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作者

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11 篇 刘长明
11 篇 赵军
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10 篇 闫若潜
10 篇 赵明军
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传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：朱向东王永山欧阳伟潘群兴毕振威李月华范红结王笑梅江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94%和86%。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,两个病毒株基因组... 详细信息

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94%和86%。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,两个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp。病毒演化分析结果显示两个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96.8%～98.1%和96.9%～98.4%,处在IBDV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%～90.4%和90.0%～90.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777-782位核苷酸序列为GGTGCC,没有Kpn酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ-11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) 病毒演化重配病毒序列分析

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MEK2与猪瘟病毒E2蛋白的相互作用及其对猪瘟病毒复制的调控作用

MEK2与猪瘟病毒E2蛋白的相互作用及其对猪瘟病毒复制的调控作用

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：廖亚金李素贺番李丹孙元罗玉子仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus)引起的一种烈性传染病。E2为CSFV主要结构蛋白,在介导CSFV感染宿主细胞方面发挥重要作用。为研究E2蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用,本研究以E2为诱饵蛋白,利用... 详细信息

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus)引起的一种烈性传染病。E2为CSFV主要结构蛋白,在介导CSFV感染宿主细胞方面发挥重要作用。为研究E2蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用,本研究以E2为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统从本实验室构建的猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)cDNA酵母表达文库中筛选得到与CSFVE2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白MEK2(mitogen-activated protein kinase kinase2),并用GST pulldown、双分子荧光互补和激光共聚焦等方法验证了E2与MEK2的相互作用。进一步研究证实,CSFV感染PK-15细胞后,可活化ERK通路并促进MEK2的表达,而用MEK1/2特异性抑制剂U0126抑制该通路,则可显著降低CSFV的增殖,表明CSFV通过调节该通路以促进其增殖。与以往研究不同的是,用MEK1特异性抑制剂PD98059处理PK-15细胞则对CSFV增殖无明显影响。分别于感染后不同时间用U0126处理CSFV感染的PK-15细胞,结果显示,阻断ERK通路不影响CSFV的吸附和进入细胞。采用β干扰素(IFN-β)双荧光素酶报告系统检测MEK2对IFN-β表达的影响,结果表明,MEK2以剂量依赖性的方式抑制IFN-β的表达,但其具体机制有待深入研究。总之,本研究发现CSFVE2与MEK2存在相互作用并可激活MEK/ERK通路,阻断MEK/ERK通路显著抑制CSFV的复制,其机制可能是通过MEK2抑制IFN-β表达。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白 MEK2 复制调控 β干扰素

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2012年河南省猪流行性腹泻病毒S1基因遗传变异分析

2012年河南省猪流行性腹泻病毒S1基因遗传变异分析

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：陈慧娟闫若潜赵雪丽赵明军周兵强吴志明河南农业大学牧医工程学院河南省动物疫病预防控制中心

为分析2012年河南省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本研究设计合成2对扩增S1基因的特异性引物,利用RT-PCR方法,对2012年分离的5株PEDV毒株的S1基因进行扩增、克隆和序列测定,并对其进行遗传进化分析。结果表明:5株PEDVS1基因核... 详细信息

为分析2012年河南省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本研究设计合成2对扩增S1基因的特异性引物,利用RT-PCR方法,对2012年分离的5株PEDV毒株的S1基因进行扩增、克隆和序列测定,并对其进行遗传进化分析。结果表明:5株PEDVS1基因核苷酸同源性为98.3%～99.5%,氨基酸同源性为97.1%～98.9%。与2012年国内登陆的PEDV流行株相比较核苷酸同源性为97.8%～99.2%,氨基酸同源性为97.4%～99.1%。与参考毒株CV777相比较核苷酸同源性为88.7%～89.1%,氨基酸同源性为87.3%～88.4%。同源性分析结果表明:5株分离株S1基因变异情况基本一致,存在相同的插入和缺失,并且与国内2012年登陆的毒株相比没有突变倾向;但与参考毒株CV777相比较,在第163bp～166bp处有3个核苷酸插入,在173bp～174bp之间有9个核苷酸插入,在405bp～406bp之间有3个核苷酸插入,在463bp～464bp之间有3个核苷酸缺失,这些位点核苷酸的插入和缺失导致了其编码的氨基酸相应改变。PEDVS1基因在我国只有一个血清型,但PEDV分3个群,系统进化树分析表明5株分离株S1基因与2012年国内登陆的毒株均属于Ⅲ群,与2011年国内登陆的PEDVⅠ群流行毒株相比较核苷酸同源性为88.6%～89.3%,氨基酸同源性为85.3%～86.9%,而参考毒株CV777属于Ⅱ群。目前我国流行的PEDVS1基因有PEDV群和Ⅲ群的存在,但这些毒株的致病性和抗原性差异仍有待进一步研究。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S1基因遗传变异分析

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B亚型禽白血病病毒所致免疫抑制条件下共感染禽波氏杆菌对雏鸡致病性的影响

B亚型禽白血病病毒所致免疫抑制条件下共感染禽波氏杆菌对雏鸡致...

