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siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选

siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选

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国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：戴波肖定璋余细勇广东省人民医院医学研究中心南方医科大学

构建并鉴定MIF特异性siRNA重组逆转录病毒载体,将其导入PHOENIX细胞中,筛选出分泌MIF- siRNA病毒的包装细胞,其分泌的病毒可以抑制MIF蛋白的表达,并初步了解沉默MIF的稳定细胞株的特性。体外合成含针对MIF特异基因序列的寡核苷酸并定向... 详细信息

构建并鉴定MIF特异性siRNA重组逆转录病毒载体,将其导入PHOENIX细胞中,筛选出分泌MIF- siRNA病毒的包装细胞,其分泌的病毒可以抑制MIF蛋白的表达,并初步了解沉默MIF的稳定细胞株的特性。体外合成含针对MIF特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入pSuper逆转录病毒载体,构建的载体通过酶切、测序鉴定后,采用脂质体介导转染包装病毒细胞株PHOENIX,收获病毒上清;将其感染HeLa细胞株,经过嘌呤霉素筛选得到抑制MIF表达的HeLa细胞株。Western blot鉴定MIF表达的抑制效果并通过迁移实验、软琼脂糖克隆形成实验比较HeLa-pSuper-MIF和HeLa-pSuper-mock之间的特性。构建的重组逆转录病毒载体pSuper-MIF,转染包装病毒细胞株PHOENIX,病毒上清感染HeLa细胞,抑制了HeLa细胞内源性MIF蛋白的表达。沉默MIF蛋白后导致HeLa细胞迁移能力下降,不依赖支持物生长的特性减弱。构建的重组逆转录病毒载体pSuper-MIF,转染包装细胞所产生的病毒上清,能够抑制HeLa细胞内的MIF蛋白表达,表明MIF对HeLa细胞的迁移和不依赖支持物生长能力有重要作用。

关键词： siRNA MIF 逆转录病毒载体

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不同海拔健康青年男性心率变异性对比分析

不同海拔健康青年男性心率变异性对比分析

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国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：隆敏覃军黄岚田开新于世勇喻杨第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所

采用5 min短程心率变异性时域、频域和非线形分析,对比从平原进入三个不同海拔高度自主神经系统功能的差异,探讨不同海拔高度对自主神经功能的影响。154名年龄17～37岁健康青年男性纳入本研究,根据到达的目的海拔高度所有受试者被分为1... 详细信息

采用5 min短程心率变异性时域、频域和非线形分析,对比从平原进入三个不同海拔高度自主神经系统功能的差异,探讨不同海拔高度对自主神经功能的影响。154名年龄17～37岁健康青年男性纳入本研究,根据到达的目的海拔高度所有受试者被分为1856米组(62例)、2 800米组(39例)和3 040米组(53例)。在海拔300米平原完成心率变异性检测后,所有受试者两日内分别进入目的海拔高度,在到达海拔1856米第3～10日、2 800米第7～9日、3040米第21～23日再次接受了心率变异性检测。结果:与进入海拔1 856米相比,海拔2 800米平均正常RR间期的标准差(SDNN)、相邻RR间期差的均方根(rMSSD)、相差>50 ms的相邻RR间期占RR间期总数的百分比(PNN50)、低频功率(LF)、高频功率(HF)以及总功率(TP)均有轻度升高,但无统计学差异;与进入海拔1856米和海拔2 800米相比,海拔3 040米SDNN、rMSSD及LF显著降低(P<0.01),HF也显著降低(P<0.05)。由此可见,进入海拔2 800米ANS调节功能与进入海拔1856米相似,而进入海拔3040米交感神经和迷走神经活动显著减弱、自主神经调节功能显著降低,海拔3 000米左右可能是进入高海拔ANS调节功能发生显著变化的分水岭。

关键词：海拔自主神经系统功能

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从基础到临床——基于Junctophilin-2功能的心衰早期诊断、防治研究

从基础到临床——基于Junctophilin-2功能的心衰早期诊断、防治研...

