【目的】建立鸡传染性贫血病毒(CAV)的环介导等温扩增(LAMP)技术,以便简单、快速、特异地检测CAV,同时搭建LAMP技术平台。【方法】选取GenBank中69株CAV序列,选择保守序列区域,使用在线设计软件Pirmer Explorer V4软件对引物进行设计并...
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【目的】建立鸡传染性贫血病毒(CAV)的环介导等温扩增(LAMP)技术,以便简单、快速、特异地检测CAV,同时搭建LAMP技术平台。【方法】选取GenBank中69株CAV序列,选择保守序列区域,使用在线设计软件Pirmer Explorer V4软件对引物进行设计并筛选,以CAV阳性质粒为模板用3对LAMP引物进行等温扩增,扩增产物分别进行电泳、SupergreenI荧光染色以及酶切鉴定,正确后对该方法的反应体系及反应条件进行优化。【结果】根据引物设计优化结果,最终选定的引物组选取了215bp～395bp的181bp序列作为扩增片段;扩增产物电泳呈LAMP特有的拖带,能被PstI和BgⅢ有效酶切,SupergreenI染色后肉眼可见特有的绿色荧光,阴性产物呈红棕色;经优化后25μL体系为:dNTPs(10mmol/L)0.3μl、FIP/BIP(100umol/L)0.3μL、F3/B3(10umol/L)10μmol/L、LF/LB(10umol/L)10μmol/L、Betaine(5mol/L)5.0μL、MgCl2(25mmol/L)2.5μL、BstDNAPolymerase1μl、10×ThermoPolbuffer2.5μl、模板DNA2μl,超纯水补至25μL;反应条件为:65℃温浴1h,80℃灭活5min。【结论】成功建立了CAV的LAMP检测方法,为基层实验室的快速诊断及CIA防控提供了技术支撑,同时为其它病原的LAMP方法的建立奠定了基础。
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