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：郭繁霞朱瑞良赵雪吴村曲亭和贺晓华郭中坤潘德琴黄璇李奕芙山东农业大学动物科技学院山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室

近些年,在养禽业中,免疫抑制性病毒所致雏鸡免疫抑制条件下继发其它病毒、细菌或寄生虫的混合感染的现象越来越普遍、越来越严重。本研究选择B亚型禽白血病病毒(ALV-B)感染雏鸡造成免疫机能低下,建立免疫抑制模型,以探索免疫抑制条件下... 详细信息

近些年,在养禽业中,免疫抑制性病毒所致雏鸡免疫抑制条件下继发其它病毒、细菌或寄生虫的混合感染的现象越来越普遍、越来越严重。本研究选择B亚型禽白血病病毒(ALV-B)感染雏鸡造成免疫机能低下,建立免疫抑制模型,以探索免疫抑制条件下共感染禽波氏杆菌后对雏鸡致病性的影响。研究中设计了ALV-B单独感染组,***单独感染组,ALV-B和***共感染组,空白对照组,并且比较相互之间的差异。通过对雏鸡免疫学指标、生长性能及病毒血症和排毒状况的检测,对二者混合感染雏鸡的影响进行了研究。结果显示,ALV-B和***共感染能引起雏鸡的免疫力低下,表现为免疫器官的发育、抗体的产生、淋巴细胞的转化、IL-2和IFN-γ的合成和分泌等受到明显抑制;混合感染组延长了***的病程,增强其对雏鸡的致病性;同时机体出现明显的生长迟滞现象,尤其是第5周龄,共感染组平均体重仅相当于对照组的40%;本研究提示ALV-B和***在雏鸡体内的增殖方面起协同作用,从而促进了病原在鸡群间的散播;而***对ALV-B导致的病毒血症有一定的抑制作用。总之,在ALV-B免疫抑制作用下,***对雏鸡的致病性显著增强。本研究为生产中家禽感染免疫抑制病毒造成的免疫抑制条件下继发其它疾病的普遍发生提供了理论依据,提醒国内外兽医工作者和养禽界对免疫抑制状态下继发其它病原的感染应引起密切的关注。

关键词： B亚型禽白血病病毒禽波氏杆菌免疫抑制共感染致病性

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传染性法氏囊病病毒VP2单克隆抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制

传染性法氏囊病病毒VP2单克隆抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：刘静静王永山欧阳伟夏兴霞潘群兴王晓丽毕振威诸玉梅朱瑞良山东农业大学动物科技学院江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心

为研制传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测试剂盒,用重组IBDV-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得三株稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为1D11、2G8和2E5,抗体亚类分别为IgG1κ、... 详细信息

为研制传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测试剂盒,用重组IBDV-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得三株稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为1D11、2G8和2E5,抗体亚类分别为IgG1κ、IgG2bκ和IgG1κ。间接免疫荧光试验(IFA)证明,三株单抗均与VP2发生特异性反应。相加ELISA证明三株mAb识别VP2不同的抗原表位。在病毒中和试验中,1D11和2G8腹水对IBDV的中和效价分别为104和103,而2E5无中和活性。用亲和层析方法纯化1D11和2E5,分别作为包被抗体和标记抗体,建立了IBDV夹心ELISA检测方法,优化了实验条件,测定了其主要性能指标,对IBDV的最低检出量为102TCID50/mL。用夹心ELISA、AGP和RT-PCR三种方法同步检测8种实验样品,夹心ELISA与RT-PCR的检测结果一致,显著高于AGP方法。组装成的试剂盒,置于37℃保存7d、4℃保存6个月和-20℃保存24个月,其检测结果没有显著差异(P>0.05)。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2 单克隆抗体(mAb) 夹心ELISA 试剂盒

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嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)灭活苗对商品猪免疫保护效力的研究

嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)灭活苗对商品猪免疫保护效力的研究

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：汪正亮周金柱王小波李基棕高杏俞天琦高崧扬州大学农业部禽用生物制剂创制重点实验室

(目的)本文运用多功能细胞电穿孔仪将本实验室构建的重组pSK-dPCV1-2质粒转染Dulac细胞,传代培养后收获嵌合型猪圆环病毒PCV1-2。将该重组病毒灭活后与ISA206VG佐剂乳化制成灭活苗,免疫商品猪以评价其免疫保护效力。(方法)将42日龄PCV2... 详细信息