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国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：徐明冯新恒许师明周鹏白燕白淑华陈宝霞李艳芳高炜张幼怡王世强北京大学第三医院血管医学研究所

心衰的早期诊断和早期治疗是战胜心衰的关键。但如何早期诊断和治疗心衰还是个很新的医学研究命题。目前心衰的早期诊断基于患者的主诉,诸如对运动的耐受性差等,对于缺乏心衰早期征象或症状的患者尚缺乏可靠的定性或定量的判断方法。大... 详细信息

心衰的早期诊断和早期治疗是战胜心衰的关键。但如何早期诊断和治疗心衰还是个很新的医学研究命题。目前心衰的早期诊断基于患者的主诉,诸如对运动的耐受性差等,对于缺乏心衰早期征象或症状的患者尚缺乏可靠的定性或定量的判断方法。大量实验表明,潜在的危险因素或潜在心脏的异常可能体现在细胞、分子水平上的功能异常和形态结构变化。是否能在心脏整体功能和形态结构出现明显异常之前,发现并确定细胞、亚细胞和分子水平的异常就显得尤为重要。junctophilin-2(JP2)是定位于心肌细胞横管和肌质网耦联区域的蛋白,我们的研究表明JP2的表达变化与心衰的严重程度密切相关,JP2的表达调控能够逆转心衰细胞耦联距离的变化,并加强横管和肌质网结构性耦联,从而增强L型钙通道与兰尼丁受体间的功能性耦联,并改善钙致钙释放分子祸联效率。那么我们的基础研究发现是否可以应用于心衰临床的早期诊断呢?近期,我们通过利用组织多普勒成像技术连续观测压力负荷诱导的大鼠心衰动物模型电信号传导与机械活动偶联时相随病程变化而改变,以及心衰患者临床病例回顾调查结果,提出可以利用组织多普勒技术进行心衰早期诊断的假设。由此,我们希望通过此种无创检测技术进行前瞻性临床研究,发现整体心衰早期征象,为心衰的早期诊断和防治提供科学依据。

关键词：心衰

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血管外周脂肪组织条件培养液诱导的外膜成纤维细胞的迁移与分化

血管外周脂肪组织条件培养液诱导的外膜成纤维细胞的迁移与分化

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国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：阮承超朱鼎良高平进上海交通大学医学院附属瑞金医院上海市高血压研究所

近期研究表明脂肪组织作为一内分泌器官,通过分泌多种脂肪细胞因子参与心血管功能的调节。然而,目前尚不清楚血管外周脂肪对血管外膜成纤维细胞的影响。本研究假设血管外膜成纤维细胞存在脂联素受体参与血管功能调节。于是我们检测了血... 详细信息

近期研究表明脂肪组织作为一内分泌器官,通过分泌多种脂肪细胞因子参与心血管功能的调节。然而,目前尚不清楚血管外周脂肪对血管外膜成纤维细胞的影响。本研究假设血管外膜成纤维细胞存在脂联素受体参与血管功能调节。于是我们检测了血管外周脂肪组织条件培养液(PVATCM)对大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞(AF)功能的调控是否通过脂联素受体。使用SD大鼠胸主动脉外膜培养AF细胞,第四第五代用于实验。分离胸主动脉外周血管脂肪组织在无血清DMEM培养液中培养48 h后用于实验。使用Transwell技术检测AF的迁移水平,使用Western blot技术检测蛋白表达水平。我们在mRNA和蛋白水平检测了成纤维细胞中脂联素及其受体的表达,发现AF表达脂联素受体(包括Adipo R和Adipo R2)而不表达脂联素,PVATCM能促进Adipo R1和Adipo R2的表达。进一步,我们发现PVATCM可时间依赖性的诱导成纤维细胞/肌成纤维细胞分化的标记蛋白α-SM-actin的表达,并能够刺激成纤维细胞的迁移作用。我们的研究还发现PVATCM通过促进ERK1/2和SAPK/JNK的磷酸化激活MAPK信号通路参与细胞功能的调控。干预脂联素受体能否影响成纤维细胞的功能尚在继续中。我们的研究表明血管外周脂肪组织条件培养液刺激外膜成纤维细胞的迁移并诱导α-SM-actin的表达,提示血管外周脂肪组织通过脂联素及其受体介导的信号通路调节外膜成纤维细胞的迁移和分化,参与血管外膜重塑。

关键词：脂肪组织条件培养液外膜成纤维细胞脂联素受体

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肌球蛋白轻链磷酸酶在猪肺动脉一氧化氮耐受形成中的作用

肌球蛋白轻链磷酸酶在猪肺动脉一氧化氮耐受形成中的作用

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国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：马慧娟窦豆郑晓旭秦雪綦惠武宇明高远生河北医科大学生理教研室

肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）在一氧化氮（NO）引起的血管平滑肌舒张中起着重要的作用,本研究的日的是明确MLCP在猪肺动脉NO耐受形成中的作用。采用成年猪肺动脉3-4级分支,在离体条件下给予NO或8-Br-cGMP孵育后,用离体血管环灌流的方法... 详细信息

肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）在一氧化氮（NO）引起的血管平滑肌舒张中起着重要的作用,本研究的日的是明确MLCP在猪肺动脉NO耐受形成中的作用。采用成年猪肺动脉3-4级分支,在离体条件下给予NO或8-Br-cGMP孵育后,用离体血管环灌流的方法检测血管张力,用Western blot的方法检测MLCP调节亚单位MYPT1及催化亚单位PPlcδ的蛋白表达。猪离体肺动脉经过NO(1×10 mol/L)孵育可以时间依赖地降低MLCP调节亚单位MYPT1;不同浓度NO(1×10 mol/L-1×10mol/L)孵育48 h后,可剂量依赖地抑制NO引起的血管舒张反应及含或不含亮氨酸拉链结构（LZ）的MYPT1的蛋白表达,对MLCP的催化亚单位PPlcδ没有显著影响。NO孵育引起的MYPT1蛋白表达可被与可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）阻断剂ODQ阻断。8-Br- cGMP(1×10 mol/L)孵育也可显著降低MYPT1蛋白表达并为环鸟苷酸依赖的蛋白激酶（PKG）阻断剂PKG-Ⅰ阻断。NO和8-Br-cGMP对MYPT1蛋白表达的作用可为蛋白酶体抑制剂MG-132(1×10 mol/L)阻断但不受蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX,1×10mol/L)影响。猪离体肺动脉NO长期孵育导致cGMP/PKG信号通路持续激活,进而影响MLCP的调节亚单位MYPT1的蛋白降解,导致MYPT1的蛋白表达显著降低,此机制可能参与了猪肺动脉NO耐受的形成。

关键词：磷酸酶一氧化氮耐受

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P19CL6细胞向心肌分化前后差异表达蛋白的分析与鉴定

P19CL6细胞向心肌分化前后差异表达蛋白的分析与鉴定

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国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：温见燕夏晴彭小忠中日友好医院心血管病研究室

本文探讨了P19CL6细胞在DMSO诱导前后差异表达的蛋白和可能作用。P19CL6细胞是小鼠胚胎性癌细胞P19衍生的细胞系,用含1%DMSO的培养基培养时,该细胞能高效的分化成搏动的心肌细胞:心肌特异性的转录因子如Nkx2-5、GATA-4和MEF2C表达上调,1... 详细信息

本文探讨了P19CL6细胞在DMSO诱导前后差异表达的蛋白和可能作用。P19CL6细胞是小鼠胚胎性癌细胞P19衍生的细胞系,用含1%DMSO的培养基培养时,该细胞能高效的分化成搏动的心肌细胞:心肌特异性的转录因子如Nkx2-5、GATA-4和MEF2C表达上调,10 d左右就可以观察到肌小节肌球蛋白重链的表达,P19CL6细胞是体外研究心肌细胞分化的良好模型。我们用蛋白质组学的方法寻找P19CL6细胞向心肌细胞分化前后差异表达的蛋白。通过对双向电泳银染的图谱进行比较,发现了17个差异表达的蛋白点,这些蛋白点在分化前后的差异均在1.5倍以上。经过基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析,最终鉴定出16个差异表达的蛋白点。其中,诱导分化后表达上调的有13个蛋白点,分化后表达下调的有3个蛋白点。对这些差异蛋白的分析结果表明,它们在分化过程中与能量代谢、信号传导、细胞骨架形成等有关。我们进一步选取Ybx-1蛋白进行了深入研究,用免疫组化法观察其在小鼠胚胎发育不同时期的分布,发现其在心脏有较高丰度的表达。以上结果提示:Ybx-1等心肌分化前后差异表达的蛋白在心脏发育过程中可能发挥重要作用,从而为我们深入研究DMSO诱导P19CL6细胞向心肌细胞定向分化的调控机制提供线索。

关键词： P19CL6 蛋白质组学心肌分化质谱

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自发性高血压大鼠持续给予intermedin可降低血压和改善心功能

自发性高血压大鼠持续给予intermedin可降低血压和改善心功能

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国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：曾强中国人民解放军总医院健康体检中心

本文旨在观察外源性给予intermedin（IMD/ADM2）对自发性高血压大鼠的血压和心功能的影响以及对intermedin受体系统的改变,并探讨其可能机制。将24只13周龄雄性自发性高血压大鼠随机分为对照组（n=8）、肾上腺髓质素（ADM）组（n=8）及... 详细信息

