究所

作者培育的籼稻两用不育系812s,其中出现1个农艺性状与812s基本一致的突变株812HS。在相同生长条件卜,812S全生育期叶色正常绿色,812HS秧苗期叶片正常绿色（6月份梅雨连绵,光照较弱）,但在分蘖盛期一拔节期（7月上旬-8月上旬）,在梅雨... 详细信息

作者培育的籼稻两用不育系812s,其中出现1个农艺性状与812s基本一致的突变株812HS。在相同生长条件卜,812S全生育期叶色正常绿色,812HS秧苗期叶片正常绿色（6月份梅雨连绵,光照较弱）,但在分蘖盛期一拔节期（7月上旬-8月上旬）,在梅雨结束后的强烈阳光照射下,叶片出现非常明显的光氧化（主要是倒2、倒3叶）。除突变性状外,其他农艺性状基本一致。光合生理检测表明,812HS、812HS/090028 F中光氧化株叶片的单位反应中心吸收（ABS/RC）、捕获（TRo/RC）和热耗散（DI0/RC）的光能均明显高于812S及812HS/090028 F2中非光氧化株,而PSⅡ最大光化学效率(（φP）、用于电子传递的量子产额（φE）则显著降低。研究结果表明,812HS和812HS/090028 F中的光氧化株的PSⅡ反应中心失活导致单位反应中心吸收和捕获的光能升高,而电子传递的活性低于非光氧化株,从而导敛PSⅡ最大光化学效率降低,光能利用效率显著低于正常植株,对水稻的光合作用和产量潜力产生不利影响。研究结果证明,812HS确实发生了叶片光氧化伤害（赖东,夏士健,吕川根等,2012）。用812HS与籼稻所配的杂种F,均出现同样的现象。如812HS与1到际水稻研究所选育的IRRI超高产系090028配制的812HS/090028（以及反交组合090028/812HS）F,与优良恢复系9311配制的812HS/9311（以及反交组合9311/812HS）F,秧苗期叶片正常绿色,在分蘖盛期-拔节期的强烈阳光照射下,叶片犹如火烧状,严重影响水稻生长和产量形成。将812HS/090028 F收获种子种植形成F群体,分蘖盛期-拔节期叶色出现光氧化与非光氧化两种性状的明显分化。2010年共种植F单株577株,其中428株表现光氧化,149株表现正常绿叶。光氧化株:正常绿叶株=2.87:1,卡方测验表明,光氧化株:正常绿叶株符合3:1的孟德尔分离比。2011年和2012年性状分离也符合3:1的孟德尔分离比。812HS/090028 F和F群体性状遗传分析表明,该光氧化性状受单个显性基因控制。采用BSA法,以812HS/090028 F为群体,用SSR标记,将目标基因初步定位于第4染色体上SSR标记RM307与RM401之间（赖东,夏士健,吕川根等,2012）,并进一步定位在SSR标记RM16588与CAPs标记C4-5之问（这2个标记住日本晴基因组上的物理距离大约为1.3Mb）,各自的交换单株数分别为4株和91株。经中国国家水稻数据中心查询,第4染色体尚未克隆或精细定位水稻叶片光氧化相关（或黄化）基因,该基因足一个新基因,暂命名为LPOI（t）(Leaf photo-oxidation 1)

关键词：水稻光氧化基因定位

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西藏牦牛mtDNA COⅢ基因的序列测定及系统进化关系

西藏牦牛mtDNA COⅢ基因的序列测定及系统进化关系

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：宋乔乔赵上娟姬秋梅柴志欣张成福信金伟钟金城西南民族大学动物遗传育种学国家民委-教育部共建重点实验室西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所西南民族大学动物遗传育科学国家民委-教育部共建重点实验室

牦牛(Bos grunniens)是分布于青臧高原海拔3 000-5500 m,对高寒、缺氧、枯草期利冰封期等极端生态环境具有极强适应能力的特有畜种。动物线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)具有结构简单、多拷贝、无重组、进化速度快、母系遗传、易扩... 详细信息