(目的)本文运用多功能细胞电穿孔仪将本实验室构建的重组pSK-dPCV1-2质粒转染Dulac细胞,传代培养后收获嵌合型猪圆环病毒PCV1-2。将该重组病毒灭活后与ISA206VG佐剂乳化制成灭活苗,免疫商品猪以评价其免疫保护效力。(方法)将42日龄PCV2母源抗体较低的20头商品猪随机分成5组,另外2头作为健康对照组。通过检测不同时间的间接免疫荧光抗体、中和抗体、攻毒后病毒血症以及病理变化和组织中的病毒载量等评价疫苗的免疫保护效果。(结果)结果显示:二免后14d,所有免疫组试验猪都表现为PCV2血清学阳性,且中和抗体水平在1/15～1/20。攻毒后21d扑杀试验猪,免疫组猪的淋巴结和各脏器的大体和显微病变都比攻毒对照组轻微。攻毒对照组的淋巴结出现多核巨细胞和嗜酸性粒细胞,且有多量的淋巴细胞缺失,免疫组未见多核巨细胞,淋巴细胞缺失也较少。淋巴结中PCV2病毒载量在攻毒对照组为5.566±0.432,在104.0TCID50,105.0TCID50,106.0TCID50免疫组分别为4.469±1.023,4.434±0.716,3.521±0.958,其中105.0TCID50,106.0TCID50免疫组与攻毒对照组差异显著(P<0.05),但是,试验期间各试验组和健康对照组均未观察到明显的临床症状。(结论)断奶仔猪免疫105.0TCID50以上嵌合型猪圆环病毒PCV1-2灭活苗可以有效地抵抗PCV2b/1B/Jiangsu/Jingjiang/2012/11/08病毒感染。

关键词：嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)灭活苗商品猪 ISA206VG佐剂免疫保护

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PRRSV不同毒力毒株诱导Toll样受体和细胞因子表达特性的比较

PRRSV不同毒力毒株诱导Toll样受体和细胞因子表达特性的比较

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：张莉莉刘捷白娟王晓晔李玉峰姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点开放实验室

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因容易变异,不同流行毒株毒力差异较大,造成严重经济损失,但其免疫和致病机制尚不清楚。本研究将24头仔猪平均分成4组,每组6头,分别接种高致病性PRRSV分离株BB0907(HP),低毒力PRRSV毒株NT0801(LP),NT080... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因容易变异,不同流行毒株毒力差异较大,造成严重经济损失,但其免疫和致病机制尚不清楚。本研究将24头仔猪平均分成4组,每组6头,分别接种高致病性PRRSV分离株BB0907(HP),低毒力PRRSV毒株NT0801(LP),NT0801第70代衍生毒株NT0801-F70(LP-der)和DMEM营养液(对照),隔离饲养观察。攻毒后0、6、9、15天用ELISA方法检测猪血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10含量;攻毒后15天用Real-timePCR方法检测各组肺脏和脑组织中TLR2、3、7和8基因表达水平,并分离猪肺泡巨噬细胞(PAMs)和猪外周血淋巴细胞(PBMCs),分别采用TLR2、3、7/8的配体(LTA、poly(I:C)、CL097)和PRRSV刺激,检测细胞上清中细胞因子水平。结果为:与LP相比,HP组试验猪产生明显临床症状,而LP-der几乎没有毒力;HP感染猪的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平高于LP或者LP-der组。LP组PAMs经poly(I:C)或CL097刺激后分泌的TNF-α和IL-1β水平显著高于DMEM营养液对照组,同时,HP组PBMCs经CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6显著高于LP和LP-der组。HP组PBMCs经CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6高于LP和LP-der组,LP组PAMs经poly(I:C)、CL097刺激后TNF-α和IL-1β的分泌高于DMEM组。该结果表明,与LP和LP-der相比,HP更能诱导TLR3、7、8和TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ表达,从而丰富了PRRSV免疫和致病机制理论,并有助于开发更为有效的PRRSV疫苗。

关键词： PRRSV 免疫原性致病性 TLRs 细胞因子

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腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2不同免疫途径的效力评价

腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2不同免疫途径的...