本文旨在观察外源性给予intermedin（IMD/ADM2）对自发性高血压大鼠的血压和心功能的影响以及对intermedin受体系统的改变,并探讨其可能机制。将24只13周龄雄性自发性高血压大鼠随机分为对照组（n=8）、肾上腺髓质素（ADM）组（n=8）及IMD组（n=8）。通过微量渗透泵皮下持续给予ADM和IMD,剂量均为每小时500 ng/kg。埋泵两周后,采用心室导管的方法测定血压和心功能的变化;RT-PCR方法测定组织中脑钠素（BNP）、心钠素（ANP）、IMD的受体系统——降钙素受体样受体（calcitonin receptor-like receptor,CRLR）和受体活性修饰蛋白（receptor activity-modifying proteins,RAMPs）的mRNA表达。Western blot方法测定组织中IMD/ADM2的受体——CRLR和RAMPs的蛋白含量。采用放射免疫分析的方法测定组织中cAMP含量。通过微量渗透泵小剂量持续给予每小时500 ng/kg IMD两周后,可显著降低收缩压,+LVdP/dt,LVSP和心率。同时,抑制组织中蛋白含量的过度表达——心肌中RAMP1,RAMP2和主动脉中的RAMP1,RAMP2,RAMP3和CRLR;限制组织中基因水平的过度上调——主动脉的RAMP1,RAMP2,RAMP3和CRLR。而心肌中CRLR的mRNA表达和蛋白含量以及心肌中的ANP和BNP的基因表达均显著升高。同时,给予IMD后,能显著提高主动脉中cAMP含量。IMD作为心血管的活性肽,在血压调节和心功能保护上具有重要的作用,其机制或许是非特异的通过与其受体系统RAMPs和CRLR构成的受体表型相结合后,调节cAMP水平的变化,以及对体内其他心血管活性因子,如ANP和BNP的调节共同实现的。

关键词： intermedin 微量渗透泵自发性高血压大鼠

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AMI大鼠血清细胞因子MIF和TNF-α的变化及其与LVEDP的相关性

AMI大鼠血清细胞因子MIF和TNF-α的变化及其与LVEDP的相关性

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国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：林秋雄符永恒单志新杨敏黄晓忠李晓红林曙光余细勇广东省人民医院医学研究中心广东省心血管病研究所

心肌梗死后出现大量心肌细胞坏死和凋亡,心肌组织中的急、慢性炎症反应相继发生,但其确切机制仍不明了,本文拟探讨急性心肌梗死(AMI)大鼠血清巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)与LVEDP的相关性。将40只雄性SD大鼠随机分... 详细信息

心肌梗死后出现大量心肌细胞坏死和凋亡,心肌组织中的急、慢性炎症反应相继发生,但其确切机制仍不明了,本文拟探讨急性心肌梗死(AMI)大鼠血清巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)与LVEDP的相关性。将40只雄性SD大鼠随机分为对照组(20只)、实验组(20只)。实验组采用手术结扎冠脉左前降支,根据肉眼直观左室心肌变紫变暗和手术前后心电图ST段明显出现弓背向上、曲线变宽确定成功构建心肌梗死SD大鼠模型,对照组只过线不结扎。8周后进行心脏采血4 mL于肝素钠抗凝管中,迅速分离血浆后置于-70℃保存。收集标本后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)按试剂盒说明书分别检测大鼠血清MIF和TNF-α水平;同时进行左室舒张末压(LVEDP)测定,大于15 mmHg为达到心力衰竭诊断标准。分别以结扎后实验组大鼠血清中MIF和TNF-α浓度为自变量,LVEDP为因变量进行直线回归与相关分析。实验组大鼠血清MIF和TNF-α浓度均高于对照组(P<0.01),实验组大鼠的LVEDP明显高于对照组,其差别均有显著性(P<0.01);大鼠血清MIF和TNF-α浓度与LVEDP呈显著正相关(r分别为0.637,0.816,均P<0.01)。AMI后大鼠血清MIF和TNF-α浓度异常升高,心力衰竭越严重升高越明显,且MIF和TNF-α水平与LVEDP呈正相关,提示血清MIF和TNF-α浓度可作为判断CHF严重程度和预后的指标,并可能参与了AMI后心衰的病理生理学发展过程。

关键词：心肌梗死促炎因子心功能

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Mipul对氧化应激所致H9C2细胞凋亡的影响及其机制的研究

Mipul对氧化应激所致H9C2细胞凋亡的影响及其机制的研究

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国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：王桂良中南大学湘雅医学院病理生理学系