牦牛(Bos grunniens)是分布于青臧高原海拔3 000-5500 m,对高寒、缺氧、枯草期利冰封期等极端生态环境具有极强适应能力的特有畜种。动物线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)具有结构简单、多拷贝、无重组、进化速度快、母系遗传、易扩增等优点,已成为分子进化研究中的好材料。本研究以西藏自治区的巴青牦牛、工布江达牦牛、江达牦牛、嘉黎牦牛、康布牦牛,帕里牦牛、斯布牦牛、桑目牦牛、桑桑牦牛牛、错那牦牛、丁青牦牛、类乌齐牦牛、隆子牦牛、聂荣牦牛、日多牦牛、仲巴牦牛等16个类群378个个体为研究对象,采用DNA测序技术测定了牦牛mtDNA COⅢ全序列,旨在分析西藏牦牛的遗传多样性,探讨西藏牦牛类群间的亲缘关系和遗传分化,为西藏牦牛遗传多样性评估及遗传资源保护和利用提供理论依据。结果表明:(1)西藏牦牛mtDNA COⅢ长度均为781bD,个体间无序列长度差异。T、C、A、G等4种核苷酸的平均比例分别为29.2%(29.1%～29.6%)、29.4%(29.1%～29.6%)、26.1%(25.9%～26.6%)、1 5.2%(14.9%～1 5.5%),其中AT含量(55.3%)高于GC含量(44.6%),表现出_一定的碱基偏好性。(2)西藏牦牛mtDNA COⅢ均含有20种氨基酸,丙氨酸(A)、、半胱氨酸(c)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(s)、苏氨酸(T)、缬氨酸,缬氨酸(V)、色氨酸(w)、酪氨酸(Y)的平均含量分别为5.28%、2.44%、0.81%、2.85%、8.13%、6.10%、6.91%、8.60%、1.63%、13.0l%、1.22%、2.03%、9.76%、2.44%、4.47%、7.72%、9.35%、1.97%、0.81%、4.48%。(3)西藏牦牛mtDNACOⅢ全序列共检测到69个变异位点,其中单态突变位点58个,占多态位点总数的84.06%,简约信息位点11个,占多态位点总数的15.94%。(4)西臧牦牛的mtDNA COⅢ共有26种单倍型,平均单倍型数、平均单倍型多样性(Hd)、平均核苷酸多样性(Pi)分别为3.75、0.562和0.00138。西藏16个牦牛类群的单倍型多样性值变化范围在0.315～0.844,斯布牦牛的单倍型多样性最高(0.844),且多牦牛的单倍型多样性值最低(0.315);核苷峻多样性值变化范围在0.00051～0.00347,丁青牦牛的最高(0.00347),嘉黎牦牛的最低(0.00051)。(5)西藏牦牛类群问的Kimura双参数遗传距离显示,种间平均遗传距离为0.001452;斯布牦牛与丁青牦牛的种间遗传距离最大(0.002912);康布牦牛与错那牦牛的种间遗传距离最小(0.000523),同时丁青牦牛与其他各牦牛类群问的遗传距离均较大。(6)根据西藏16个牦牛类群间的平均遗传距离,分别用NJ法和UPGMA法构建了类群间的系统进化树,结果均表明,西藏16个牦牛类群可分为两类,丁青牦牛为一类,其余15个类群为一类。

关键词：西藏牦牛 mtDNA COⅢ 遗传多样性系统进化

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薏苡丙酮酸脱羧酶基因克隆及淹水表达响应分析

薏苡丙酮酸脱羧酶基因克隆及淹水表达响应分析

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：陈大清陈双建何建君李亚男仲恺农业工程学院生命科学学院长江大学农学院