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：孙元秦华洋袁晋王春花赵碧波李素罗玉子仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

猪瘟是一种非常重要的猪传染病,对养猪业危害极大。具有标记特性的新型猪瘟疫苗及相应的鉴别诊断方法将会对猪瘟的防控起到重要的作用。先前我们证实,构建的表达猪瘟病毒E2基因的腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体病毒rAdV-SFV-E2在猪体上可... 详细信息

猪瘟是一种非常重要的猪传染病,对养猪业危害极大。具有标记特性的新型猪瘟疫苗及相应的鉴别诊断方法将会对猪瘟的防控起到重要的作用。先前我们证实,构建的表达猪瘟病毒E2基因的腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体病毒rAdV-SFV-E2在猪体上可诱导高水平的猪瘟特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,免疫攻毒的保护效果与猪瘟兔化弱毒疫苗C株相当。系统评价显示,该疫苗初步具备了理想猪瘟疫苗的特征。本研究对该腺病毒/甲病毒复制子嵌合病毒rAdV-SFV-E2以三种免疫途径(肌肉、皮下、滴鼻)在猪体上的免疫效果进行了比较。选取21头5周龄左右猪瘟抗体及抗原均为阴性的健康仔猪,将所有仔猪随机分成A、B、C和D四组,其中A、B、C三组分别经肌肉、皮下和滴鼻方式注射5×106TCID50rAdV-SFV-E2,D组分别经三种途径免疫5×106TCID50rAdV-SFV-empty。免疫后3周以同种疫苗、同样途径和剂量进行加强免疫。加强免疫后4周,所有猪用猪瘟病毒石门株进行攻毒。研究结果显示,皮下免疫组诱导的体液免疫水平较其他途径免疫组较高。在攻毒前,A组、B组和C组免疫猪的平均抗体阻断率分别为46.28%、51.66%和31.94%。皮下免疫组与滴鼻免疫组在攻毒前的抗体水平比较上差异显著(p<0.05)。攻毒后3d,A组、B组和C组免疫猪的平均抗体阻断率分别为54.28%、62.39%和39.35%。皮下免疫组与肌肉免疫组、滴鼻免疫组间差异显著(p<0.05)。在细胞免疫方面,皮下免疫组诱导了高水平的特异性的淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-4的分泌,与rAdV-SFV-empty免疫组及肌肉和滴鼻免疫组之间差异显著(p<0.05)。本研究进一步证实了腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗作为一种理想猪瘟疫苗的可能性,将会对猪瘟的防控起到重要的作用。

关键词：猪瘟嵌合载体疫苗免疫途径效力

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携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门氏菌诱导山羊免疫应答研究

携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门氏菌诱导山羊免疫应答研究

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：熊朝丽张华程振涛周碧君王开功文明贵州大学动物疫病研究所贵州省动物疫病预防控制中心贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室

(目的)为探讨携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门氏菌诱导山羊免疫应答效果。(方法)本研究将60只黑山羊随机分为3组即重组细菌组、弱毒疫苗组和空白对照组,重组细菌组灌服重组减毒沙门氏菌,弱毒疫苗组股内侧皮内注射山羊痘弱毒疫苗,空白对... 详细信息

(目的)为探讨携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门氏菌诱导山羊免疫应答效果。(方法)本研究将60只黑山羊随机分为3组即重组细菌组、弱毒疫苗组和空白对照组,重组细菌组灌服重组减毒沙门氏菌,弱毒疫苗组股内侧皮内注射山羊痘弱毒疫苗,空白对照组不作任何处理;于不同时间段采集山羊血液、呼吸道/消化道分泌液及组织样本进行检测。结果:(1)在免疫后7d、15d、30d和45d的山羊消化道SIgA含量中,重组细菌组明显高于弱毒疫苗组(P<0.05),45d时到达最高值(21.924±1.122ug/L);(2)在消化道/呼吸道粘膜肥大细胞数量上,重组细菌组与弱毒疫苗组基本一致,从大到小依次是十二指肠、空肠、回肠、真胃和气管;(3)在诱导产生P32抗体上,重组细菌组略低于弱毒疫苗组,但差异不明显(P>0.05);(4)在淋巴细胞转化效率上,免疫15d前重组细菌组略低于弱毒疫苗组,但免疫30d后重组细菌组高于弱毒疫苗组,但差异均不显著(P>0.05);(5)在诱导产生细胞因子上,重组细菌组山羊血清IL-2含量低于弱毒疫苗组,差异极显著(P<0.01),血清IL-5含量高于弱毒疫苗组,差异极显著(P<0.01),血清TNF-β高于弱毒疫苗组,差异显著(P<0.05),而血清IFN-γ和TNF-α含量与弱毒疫苗组差异不明显(P>0.05)。(结论)上述实验结果表明,构建的携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门氏菌能诱导山羊产生较好的免疫应答反应。

关键词：重组减毒沙门氏菌免疫应答山羊

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gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：欧阳伟朱向东王永山王永强潘群兴毕振威王笑梅江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21和3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。用VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得了过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1mL)。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染的DF-miR-21细胞,用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) miRNA gga-miR-21 慢病毒表达系统病毒复制

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