Mipul是我室发现的心脏缺血预适应时表达上调的新基因。近年研究发现Mipul蛋白是一C2H2型锌指蛋白核转录因子。观察Mipul过表达对H9C2大鼠心肌细胞凋亡的影响,为进一步探讨其功能提供线索和思路。方法:将Mipul克隆至pcDNA3.1真核表达质... 详细信息

Mipul是我室发现的心脏缺血预适应时表达上调的新基因。近年研究发现Mipul蛋白是一C2H2型锌指蛋白核转录因子。观察Mipul过表达对H9C2大鼠心肌细胞凋亡的影响,为进一步探讨其功能提供线索和思路。方法:将Mipul克隆至pcDNA3.1真核表达质粒,通过脂质体将重组质粒导入H9C2大鼠心肌细胞中,经G418筛选阳性克隆,Western blot鉴定高表达克隆,采用HO（0.5 mmol/L）处理Mipul过表达的H9C2细胞,采用流式细胞术、Hoechst 33258染色检测细胞凋亡;采用Western blot检测凋亡相关蛋白bax,fas,bcl-2的表达。结果显示,H9C2细胞经HO刺激之后,Mipul,bax,fas,bcl-2的表达均明显升高;Mipu1过表达使促凋亡基因bax及fas蛋白的基础表达和HO所致诱导表达都显著降低;而使抗凋亡蛋白bcl-2蛋白的基础表达和HO所致的诱导表达都升高;双荧光素酶报道系统检测发现Mipul过表达能抑制正常H9C2心肌细胞及HO刺激的H9C2心肌细胞中促凋亡基因bax及fas基因启动子的转录活性,但促进正常H9C2心肌细胞及经HO刺激的H9C2心肌细胞中bcl-2基因启动子的转录活性。结论Mipul在HO刺激的H9C2心肌细胞表达增加;Mipul通过与促凋亡基因bax及fas启动子区结合元件结合而抑制bax及fas基因的表达,并通过与抗凋亡基因bcl-2启动子区结合元件结合促进bcl-2基因的表达,从而抑制氧化应激所致的心肌细胞凋亡。

关键词： Mipul 细胞凋亡

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SIRT1对TNFα诱导的RAGE表达的影响

SIRT1对TNFα诱导的RAGE表达的影响

引用

国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议

作者：张慧娜鲁云彪刘德培中国医学科学院/中国协和医科大学基础医学研究所分子生物学国家重点实验室

糖尿病导致心血管系统各种疾患的易感性增强,如冠心病、高血压等都会随着糖尿病的加重而更加严重。糖尿病所致的各种损伤细胞的通路中终末糖基化产物(AGE)及其受体(RAGE)通路的激活会导致血管内皮细胞ROS增高,炎性反应加重。有报道用RAG... 详细信息

糖尿病导致心血管系统各种疾患的易感性增强,如冠心病、高血压等都会随着糖尿病的加重而更加严重。糖尿病所致的各种损伤细胞的通路中终末糖基化产物(AGE)及其受体(RAGE)通路的激活会导致血管内皮细胞ROS增高,炎性反应加重。有报道用RAGE的抗体或可溶性RAGE(sRAGE)与RAGE结合,竞争性抑制这条通路可以减少动脉粥样硬化斑块的产生。三类去乙酰化酶SIRT1有抗炎、抗凋亡的作用,本研究的日的是考察在人原代血管内皮细胞(HUVECs)中SIRT1对TNFα诱导的RAGE表达的影响。我们用表达野生型SIRT1的腺病毒感染HUVECs,再用TNFα处理后,通过RT-PCR和Western blot技术,观察到SIRT1可以降低TNFα诱导下RAGE的表达,而感染SIRT1干扰的腺病毒及用SIRT1的抑制剂sirtinol处理后会得到相反的结果。荧光素酶报告系统检测分析也显示SIRT1可以降低RAGE-promoter介导的荧光素酶活性,而突变RAGE启动子区的NF-κB结合位点后这种效应减弱,考虑到SIRT1可以通过去乙酰化NF-κB的亚基P65来影响NF-κB的活性,我们用chip实验证实SIRT1可以结合到RAGE启动子区NF-κB的结合元件处。通过CO-IP和IP检测发现在内皮细胞中SIRT1的确可以和P65作用,并且去乙酰化P65。证明SIRT1通过抑制NF-κB活性米降低HUVECs中RAGE的表达。

关键词： SIRT1 RAGE TNFα

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