薏苡（Coix lacryma/obi L.）为禾本科C植物,起源于东南亚的热带和亚热带地区,是古老的粮药兼用作物,具有较高的营养和医学价值,在中国至少有6000-10000年的栽培历史,同时具有耐涝、耐盐、耐早等多抗性。我们以薏苡为材料,克隆丙酮酸脱... 详细信息

薏苡（Coix lacryma/obi L.）为禾本科C植物,起源于东南亚的热带和亚热带地区,是古老的粮药兼用作物,具有较高的营养和医学价值,在中国至少有6000-10000年的栽培历史,同时具有耐涝、耐盐、耐早等多抗性。我们以薏苡为材料,克隆丙酮酸脱羧酶基因（pyruvatedecarboxylasel,PDC1）序列,应用RT-PCR分析基因对淹水表达的响应。根据玉米、水稻PDC1蛋白保守序列和甘蔗PDC片段设计两对简并引物,分别从薏苡cDNA中克隆出长度为471bp和972bp的两个片段;运用RACE技术克隆了薏苡PDC1 3'端编码序列,测序后对序列进行整合,通过分析重叠区的摇摆碱基密码子使用的偏好性（http://***/codord）,确定蛋白序列编码。整合后的核酸序列序列长度为1398bp,与甘蔗PDC片段和玉米PDC3相似度为97%,与玉米和籼稻PDC2相似度分别为95%和91%;蛋白质序列与玉米PDC3相似度最高为97%,与籼稻和粳稻PDC2蛋白相似度为96%。RACE5'端上游序列克隆,获得了152bp片段,在线比对发现从薏苡中克隆的序列与玉米（Zay mays）、水稻（Oryza sativajaponicaGroup）的PDC基因家族的基因序列最大相似度均超过88%以上（http://***/***）。蛋白序列在线比对BlastP（http://***/cgi-bin/dnaa）结果显示:与大麦、玉米PDC3和水稻PDC2相似度最高,分别为98%,96%和96%,与玉米和水稻其它PDC蛋白相似度也在80%以上。将克隆薏苡PDCI 5'端编码序列的部分与前述片段整合成1507bp序列。用ClustalX软件将薏苡PDC1序列及其蛋白质序列与水稻、玉米、甘蔗、稗和拟南芥PDC家族共15个基因的核酸和蛋白序列分别进行比对,并采用邻接法（NJ）,运用Mega4.0软件构建了进化树,初步确认我们克隆的薏苡PDC1与甘蔗PDC片段、玉米PDC3三者间都有很高的亲缘性,暗示我们初步获得了薏苡PDC1序列,进一步将通过两端特异引物,扩增全长cDNA序列进行验证。此外,我们采用半定量RT-PCR技术,以18sRNA为内参,初步研究了薏苡根和叶在淹水胁迫下的表达特点。结果表明:薏苡经淹水处理后,根和叶中PDC1的表达量在0-24h呈上升趋势,并达到最高值,24h后下降。

关键词：薏苡丙酮酸脱羧酶基因克隆淹水表达

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GsWRKY20加速植物开花及介导ABA信号与蜡质合成途径提高植物抗旱性

GsWRKY20加速植物开花及介导ABA信号与蜡质合成途径提高植物抗旱性

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：罗晓刘宝辉柏锡才华郭婷婷纪巍曹蕾王欢朱延明中国科学院东北地理与农业生态研究所大豆分子设计育种重点实验室东北农业大学生命科学学院植物生物工程研究室

已有研究表明WRKY基因分别参与了非生物胁迫及发育调控,然而,WRKY基因调控植物开花及通过调控植物的发育从而提高抗逆性则鲜有报道。我们在野生大豆中发现了一个WRKY家族成员GsWRKY20,组织部位表达分析显示该基因在花和茎尖中表达量最高... 详细信息

已有研究表明WRKY基因分别参与了非生物胁迫及发育调控,然而,WRKY基因调控植物开花及通过调控植物的发育从而提高抗逆性则鲜有报道。我们在野生大豆中发现了一个WRKY家族成员GsWRKY20,组织部位表达分析显示该基因在花和茎尖中表达量最高;qRT-PCR分析表明GsWRKY20在长、短日照下表达模式无显著差异、也无明显节律表达,然而受高盐、干旱、低温及ABA诱导表达;转GsWRKY20拟南芥株系对干旱的耐性提高,叶片失水速率较低;同时转GsWRKY20植株种子萌发、幼苗生长对ABA的敏感性均降低,但气孔开度却对ABA更加敏感;并且GsWRKY20植株叶片气孔密度显著减小。同时GsWRKY20超量表达株系在长日照、短日照及春化和赤霉素处理下都提前开花。基因芯片及qRT-PCR分析显示GsWRKY20促进了蜡质合成途径中的大量关键基因如CER1、CER2、CER3、CER4、LTP、MAH1、WSD1、LACS2、KCS2和KCS7等的表达,进一步通过叶绿素浸提速率、扫描电镜、透射电镜分析均表明超量表达植株叶片、茎含有较多蜡质晶体与较厚的角质层;GsWRKY20还促进了负调ABA信号的AtWRKY40,ABI1和ABI2等基因的表达,抑制了正调ABA信号的AB15,AB14和ABF4等基因的表达,从而负调ABA信号。以上研究表明ABA介导的种子萌发与ABA介导的气孔关闭可能是两条不同的信号通路,GsWRKY20一方面通过增强气孔对ABA开度的敏感性、促进植物在受到干旱胁迫时气孔关闭,减少依赖于气孔的水分的丧失;另一方面GsWRKY20蛋白定位于细胞核、具有转录激活功能,因此该基因作为转录激活子提高蜡质合成关键基因表达,促进蜡质合成,使植物合成较厚角质层,减少非依赖于气孔的水分的丧失,同时KCS2、CER1、CER3、CER8和LACS2的上调表达将负调气孔密度,这可能是GsWRKY20超表达株系气孔密度下降的原因之一。基因芯片及qRT-PCR结果同时也显示GsWRKY20作为转录激活子促进了正调开花时间基因AP3、AG、APl、PI、CO、SOC1和FT的表达,并间接抑制了负调开花时间基因FLC的表达,从而促进植物早花。综上,我们初步建立了GsWRKY20加速植物开花及介导ABA信号与角质层合成途径提高植物抗旱性的分子调控途径。

关键词：野生大豆 WRKY转录因子 ABA 蜡质气孔干旱早花开花途径

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Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：陈淑萍符生苗蔡俊宏李成学周红桃王福利许茂轩海南大学农学院海南省人民医院医学检验中心南方医科大学珠江医院医学检验中心

目的 shRNA干扰技术可以使细胞出现靶基因沉默,具有高特异性、高效性、低毒性等特点现已广泛应用于物医学研究的各个领域,为快速下调靶基因表达的有效手段之一。shRNA干扰技术有望成为治疗肿瘤治疗的新手段,但仍需解决诸多问题以提高疗... 详细信息

目的 shRNA干扰技术可以使细胞出现靶基因沉默,具有高特异性、高效性、低毒性等特点现已广泛应用于物医学研究的各个领域,为快速下调靶基因表达的有效手段之一。shRNA干扰技术有望成为治疗肿瘤治疗的新手段,但仍需解决诸多问题以提高疗效,其中就有通过多个基因的联合干扰的方法。本研究采用一个pU6-M4载体携带两个shRNA目的基因,构建靶阳Survivin基因及CDK1基因的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,为进一步研究Survivin基因和CDKl基因联合干扰提供科学依据。方法根据Genbank报道的Survivin序列及CDKl序列,遵循shRNA设计原则设计并合成各自靶向的Survivin、CDKI基因的shRNA寡核苷酸序列,构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pU6-shRNA-CDK1重组质粒及pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒,并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定。结果经酶切及测序结果分析,pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pU6-shRNA-CDK1重组质粒及pU6-shRNA-Survivin—U6-shRNA-CDK1双基因系列串联重组质粒均成功构建。根据质粒的结构及多克隆位点分析,串联重组的质粒经EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定,可以切出U6-shRNA-survivin-U6-shRNA-CDKl片段约800bp及4.5kb的大片段。用HindⅢ和XhoⅠ酶切鉴定,可以切出U6-shRNA-survivin、U6-shRNA-CDKl片段各约400bp,经酶切鉴定分析,pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1符合酶切设计要求,测序结宋显示插入的双基因序列正确。结论 shRNA干扰技术是将与靶mRNA配对的含有发夹状结构的RNA序列通过载体转入细胞,利用U6启动子确保shRNA表达并能传给子代细胞,shRNA在胞浆内被Dicer酶裂解成约21-25个碱基对的两端有少数未配对突出碱基的干扰RNA(siRNAs),这些siRNAs解链成单链并整合到活化的RNA诱导沉默复合物(RICS)上,整合后的siRNA碱基与靶mRNA配对,干扰靶mRNA,从而阻止作为模板进行翻译,使细胞出现靶基因沉默现象,即出现RNA干扰效应(RNAi)。本研究采用一个pU6-M4质粒载体携带2个shRNA的干扰技术,成功构建survivin和CDK1基因联合靶向的shRNA重组表达载体,为进一步探讨同时下调肿瘤细胞中的survivin和CDK1基因的表达是否具有协同增强干扰效应提供了条件,也为肿瘤靶向基因治疗的可行性提供新的思路。

关键词： Survivin基因 CDK1基因载体构建

来源：评论

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绒山羊Sertoli细胞的长期培养及分析

绒山羊Sertoli细胞的长期培养及分析

引用

中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：苏慧敏罗奋华包佳婧萨初拉张学明张岩多曙光吴应积内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室

Sertoli细胞从生精上皮基底膜延伸至管腔,是曲细精管中发现的极其重婴的体细胞。近年来体内和体外研究显示,Sertoli细胞充当抚育细胞,在精子发生阶段为发育中的生精细胞提供营养。Sertoli细胞为精原干细胞(spermatogonial stem cells,SS... 详细信息

Sertoli细胞从生精上皮基底膜延伸至管腔,是曲细精管中发现的极其重婴的体细胞。近年来体内和体外研究显示,Sertoli细胞充当抚育细胞,在精子发生阶段为发育中的生精细胞提供营养。Sertoli细胞为精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)连续自我史新,和减数分裂以及减数分裂后的生精细胞提供微环境和结构支持,并可形成血睾屏障为生殖细胞为提供免疫豁免。由于其重要性,人鼠、小鼠、人、狗、牛、猪等动物的Sertoli细胞的培养系统先后被建立,但是没有山羊Sertoli细胞培养的报道。为了研究绒山羊(Capra hircus).睾丸Sertoli细胞的功能及其对精子发生的影响,本研究采用2步酶消化法获得3-4月龄绒山羊睾丸单细胞悬液,利用差异贴壁法纯化绒山羊睾丸Sertoli细胞,建立绒山睾丸Sertoli细胞体外长期培养系统。相较于已报道的人Sertoli细胞只能在体外存活7代,且只有1.5代的细胞可冷冻保存,本研究分离的Sertoli细胞可在存活20代,且每代细胞都可以冷冻保存,在长期冷冻保存5年后,细胞形态没有发生变化。光学显微镜观察显示,新生的Sertoli细胞体积较小,直径约为20-50μm;成熟的Sertoli细胞体积较大,直径约为100μm。细胞形状呈卵圆形,存在突起,有多个核仁,活跃的Sertoli细胞在细胞核周围有较多的脂滴。正在分裂的Sertoli内具有多个细胞核,形成合胞体。透射电镜分析显示,体外培养的细胞彤念良好,具有典型的Sertoli细胞超微结构特征:细胞核呈现不规则状念,核膜有很深的缺刻;细胞质中具有许多的细胞器,如大量的粗面、光面内质网,线粒体,高尔基体,溶酶体,同时在核下胞质区有大量脂滴堆积,细胞核中具有明显的核仁和均匀分布的染色质颗粒;在合胞体中,最多检测到3个细胞核。免疫荧光染包检测显示几乎100%的培养细胞表达Sox9(SRY-related HMGbox gene 9),vimentin和GDNF(glial cell-derived neurotrophic factor)。随着传代次数的增加,细胞增殖速度减慢,但是GDNF,SCF(stem cell factor)和β1-integrin的转录水平并没有下降,表明该细胞有正常的调节精原干细胞增殖分化的助能。BrdU掺入实验利流式细胞仪分析显示,该细胞在冷冻保仔5年之后,仍然具有良好地增殖能力。结果显示,本研究培养的绒山羊Sertoli细胞在体外具有良好地增殖能力,表达重要的生殖细胞调节因子。这些细胞在Sertoli细胞与生殖细胞相互作用,精子发生,生殖毒理学和男性不孕研究方面具有重要的应用前景。

关键词：绒山羊睾丸 Sertoli细胞培养

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将转基因斑马鱼的制作引入本科生基因工程实验课教学的探索与实践

将转基因斑马鱼的制作引入本科生基因工程实验课教学的探索与实践

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：袁婺洲邓云湖南师范大学生命科学院

二十一世纪是生物技术的世纪,而生物技术的核心是基因工程。基因工程已经成为国内外高校生物技术及其相关专业本科生的核心专业课程。基因工程技术涉及基因片段的获取、基因克隆、基因转化、基因的体外修饰、转基因技术、基因表达及表... 详细信息

二十一世纪是生物技术的世纪,而生物技术的核心是基因工程。基因工程已经成为国内外高校生物技术及其相关专业本科生的核心专业课程。基因工程技术涉及基因片段的获取、基因克隆、基因转化、基因的体外修饰、转基因技术、基因表达及表达产物下游的大规模生产等,所以基因工程是一门实践性和技术性都很强的课程,基因工程实验课教学是基因工程课程教学的重要内容。纵观国内各大高校基因工程实验课的教学内容,一般主要包括DNA的提取、PCR扩增、感受态细胞制备与转化、质粒DNA提取以及DNA的酶切鉴定等与基因克隆相关的基础实验。但是由于生命科学领域功能基因组时代的研究成果日新月异,基因工程技术处于飞速发展的前沿,因此对于生物技术人才培养的要求了应与时俱进。许多高校都在进行基因工程实验课教学内容的改革,例如浙江大学基因工程实验采取了综合大实验的模式,而复旦大学结合肿瘤分子遗传学的科研优势,将基因工程实验内容从原核细胞基因克隆扩充到哺乳动物细胞基因表达分析,注重实践教学与科学研究的接轨。这些基因工程实验教学改革顺应了时代发展的需求,也深受学生们的欢迎。转基因动物技术是指利用基因工程技术把外源目的基因导入动物的生殖细胞、胚胎干细胞或早期胚胎,使之在受体染色体上稳定整合,并能把外源目的基因传给子代个体的技术,是基因工程的核心技术和代表性成果。但是由于转基因动物制作的设备要求复杂、操作时间长、技术难度大、转基因得率低以及转基因后代表型鉴定周期长等原因,在国内高校至今尚未见到有教学团队将转基因动物的制作用于本科生基因工程实验教学的报道。本文介绍了作者利用科研平台的优势,连续三年将转基因斑马鱼的制作引入本科生基因工程实验课教学的探索与实践,取得了较好的成效。相对于制备转基因果蝇与转基因小鼠,制备转基因斑马鱼操作难度系数不大,要求条件工程高,建立实验室所需的设备和仪器花费相对便宜,容易被初学者快速学习和掌握。转基因斑马鱼载体的丰富的荧光标记基因使得转基因后代鉴定快捷直观,实验结果便于及时观察,学生参与兴趣浓厚。此外,本科生转基因斑马鱼基因工程综合实验也可以与本科生提前进研究室开展创新实验和毕业论文的研究工作相结合。因此,将转基因斑马鱼的制备引入基因工程实验课堂的可行性和实用性都非常强,可以在有条件的院校推广应用。

关键词：转基因动物转基因斑马鱼基因工程实验教学

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Dhtkd1无义突变敲入小鼠模型的建立与表型分析

Dhtkd1无义突变敲入小鼠模型的建立与表型分析

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：栾春杰郭文婷于珍王铸钢顾鸣敏上海交通大学医学院医学遗传学教研室

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease,CMT）是一类较常见的遗传性周围神经病,群体发病率约为1/2500。根据临床和电生理特征,CMT主要分为两型:其中CMT1型以脱髓鞘为特征,CMT2型以轴突变性为特征。迄今,己报道有45个基因的突变与CM... 详细信息

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease,CMT）是一类较常见的遗传性周围神经病,群体发病率约为1/2500。根据临床和电生理特征,CMT主要分为两型:其中CMT1型以脱髓鞘为特征,CMT2型以轴突变性为特征。迄今,己报道有45个基因的突变与CMT的发生相关。课题组于2009年7月在山东省采集到一个CMT大家系,由52人组成,呈常染色体显性遗传。经对8个受累者（含先证者）详细的临床检查以及对先证者的神经电生理及病理检查后确定该家系为CMT2型。通过全基因组扫描和连锁分析将该家系致病基因定位于10p13-14,对该区域的20余个候选基因逐一进行序列分析,结果发现定位于线粒体的脱氢酶E1和转酮酶结构域1（DHTKDl）第8外显予存在一个无义突变[c.1455T>G（***485）1,该突变在8个受累者中均被检出,但在该家系所有未受累者及250个无关的正常人中均未发现。由该基因突变所致的疾病已被命名为CMT2Q。体外实验证明,截短蛋白经无义介导的mRNA降解（NMD）导致DHTKD1的总量不足和能量代谢的受限,从而引发CMT2型的临床表型。前期研究结果己于2012年12月发表在Am J Hum Genet杂志上。为了进一步揭示DHTKD1的生物学功能及导致CMT2Q的分子机制,课题组构建了Dhtkdl无义突变敲入小鼠模型,并对三种基因型小鼠（即突变纯合子、杂合子和野生型小鼠）进行了生长发育方面的观察以及病理学、能量代谢和行为学等方面的检测,以判断Dhtkdl小鼠与人类CMT2Q之间表型的一致程度。研究结果显示三种基因型小鼠的生长发育正常,四肢外形及步态未见异常,繁殖能力也未见差异。病理学检测显示杂合子和纯合子小鼠的坐骨神经均出现轴突直径减小,并伴有髓鞘增厚现象,而且突变纯合子的病变程度要比杂合子更为明显;能量代谢检测表明突变纯合子小鼠的ATP含量要比杂合子小鼠及野生型小鼠的ATP含量低,而且突变纯合子小鼠及杂合子小鼠的NADP+/NADPH比值要比野生型小鼠高,说明DhtkdI无义突变可以导致突变小鼠能量代谢能力的下降;行为学检测显示三种基因型小鼠的运动能力没有显著差异,但突变纯合子小鼠感觉系统的反应时间出现延迟,而杂合子小鼠相对于野生型小鼠没有统计学差异。以上实验数据初步表明Dhtkdl无义突变敲入小鼠部分出现了类似人类CMT2Q的表型。下一步,课题组将开展三种基因型小鼠神经传导速度的检测、代谢笼的测试、免疫组化分析等,以进一步搞清DHTKD1基因的生物学功能及DHTKD1基因无义突变导致CMT2的病理机制。

关键词： CMT2 DHTKD1 无义突变敲入小鼠模型

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JAK/STAT通路相关基因FDGM1在脑胶质瘤中的作用及其分子机制研究

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：孟德龙陈元渊秦荣徐涛陈红岩陈菊祥卢大儒复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室第二军医大学附属长征医院神经外科

脑胶质瘤是最常见的中枢神绎系统恶性肿瘤,总体预后较差,其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤(GBM)的5年生存期不足5%,对脑胶质瘤的相关基因筛选和分子机制的研究具有重要的科学意义和临床价值。GBM是癌症基因组图谱计划(TCGA)项目研究的第... 详细信息

脑胶质瘤是最常见的中枢神绎系统恶性肿瘤,总体预后较差,其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤(GBM)的5年生存期不足5%,对脑胶质瘤的相关基因筛选和分子机制的研究具有重要的科学意义和临床价值。GBM是癌症基因组图谱计划(TCGA)项目研究的第一种癌症类别,本文通过对TCGA数据库中的GBM数据进行高通量的数据分析,并在临床组织样本中进行定量PCR和免疫组化组织芯片验证,筛选出与脑胶质瘤的发生和预后相关的基因;并在细胞系中通过慢病毒感染的方法过表达或干扰候选基因的表达,检测细胞表型的变化,通过裸鼠移植瘤的实验观察候选基因对脑胶质瘤体内生长的影响;再通过免疫印迹(WB)、免疫共沉淀(co-IP)、荧光素酶报告基因(luciferase)、染色质免疫共沉淀(ChIP)等方法研究其发挥作用的分子机制。我们通过对TCGA数据库中的近500例GBM患者基因表达谱数据和相应的临床资料进行差异表达分析和生存期分析,找到了42个基因在脑胶质瘤中有显著的表达差异并且与患者的生存期相关。在进一步的验证和筛选中,锚定了候选基因"FDGMl"(代号)。在中国人群的313例脑胶质瘤样本的组织芯片实验中发现,FDGMl基因及其蛋白产物在脑胶质瘤中表达水平显著升高(Fold=3.83,P=0.019),且与患者的生存期显著相关(Hazard Ratio=3.503,95%CI 2.197-5.586,P<0.001)。存脑胶质瘤细胞系U87MG和U251MG中过表达或干扰FDGM1基因后发现,FDGM1基因能够促进脑胶质瘤细胞的体外生长、增殖和裸鼠体内成瘤能力。FDGM1基因被报道过可能与JAK/STAT通路相关,目前在脑胶质瘤中未见报道。我们发现在脑胶质瘤中FDGM1基因能够影响stat1的表达水平,并且通过co-IP实验发现FDGM1蛋白能与stat1蛋白发生相互作用;同时FDGM1基因能够影响c-jun的表达水平,反过来c-jun也能影响FDGM1的表达水平,ChIP实验表明c-jun能够与FDGM1的肩动子区域的AP-1结合位点直接结合,luciferase实验表明c-jun对FDGM1的启动子区域具有转录活性,说明c-jun可以直接调控FDGM1的转录。综上所述,我们通过数据分析和临床组织样本的实验发现候选基因FDGM1在脑胶质瘤的发乍发展和预后中发挥重要作用,在脑胶质瘤中FDGM1基因的作用可能与JAK/STAT信号通路和JNK/c-jun信号通路相关,并且FDGM1受到c/jun的转录调控,可能形成一个正反馈回路。本课题研究的基因较为新颖,并且将基础和临床紧密结合,将为脑胶质瘤的机制研究和临床治疗提供新的思路。

关键词：脑胶质瘤生存期 TCGA c-jun stat1

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